Multi-photon intracellulaire Imaging sodium Combiné avec uncaging focale médiation-UV de glutamate dans CA1 pyramidale neurones

Résumé

Nous décrivons la combinaison de l'effet des UV focal photo-activation de composés neuro-actif avec la cellule entière de patch-clamp et de l'imagerie multi-photons de transitoires de sodium intracellulaire dans les dendrites et les épines de neurones de l'hippocampe dans les tranches de tissu aiguë du cerveau de la souris.

Résumé

Multi-photon microscopie à fluorescence a permis l'analyse de paramètres morphologiques et physiologiques des cellules du cerveau dans du tissu intact avec une résolution spatiale et temporelle élevée. Combiné avec l'électrophysiologie, il est largement utilisé pour étudier signaux calciques liées à l'activité dans de petits compartiments sous-cellulaires tels que des dendrites et des épines dendritiques. En plus des transitoires calciques, l'activité synaptique induit également des signaux de sodium post-synaptiques, dont les propriétés ne sont que peu compris. Ici, nous décrivons un procédé de cellule entière de patch-clamp et de l'image combinée sodium multi-photons dans les domaines de la micro-cellulaires des neurones centraux. En outre, on introduit une procédure modifiée de l'ultra-violet (UV) uncaging -light induite par du glutamate, qui permet une activation fiable et focale des récepteurs du glutamate dans le tissu. A cet effet, des enregistrements de cellules entières ont été effectués sur une subdivision corne d'Ammon (CA1) des neurones pyramidaux dans des coupes tissulaires aiguës de l'hippocampe de souris. Les neurones ont été remplis avec le colorant fluorescent SBFI sensible du sodium à travers le patch-pipette, et multi-photon excitation de SBFI permis la visualisation des dendrites et des épines adjacentes. Pour établir uncaging focal induite par les UV, de plusieurs paramètres, y compris l'intensité de la lumière, le volume affecté par le faisceau de uncaging UV, le positionnement de la poutre ainsi que la concentration du composé en cage ont été testés et optimisés. Nos résultats montrent que la perfusion locale avec le glutamate cage (INM-glutamate) et son résultat uncaging-UV focal courants entrants et les transitoires de sodium dans les dendrites et des épines. Evolution dans le temps et l'amplitude des deux courants entrants et des signaux de sodium sont en corrélation avec la durée de l'impulsion uncaging. De plus, nos résultats montrent que les signaux de sodium intracellulaires sont bloquées, en présence d'inhibiteurs de récepteurs ionotropiques du glutamate, ce qui montre qu'ils sont médiés par l'influx de sodium bien que cette voie. En résumé, notre méthode fournit un outil fiable pour larecherche de signaux de sodium intracellulaires induits par l'activation du récepteur correspondant dans le tissu cérébral intact.

Introduction

Les améliorations récentes des techniques de microscopie optique telles que la microscopie multi-photons ont permis l'étude des paramètres morphologiques et physiologiques de cellules du cerveau dans le tissu intact avec une résolution spatiale et temporelle. Combiné avec l'électrophysiologie, ces techniques sont aujourd'hui largement utilisés pour analyser les signaux électriques liés à l'activité de neurones ainsi que des signaux de calcium concomitants dans de petits compartiments sous-cellulaires, à savoir dans les dendrites fines et épines dendritiques. En plus de transitoires de calcium, l'activité synaptique induit également des signaux de sodium dans les dendrites et des épines, dont les propriétés sont en grande partie inexploré. De tels signaux peuvent être analysés par imagerie à deux photons de sodium intracellulaire ([Na ^+] _i) qui permet la mesure en ligne de la [Na ^+] _i transitoires pendant des périodes prolongées sans décoloration significative de colorant ou photo-endommagement ^1,2.

Pour l'imagerie de _i [Na ^+] , à seulement quelques colorants indicateurs chimiques sont disponibles, par exemple Corona vert ou Asante Natrium vert ^3,4. La sonde fluorescente le plus couramment utilisé pour Na ⁺ est de l'isophtalate de benzofurane imagerie (SBFI) de liaison du sodium. C'est un quotientométrique, excité-UV colorant similaire à la célèbre colorant sensible au calcium fura-2 et a été utilisé pour l'imagerie conventionnelle Na ⁺ dans de nombreux types de cellules (par exemple ^5,6). Il existe différentes possibilités d'exciter le colorant et la perception de sa fluorescence. Si une haute résolution temporelle (ie un taux de rafraîchissement élevé d'imagerie) est nécessaire en combinaison avec l'information spatiale, SBFI peut être excité par une lampe à arc au xénon ou une diode (LED) dispositif émettant de la lumière de forte puissance et son émission détectée avec une charge à haute vitesse dispositif -coupled (CCD) ^{de 7,8.} Pour une résolution spatiale maximale en profondeur dans le tissu, la microscopie à balayage laser multi-photonique est la méthode de choix ^9. La relativement faible véhicu quantiquence de SBFI nécessite des concentrations relativement élevées de colorant (0,5 à 2 mm), et un chargement direct de la forme de SBFI membrane imperméable par une forte microélectrodes ¹⁰ ou la pipette en patch ^1.

