Les méthodes de mesures de capacité cellulaires attaché à la souris surrénales chromaffines cellule

Summary

Après l’exocytose, la membrane plasmique fusionnée est récupérée par un processus connu sous le nom d’endocytose. Ce mécanisme reforme les nouvelles vésicules synaptiques pour le prochain cycle de libération. Les événements endocytaires individuels sont capturés et analysés à l’aide des enregistrements de capacité attachés aux cellules dans les cellules de chromaffine surrénale de souris.

Abstract

La transmission neuronale fait partie intégrante de la communication cellulaire au sein du cerveau. La dépolarisation de la membrane présynaptique conduit à une fusion vésiculaire connue sous le nom d’exocytose qui médie la transmission synaptique. La récupération ultérieure des vésicules synaptiques est nécessaire pour générer de nouvelles vésicules remplies de neurotransmetteurs dans un processus identifié comme l’endocytose. Au cours de l’exocytose, la fusion des membranes vésiculaires entraînera une augmentation de la surface et l’endocytose ultérieure entraînera une diminution de la surface. Ici, notre laboratoire fait la démonstration d’une introduction de base à l’enregistrement de la capacité attachée aux cellules d’événements endocytaires uniques dans la cellule de chromaffine surrénale de souris. Ce type d’enregistrement électrique est utile pour les enregistrements à haute résolution de l’exocytose et de l’endocytose au niveau de la vésicule unique. Bien que cette technique puisse détecter à la fois l’exocytose et l’endocytose des vésicules, notre laboratoire se concentre sur l’endocytose des vésicules. De plus, cette technique nous permet d’analyser la cinétique d’événements endocytaires uniques. Ici, les méthodes de dissection de tissu de la glande surrénale de souris, la culture de cellules de chromaffine, les techniques de base attachées aux cellules et des exemples ultérieurs de traces individuelles mesurant un événement endocytaire singulier sont décrites.

Introduction

La transmission synaptique est médiée par exocytose des vésicules synaptiques contenant neurotransmetteurs, et ces vésicules doit subir recyclage d'endocytose locale dans la terminaison nerveuse de maintenir la communication neuronale dans le long terme. Compte tenu du rôle essentiel de la transmission synaptique dans le cerveau, la compréhension de la machinerie moléculaire qui constitue le cycle de la vésicule synaptique est un fondement essentiel pour une meilleure compréhension dans la communication cellulaire dans son ensemble. Parmi les systèmes de modèles de cellule, la cellule chromaffine surrénale a fourni une partie de la vision la plus définitive dans ....

Protocol

NOTE: L'ensemble de la procédure a été menée conformément aux lignes directrices des Instituts nationaux de la santé, tel qu'approuvé par le soin et l'utilisation des animaux Comité de l'Université de l'Illinois à Chicago.

1. Solutions et milieux de culture préparatifs

1. Gardez toutes les solutions à -20 ° C pendant jusqu'à six mois. Gardez les milieux de culture à 4 ° C pendant 3 mois.
2. Préparer 100 ml de milieu de culture en mélangeant 1 ml de solution de pen-strep et 1 ml de ITSX (insuline-transferrine-sélénium-supplémentation) à 100 ml avec du milieu DMEM.
3. Préparer la solution enzyma....

Results

La viabilité cellulaire et la qualité de l'étanchéité de gigaohm sont critiques dans la détermination de la qualité des enregistrements de capacité cell-attached. Par conséquent, il est essentiel de se procurer une culture cellulaire et efficace avant les enregistrements électrophysiologiques, et les cellules viables typiques sont illustrés dans la Figure 1. Pratique et l'heure vous seront utiles dans la réalisation d'un joint de gigaohm de haute qualité. Si l'on peut voir clairement la déformation de l.......

Discussion

Mesure de la capacité de cellules attachée nécessitent plusieurs étapes critiques afin d'obtenir avec succès des enregistrements de haute qualité: 1) les cellules viables et sains préparés à partir des glandes surrénales; 2) PDL revêtement des lamelles couvre-objet; 3) la formation de joint de gigaohm; 4) le niveau de bruit du système; et 5) de correction de phase.

Pour la chirurgie des animaux, des modifications, on peut éventuellement faire est d'ajuster l'approche chirurgicale.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-D-Lysine	Sigma	P0899
DMEM		15066024	Tenir à l’abri des UV
Dulbecco' s Eagle Medium	Life Technologies
Cover Glass	Carolina Biological	633029	12 mm
Pénicilline Streptomycine Life	Technologies	15140122	100 ml
Insulin-Trans-Sel-X	Life Technologies	51500056	Décongeler uniquement sur ICE !
Papain	Worthington	39S11614
EPC-7 plus amplificateur de patch	HEKA
BNC-2090 carte d’acquisition de données	National Instruments
Logiciel d’acquisition de données Igor	Wavemetrics
P-97 extracteur de pipettes	Sutter Instruments
Microforge	Scientific Instruments
Capillaires en verre borosilicaté	Sutter Instruments	B150-110-10	Diamètre extérieur : 1,5 mm Diamètre intérieur : 1,10 mm Longueur : 10 cm