Utilisation SBFI, des travaux antérieurs effectués dans des tranches de tissu aigus de l'hippocampe de rongeurs démontré transitoires de sodium liées à l'activité dans les dendrites et les épines des neurones pyramidaux CA1 qui sont principalement causées par des afflux de sodium par ionotropique récepteurs NMDA ^1,2. Pour l'étude des propriétés de ces signaux locaux de sodium de façon plus détaillée, l'activation spécifique des récepteurs post-synaptiques par application d'agonistes du récepteur est un procédé bien adapté de choix. Pour imiter l'activité présynaptique et la libération du transmetteur, l'application devrait être relativement brève et ciblée pour permettre la stimulation locale. Ceci, toutefois, se révèle être très difficile dans le tissu intact. Application d'une pression locale d'agonistes des récepteurs à l'aide d'une pipette à pointe fine permet ap très focalplication, mais accueille le risque potentiel pour produire le mouvement de la structure d'intérêt (par exemple, comme une dendrite ou épines dendritiques), et donc empêche l'imagerie haute résolution. La pertinence de l'ionophorèse de substances neuro-actif dépend de leurs propriétés électriques et amplitudes de courant élevées peut produire des artefacts cellulaires ainsi.

Une façon de contourner ces obstacles est l'emploi des composés photo-actif et leur photolyse flash. Fondamentalement, deux principes différents sont utilisés pour la photo-activation des substances en cage: I) grand champ photolyse éclair ¹¹ et II) uncaging focale utilisant des modules de balayage en combinaison avec des lasers ^12. Bien que grand champ photolyse éclair est utilisé pour activer les grandes régions d'intérêt, par exemple une cellule entière, uncaging focal est utilisé pour stimuler spécifiquement les petits compartiments cellulaires. Dans la présente étude, nous démontrons une procédure de cellules entières de patch-clamp et multi-pimagerie de sodium dans Hoton dendrites et des épines de neurones centraux, combinée à une procédure modifiée pour uncaging induite à la lumière UV-de glutamate, ce qui permet l'activation et fiable focal des récepteurs du glutamate dans le tissu.

Protocole

Cette étude a été réalisée en stricte conformité avec les directives institutionnelles de l'Université Heinrich Heine de Düsseldorf, en Allemagne, ainsi que la directive européenne Conseil de la Communauté (86/609 / CEE). Toutes les expériences ont été communiquées et approuvées par le bureau de la protection des animaux à l'établissement de soins et d'utilisation des animaux de l'Université Heinrich Heine de Düsseldorf, Allemagne (numéro de loi organique: O52 / 05). Conformément à la Loi sur la protection des animaux allemand (Tierschutzgesetz, les articles 4 et 7), aucune approbation formelle supplémentaire pour l'enlèvement post-mortem du tissu cérébral était nécessaire.

Pour la production de tranches aiguës, les souris ont été anesthésiés avec du CO ₂ et rapidement décapité (suite à la recommandation de la Commission européenne publié en: euthanasie des animaux de laboratoire, Luxembourg: Office des publications officielles des Communautés européennes, 1997; ISBN 92-827-9694 -9).

1 Préparation d'Solutions

1. Préparation liquide artificiel céphalo-rachidien (ACSF) pour la dissection contenant (en mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 _CaCl2, 6 _MgCl2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 26 NaHCO _3, et 20 le glucose, le barbotage avec 95% d'O ₂ et 5% de CO _2, ce qui entraîne un pH de 7,4.
2. Préparation pour les expériences ACSF contenant (en mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, CaCl 2 _2, MgCl ₂ 1, 1,25 NaH ₂ PO _4, NaHCO ₃ 26, glucose et 20, fait barboter avec 95% O ₂ et 5% de CO2, ce qui entraîne à un pH de 7,4.
3. Préparer la solution intracellulaire (ICS) contenant (en mM): 150 KMeSO _3, 12,5 hydroxy pipérazine éthylique de l'acide éthane-sulfonique (HEPES), 40 de KCl, 5 NaCl, 1,25 acide éthylène glycol-tétracétique (EGTA), 5 Mg-ATP, 0,5 Na GTP. Ajuster le pH à 7,3. aliquotes de magasins de 1 ml à -20 ° C.
4. Diluer isophthalate benzofurane liaison sodium (SBFI) -salt dans de l'eau distillée deux fois et préparer des aliquotes de 5 pid'une solution mère à 10 mM.
5. ICS dégel et ajouter SBFI solution mère à une concentration finale de 1 mM. Vortex et micro-filtrat (0,22 um). Conserver à 4 ° C jusqu'à son utilisation dans l'expérience. Ne pas recongeler et utiliser que pour un jour.
6. Préparer INM glutamate solution stock de 50 mM en dissolvant le composé dans l'eau bidistillée. Diluer INM glutamate solution mère à une concentration finale de 5 mM dans ACSF normale. Conserver à 4 ° C jusqu'à son utilisation dans l'expérience. Ne pas recongeler et utiliser que pour un jour. aliquotes de magasin, qui ne sont pas immédiatement utilisés dans l'expérience, à -20 ° C.

2. dissection de tissus

REMARQUE: La préparation des coupes d'hippocampe aiguë du cerveau de rongeurs a été décrit en détail plus haut ^{de 13,14.} En bref, le protocole suivant a été utilisé dans la présente étude.

1. Après décapitation, retirez rapidement le cerveau du crâne.
2. Immédiatement placer le cerveau dans une boîte de Pétriavec de la glace froide dissection ACSF et disséquer un hémisphère en effectuant une coupe sagittale le long de la ligne médiane.
3. Effectuer une deuxième coupe dans l'orientation souhaitée en tant que surface de blocage et de le joindre à l'étape de coupe d'un vibratome avec de la colle.
4. Prenez chambre de coupe et élément de refroidissement (à la fois maintenue à -20 ° C) de la vibratome sur la scène du congélateur et le lieu de coupe à l'article du cerveau dans la chambre. Ensuite, mettre élément de refroidissement dans la chambre et plonger le tissu dans glacée dissection ACSF. Afin de stabiliser la préparation, on peut vouloir contrer le bloc de tissu avec un gel d'agar.
5. Couper 250 um d'épaisseur, tranches parasagittales de l'hippocampe avec le vibratome. Assurez-vous que tous les fluides ACS barboter à tout moment.
6. Après découpage, garder le tissu sur un maillage dans un bécher avec l'ACSF normale et incuber à 34 ° C pendant 30 min. Puis garder à la température ambiante.

3 Préparation du matériel

Figure 1: Schéma montrant les chemins de lumière et un contrôle expérimental de la plate-forme constituée de l'imagerie multi-photonique, laser à balayage UV photolyse flash, et ​​l'électrophysiologie. Le faisceau multi-photons (rouge) est produite par un, infrarouge (IR) laser accordable pulsé (TiSa). Il passe d'un obturateur mécanique, la cellule de Pockels une, et le détecteur IR (détection de l'intensité du faisceau), qui permettent le contrôle de la puissance du laser et la durée d'administration. L'/ diode laser à bascule flip-out en option est utilisé pour un alignement de base du faisceau laser. L'élargisseur de faisceau peut être utilisé en combinaison avec les objectifs d'un plan extrêmement large arrière-focal. La roue porte-filtres ND télécommandé peut être utilisé en plus ou à la place de la cellule de Pockels pour commander la puissance du faisceau laser. Après avoir passé la tête de balayage, la lumière infrarouge pulsée est guidé à l'échantillon. ÉmettreTed lumière de fluorescence (vert clair) ont été recueillis soit par l'extérieur ou les détecteurs photomultiplicateurs internes (PMT). Les détecteurs externes sont parfaitement synchronisées avec les PMT internes via un commutateur à haute fréquence (régulateur de PMT). Le faisceau uncaging (bleu clair) est produite par un laser à l'état solide UV (UV-Laser DPSS). Il est alors dirigé vers l'unité de balayage conduit galvanomètre-en haut-retour du condenseur épifluorescence par un guide de lumière. Le positionnement précis (de l'aberration chromatique entre l'imagerie et de la poutre uncaging) de la tache uncaging ou une zone est activée par l'exportation d'image à partir du logiciel d'imagerie. La gestion de synchronisation pour la synchronisation de l'imagerie, l'électrophysiologie et la photolyse flash est contrôlée électroniquement. Le détecteur de transillumination (TL-PMT) est nécessaire pour la documentation de la position de la pipette à l'intérieur du tissu. Les unités de contrôle et les logiciels du système d'imagerie, qui a été modifié, est utilisé pour contrôler et synchroniser tous les autres appareilsnécessaire pour faire fonctionner le système. Les composants du système étiquetés comme «coutume» a été conçu et construit / adapté par les auteurs. Certains composants ont été adaptés pour répondre aux exigences du système multi-photons coutume-construction et sont étiquetés comme "modifié". S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

1. Allumez les composants du système multi-photons. Tester et régler l'alignement du faisceau laser infrarouge.
   1. Contrôle le positionnement du faisceau en faisant basculer dans le prisme de centrage à la place d'un objectif. Si le faisceau est disloquée, réajuster par les miroirs dans le périscope. A noter que le plan de centrage du prisme doit se trouver au même niveau que le plan focal arrière de l'objectif tout en imagerie.
   2. Allumez le spectromètre et vérifier les caractéristiques multi-photons du faisceau.
   3. Réglez les paramètres du logiciel d'imagerie pour les valeurs suivantes: Choisissezune taille d'image de 512 x 512 pixels pour les images Présentation de la cellule (boîtes de clips plus petits avec un facteur de zoom de 2,5 pour le taux d'images élevé et une résolution spatiale élevée, respectivement). Réglez la vitesse d'imagerie en mode rapide et le mode de balayage à XYT. Z-stepping devrait être de 1 um pour piles aperçu et 0,2 um pour piles détaillées compatibles avec les impératifs d'échantillonnage spatial pour déconvolution réalisée plus tard.
2. Réglez multi-photons faisceau laser (790 nm) intensité en modifiant les paramètres de la cellule de Pockels (puissance finale dans l'objectif: ≈ 14 - 16 uW) et les photomultiplicateurs (PMT).
3. Allumer et calibrer système uncaging en plaçant une diapositive échantillon fluorescent sous l'objectif.
   1. En utilisant les jumelles, régler la netteté de l'optique UV et limiter spatialement le spot laser UV pour une taille de 2 m de diamètre au maximum en utilisant l'unité de focalisation à la tête de balayage UGA.
   2. Commencez la procédure d'étalonnage de la uncaging softwar contrôle de l'unitée.
      1. Régler le laser UV à plusieurs points au sein de sa plage de balayage, alors que la fluorescence est capturée par une caméra CCD. En cliquant sur le spot laser UV à chaque point, ajuster le positionnement des miroirs de balayage galvaniques pour correspondre à une certaine coordination dans le logiciel.

Figure 2: schéma détaillé illustrant les caractéristiques d'excitation, l'émission et les chemins de faisceaux uncaging. Le faisceau d'excitation infrarouge (rouge) passe le faisceau combinant miroir dichroïque au niveau de la tourelle de déposant dans le condenseur d'épi-fluorescence du microscope et l'objectif de atteindre le spécimen. Le faisceau uncaging (bleu) est livré via une lumière fibre optique quartz à la collimation et faisceau unité de focalisation et ensuite guidé vers les mi de numérisationrrors dans l'unité de balayage, un miroir dichroïque passe pour combiner le faisceau miroir dichroïque. Ici, il est combiné avec un faisceau de balayage d'excitation. La lumière émise par l'échantillon suit le chemin de la trajectoire du faisceau de balayage d'excitation dans le sens opposé à la tête de balayage d'imagerie. L'appareil est utilisé pour le contrôle visuel de la pipette de patch et pour le positionnement du faisceau uncaging en combinaison avec le microscope confocal à balayage laser microscope (non représenté). Le chemin de la lumière verte représente un éclairage à épifluorescence en option qui peut être utilisé avec d'autres applications.

3. 2. 2. Utilisez le système flash photolyse en mode point à gagner applications focaux. Assurez-vous que le réglage de focalisation du faisceau uncaging (puissance moyenne en dessous de l'objectif: 0,55 mW) se traduit par une taille de spot de 1,5 m de diamètre (extension xy) comme l'a révélé à une diapositive fluorescent positionné à un niveau z qui correspond à celle de un tissutranche (non représenté).
   3. Le positionnement précis de l'endroit uncaging est obtenue par l'importation d'une image du système de formation d'image par l'intermédiaire d'une connexion réseau entre l'imagerie et uncaging--ordinateurs.
      1. En utilisant un logiciel d'acquisition d'images à l'écran, lire en continu les images du logiciel d'imagerie (au lieu de l'alimentation de la caméra) et ajuster les imagerie et uncaging cadres congruente. Exporter tous les 10 ^ième trame à partir du logiciel d'imagerie comme une image de référence dans l'unité de flash pour assurer un réglage correct pendant toute l'expérience.

Figure 3 Ajustement de la place uncaging: Pour positionner précisément l'endroit uncaging, une capture d'écran du logiciel d'imagerie (cadre jaune) est importé dans le logiciel uncaging (cadre vert). Leimage de gauche dans le cadre jaune représente une image Salut-Lo codé (bleu: pixels noirs, rouge: saturé pixels) de l'ensemble de la cellule CA1 pyramidale. L'image est recouverte par la grille d'étalonnage du logiciel uncaging (vert "x" s). A droite, une partie agrandie de la cellule est représenté avec la place uncaging superposée (croix rouge). La tache jaune est l'image superposée automatiquement du faisceau uncaging. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

4. Allumer micromanipulateurs, des composants d'électrophysiologie, et dispositif d'application de pression pour la délivrance du composé en cage à la région cible.
5. Installer un dispositif d'application de pression de contact pour perfusion locale de composés en cage. Cela réduit énormément les coûts par rapport à bain perfusion de ces substances. Ajuster la pression de maintien à la pression atmosphérique donnée pour empêcher une traînée de courant alternatifSF dans ou une fuite de substances cage de la pipette d'application.
   Remarque: le dispositif d'application de pression héberge un micro-valve de haute précision et ultra-rapide dans le support de pipette. Cela permet d'utiliser des pressions d'application minimale et permet de réduire les artefacts de mouvement à un minimum pendant la perfusion locale avec le composé encagé donc.
6. Tirer des pipettes pour la cellule entière patch-clamp et perfusion locale à l'aide de capillaires en verre borosilicate polies au feu. Pipettes doivent avoir un diamètre de pointe de ~ 1 pm et une résistance de R ≈ 3 mW (valeurs déterminées avec _K-3 à base MeSO ICS).
7. Lieu tranche dans le bain expérimentale et fixer à l'aide d'une grille (cadre en platine 250 um d'épaisseur, ont couvert avec des filaments chirurgicaux, od 40 um) (figure 4A, B). Utilisez une, pointe-cassé, et pipette Pasteur polie au feu (aspiration balle sur le côté de la pointe cassée) inversé pour le transfert de tranche. Evitez de plier et de tout autre traitement dure de la tranche.

Figure 4: Composants du bain expérimental et le positionnement de la baignoire à la platine du microscope. (A) Le bain expérimental est constitué de la chambre de bain lui-même (carré bleu), qui est entouré par un anneau de métal magnétique. Le tube assure perfusion continue de la salle de bain avec une solution saline (ACSF). La grille pour maintenir vers le bas et fixer la tranche est mise dans la chambre de bain (B). Aiguë préparation de la tranche placée dans la chambre de bain. La tranche est fixé par les fils de la grille (C). Positionnement et de la géométrie du bain expérimental de la platine du microscope au cours des expériences.

8. Passer bain à la platine du microscope et perfuser de façon permanente avec l'ACSF tranche.

4 cellules entières Patch-serrage

1. Charge la pipette en patch avec ICS contenant SBFI et charger pipette de perfusion locale avec le composé en cage. Fixez pipettes à micromanipulateurs correspondant. Placez l'électrode de référence dans le bain. Assurez-vous que vous êtes à la terre en permanence pour éviter d'endommager la scène de la tête (cf figure 4C).
2. Abaissez les deux pipettes dans le bain et les placer au-dessus de la région hippocampique CA1. Appliquez une légère pression à la pipette en patch (40 mbar) afin d'éviter la dilution de l'ICS avec ACSF.
3. Compenser le potentiel de décalage de la pipette de patch en utilisant le logiciel d'électrophysiologie.
4. Approche d'une cellule CA1 pyramidale avec le patch pipette employant vidéo microscopie IR-DIC. Appliquer une aspiration douce jusqu'à un Giga-étanchéité est obtenue. Choisir une cellule de la soma, qui est situé 30 -70 um en dessous de la surface de la tranche afin d'assurer la morphologie des cellules intactes sur le côté de la main et une faible dispersion et l'atténuation du faisceau uncaging sur le côté de l'autre main.
5. Compenser la capacité rapide. Pause Membranee et cellules ouvertes d'acquérir configuration cellule entière.
6. Compenser la capacité lente et la résistance série.
7. Laisser la cellule à dialyse avec les SbA-ICS pendant au moins 30 min avant de commencer les expériences d'imagerie.

5. imagerie multi-photonique et la stimulation

Figure 5 du protocole expérimental. Pour initialiser une expérience, une impulsion de déclenchement (indiqué par un panneau rouge (ᴨ) et la ligne rouge) est configuré pour démarrer simultanément l'imagerie (bleu), l'électrophysiologie (vert), et l'administration de l'en cage composé (jaune) à l'instant 0 sec. Durant cette première période, le faisceau d'imagerie doit être entièrement estompée (bleu clair). Après 4,5 secondes (en pointillés), la perfusion locale du composé encagé est terminée et le faisceau de formation d'image doit être réglé sur son traintensité de roi pour l'acquisition de données (en bleu). 1,5 sec après (temps point 6 sec), une seconde impulsion de déclenchement est donné (indiqué par un panneau rouge (ᴨ) et la ligne rouge), qui initialise le flash UV (durée du flash: 300 ms; indiqué par le flash jaune ) et définit des marqueurs dans la électrophysiologie et le protocole d'imagerie.

1. Ajouter la tétrodotoxine (TTX, 500 nM) de l'ACSF pour empêcher l'activation des canaux sodiques voltage-dépendants et la génération de potentiels d'action.
2. Visualiser la morphologie cellulaire en utilisant multi-photon excitation et de fluorescence résultant SBFI et choisissez une dendrite épineux pour l'expérience. Zoomez pour les images à une résolution plus élevée et placer un clip autour de la dendrite.
3. Remplir une pipette de patch standard avec ACSF 10 ul contenant du glutamate en cage. Connectez la pipette pour le système d'application de pression et l'attacher à la micromanipulateur.
4. Placez la pipette avec le composé en cage près de la dendrite (~ 30 um). Placez la pipette pour permettreefficace perfusion locale de la dendrite de choix. Ajustez le laser uncaging: positionner l'endroit uncaging près (~ 1 - 2 pm) pour la structure d'intérêt.
5. Définir des régions d'intérêt sur la dendrite choisi et épines adjacentes en utilisant un logiciel d'imagerie.
6. Approche de la région d'intérêt et en foyers injecter le composé en cage pendant plusieurs sec à basse pression (<3 PSI). Lancer patch clamp et enregistrements de fluorescence (à 790 nm multi-photon excitation) via un signal de déclenchement.
   Remarque: Au cours de la perfusion locale du composé encagé, le faisceau d'excitation est complètement obscurci à prévenir le blanchiment.
7. Arrêtez perfusion locale du composé en cage. Augmenter l'intensité du laser à deux photons pour permettre une excitation efficace de SBFI et appliquer un éclair UV pour initialiser uncaging (uncaging durée 300 ms).
8. Surveiller les changements dans SBFI fluorescence. Arrêter l'enregistrement après SBFI fluorescence a récupéré retour à l'état initial.

6. Pharmacologie

1. Pour tester l'implication des récepteurs ionotropiques du glutamate dans la production des courants et / ou des signaux de sodium évoqués par photolyse éclair UV de glutamate cage, utiliser les antagonistes des récepteurs.
   1. Passez à l'ACSF contenant le bloqueur AMPA récepteur cyano-nitroquinoxaline-dione (CNQX, 10 M) et le bloqueur des récepteurs NMDA amino-phosphonopentanoate (APV, 50 M), en plus de TTX (voir ci-dessus) et perfuser tranche d'au moins 10 min.
   2. Répétez la procédure de stimulation (voir 5.4 et 5.5.)
2. Réversibilité des effets des inhibiteurs
   1. Revenez à l'ACSF normale contenant uniquement TTX.
   2. Perfuser tranche de 20 min.
   3. Répétez la procédure de stimulation (voir 5.4 et 5.5.).

7 Morphologie

1. Enregistrer un XYZ-pile du clip box-région ensemble pour les mesures effectuées. Assurez-vous que cette pile est de suréchantillonnageD l'espace (au moins 0,2 um par pixel) pour permettre image optimale déconvolution et pour améliorer la qualité et la résolution des images.
2. Enregistrer un XYZ-pile de l'ensemble de la cellule afin d'évaluer la morphologie des cellules.
3. Algorithme de déconvolution fonctionner.

Résultats

Dans la présente étude, nous démontrons une procédure pour la microscopie multi-photons de la dynamique de sodium cellulaires avec le colorant fluorescent de SBFI dépendant du sodium dans les neurones pyramidaux CA1 de la souris aiguë des coupes de tissu hippocampique. En outre, nous montrons comment combiner cette technique d'imagerie avec uncaging basé à balayage laser de composés neuro-actif (par exemple le glutamate en cage) et son ciblage précis de micro-domaines cellulaires.

Chargement en cours neurones avec SBFI par le patch-pipette permis la visualisation de l'ensemble de la cellule, y compris des dendrites et des épines fines adjacentes en employant multi-photon excitation (figure 6A, B, D et figure 7A).

Figure 6 signaux de sodium et les courants synaptiques induites par photolyse éclair de glutamate cage. (A) Maximde projection d'image d'un neurone al pyramidale CA1 chargé avec SBFI via la pipette de patch (PP). La boîte de montre, à un grossissement de la zone dans B. LP indique la position et l'orientation de la pipette de perfusion locale de glutamate cage (B). Haute puissance de projection maximale d'un empilement de coupes optiques d'une dendrite d'épines dendritiques adjacents. Les piles de sections optiques ont subi z-alignement et déconvolution. La croix rouge indique la région cible du faisceau uncaging. La ligne en pointillés d'orange délimite la région d'intérêt à partir de laquelle l'émission de fluorescence a été enregistré. La boîte indique la zone indiquée élargie dans D. (C) A gauche: signal de sodium (rangée du haut) et somatique courant entrant (rangée du bas) induite par photolyse éclair de glutamate cage (indiqué par le flash jaune). La ligne rouge représente un ajustement des données expérimentales. La zone grise représente la période pendant laquelle le flash uncaging (300msec) obstrué l'imagerie de SBFI fluorescence droite:. Sans pré-perfusion avec du glutamate en cage, même UV-flash ni évoqué un changement de SBFI émission, ni un courant vers l'intérieur (D) à gauche:. l'image de haute puissance de la dendrite et à proximité épines délimitées dans B. Parallèlement, la même image avec des valeurs de gris inversés. Les lignes pointillées indiquent les régions d'intérêt dans lequel l'émission de fluorescence a été enregistré. La croix rouge indique la localisation du faisceau uncaging droite:. Transitoires sodium induites par UV-flash photolyse de glutamate cage. Bleu trace: signaux sodium dans la dendrite; trace rouge: réponse moyenne de trois épines adjacentes à la place uncaging; trace verte: réponse moyenne de trois épines éloignés. S'il vous plaît cliquer ici pour une version plus grande de cette figure.

Après perfusion locale avec en cageglutamate, l'application d'un rayonnement UV-flash à proximité d'une dendrite a entraîné une diminution transitoire dans l'émission de fluorescence de SBFI, ce qui reflète une augmentation de la concentration de sodium intracellulaire (Figure 6C, D et figure 7B). Dans le même temps, un courant vers l'intérieur a été observée à la soma (Figure 6C et la figure 7B). L'augmentation de la durée de l'éclair UV conduit à augmenter les amplitudes des deux courants vers l'intérieur du provoquée et les signaux de sodium (données non présentées), ce qui indique que le système est bien à l'intérieur de sa gamme dynamique et que les réponses cellulaires ni ni uncaging ont été saturés. L'application d'un rayonnement UV-éclair d'une durée identique ou plus pour des tranches qui n'ont pas été pré-perfusé avec du glutamate en cage, jamais provoqué des changements dans la fluorescence SBFI ni courants entrants, indiquant que ces signaux sont dus à la uncaging du glutamate (Figure 6C). De plus, ces résultats montrent qu'aucun des composants interdépendance Imaging- uncaging et on observe uelon nos conditions expérimentales. signaux de sodium peuvent également être détectés dans les épines dendritiques (figure 6D). Alors que nous n'avons pas cherché à obtenir une stimulation d'une seule colonne vertébrale qu'avec glutamate uncaging, les amplitudes maximales ont tendance à être légèrement plus élevé dans les épines à proximité de la place uncaging, tandis que les épines plus loin ont montré des changements de fluorescence pratiquement identiques à celles de la dendrite mère (Figure 6D).

Enfin, nous avons étudié la voie pour l'entrée de sodium dans les dendrites et des épines en réponse à uncaging de glutamate. Pour ce faire, nous avons utilisé CNQX et APV, qui sont sélectifs pour les bloqueurs sodium-perméable, récepteurs ionotropiques du glutamate et de la AMPA- sous-type NMDA, respectivement. Nos résultats montrent que les signaux de sodium intracellulaire induites par le glutamate et les courants somatiques provoquées ont été omises dans la présence de ces bloqueurs (figure 7B). Lors de wash-out des bloqueurs, les signaux sont repris. Ceci démontre that uncaging de glutamate active récepteurs ionotropiques du glutamate sur les neurones pyramidaux CA1, qui interviennent dans l'afflux de sodium dans les dendrites et des épines, ce qui transitoires de sodium intracellulaire et courants entrants.

Figure 7 profil pharmacologique des signaux de sodium évoqués et courants entrants. (A) remplie SBFI neurone CA1 pyramidale avec la pipette en patch (PP) fixé à la soma (B) gauche:. Courant transitoire de sodium et somatique induite par photo-activation du glutamate dans une cage de dendrites et des épines attachés Center. Perfusion avec la les bloqueurs des récepteurs ionotropiques du glutamate et CNQX APV inhibe à la fois le signal de sodium et le courant entrant induit par uncaging Droit:. Après lavage par des bloqueurs, les signaux sont restitués. Les représen ligne rougect un ajustement des données expérimentales. La zone grise représente la période pendant laquelle le flash uncaging (300 ms) obstrué l'imagerie de fluorescence SBFI. S'il vous plaît cliquer ici pour une version plus grande de cette figure.

Discussion

La présente étude montre que SBFI est bien adapté pour l'imagerie à deux photons des transitoires de sodium intracellulaire dans de petits compartiments cellulaires. Il doit être gardé à l'esprit, cependant, que le rendement quantique de SBFI est plutôt faible et ¹⁵ par rapport l'évolution de la concentration de sodium sont assez petites avec une activité physiologique. Ainsi, la mesure haute résolution des transitoires Na ⁺ dans les processus de qualité est une tâche relativement fastidieuse, et binning ou moyenne de plusieurs essais peuvent être nécessaires pour obtenir des signaux satisfaisants. En outre, la cinétique des phénomènes transitoires de sodium sont étonnamment faible, ce qui rend obligatoire à enregistrer pendant des périodes de temps prolongées. Cette observation correspond à ceux d'études antérieures, où la pourriture monoexponentielle des transitoires de sodium dans les dendrites neuronales et dans les astrocytes a été caractérisée par de grandes constantes de temps de décroissance de l'ordre de 10 secondes à la température ambiante ^1,2,6. transitoires de sodium semblent donc exercer une coopérative de temps beaucoup plus lenturse et beaucoup plus grandes constantes de temps de décroissance par rapport à des transitoires de calcium ^16.

Mettez de côté ces inconvénients, l'imagerie de sodium se révèle être un outil précieux pour l'étude des propriétés physiologiques des sous-domaines neuronales. Par exemple, l'imagerie de sodium peut servir à surveiller l'activité synaptique excitatrice au niveau ou à proximité de synapses actives. Parce que le sodium est essentiellement non tamponnée ^8,17, transitoires de sodium induite par l'activité-sont liés de façon linéaire à un large éventail de la libération de glutamate synaptique ou exogène glutamate appliquées. Ils représentent donc des indicateurs directs et impartiaux sur l'activité glutamatergique des neurones. En outre, l'indicateur de sodium colorants présentent de haute K _d (K _{le d} de SBFI est de l'ordre de 25 mM ^1). Même à des concentrations de colorant intracellulaires relativement élevées utilisées pour obtenir suffisamment de luminosité (en général 0,5 à 1 mM), la K élevé _d 's impliquent que les colorants eux-mêmes n'agissent pas comme des tampons pour sodieux. Par conséquent, ils ne faussent pas le cours de l'amplitude, ni le temps de transitoires de sodium, qui est toujours un sujet de préoccupation quand colorants sensibles au calcium sont introduits dans les cellules ^18. On peut donc supposer que les signaux détectés représentent un bon indicateur des changements «réels» en sodium intracellulaire. Leur évolution temporelle lente implique alors que la vitesse de diffusion de sodium intracellulaire dans les neurones est beaucoup plus faible que précédemment supposé ^19.

Une exigence essentielle pour la bonne exécution des expériences portant sur les propriétés de transmission et afflux de sodium voies synaptiques excitateurs dans les épines et les dendrites est l'induction d'une activation rapide et très localisée des structures post-synaptiques. Ceci peut être obtenu par l'application rapide et locale de glutamate ou agonistes à proximité immédiate d'une colonne vertébrale ou une dendrite par la photolyse flash de composés en cage. Photolyse éclair ne dama pas mécaniquementge le tissu, est libre d'artefacts de mouvement et est bien établie pour l'enquête de questions connexes (par exemple la signalisation calcique locale). Le diamètre de la tache uncaging était de 1,5 um dans le plan xy. Uncaging près d'un des signaux de sodium épineux dendrites induites dans les deux épines et la dendrite mère. Alors que les signaux ont tendance à être plus grand dans les épines les plus proches de l'endroit uncaging, les amplitudes dans la dendrite mère et les épines les plus éloignées étaient encore assez semblables à ceux à proximité directe de la place uncaging. Uncaging a été effectuée pour 300 ms au cours de laquelle courants entrants ont augmenté en amplitude. Glutamate Uncaged aurait diffusé dans le tissu au cours de la même période, l'activation de récepteurs ionotropiques du glutamate et afflux de sodium sur les régions et les épines dendritiques plus loin de la place uncaging.

Un problème intrinsèque qui se produit lors de l'utilisation d'un laser UV pour la photolyse de composés en cage administrés à travers la solution de bain de celluleest «filtrage interne. En raison de la vitesse de la cage d'absorption élevée, une lumière UV est atténué fortement le long de la voie à partir de l'objectif vers le site de stimulation ^20,21. Une façon possible d'éviter cela est perfusion locale de la cage qui est limité seulement au site de stimulation, ce qui réduit en outre la quantité de composé nécessaire pour une cage minimum. Par rapport à uncaging UV à balayage laser à médiation, proche infra-rouge à deux photons uncaging ²² est spatialement plus précise, principalement parce que la précision de la stimulation est augmentée dans l'axe z. D'autre part, en raison de la faible section des cages couramment utilisés pour des longueurs d'onde utilisées comme avec excitation à deux photons, soit une forte concentration du composé en cage ou très élevée, des intensités de lumière potentiellement phototoxiques sont nécessaires. En outre, deux photons uncaging nécessite un investissement beaucoup plus élevé dans l'équipement; entre autres, un laser IR supplémentaire en plus des composants optiques nécessaires, il faut.

Les deux SBFI et MNI-glutamate sont excitables dans la gamme de longueur d'onde identique. Cela peut conduire à une interdépendance involontaire du laser UV et uncaging SBFI laser ou d'imagerie infrarouge et MNI-glutamate, ce qui entraîne le blanchiment de SBFI uncaging par le flash et / ou un uncaging continu de glutamate par les rayons infrarouges. Cependant, comme le montre la figure 6C, ni un flash UV par lui-même, ni d'imagerie photonique plusieurs causé ces effets réciproques dans nos conditions expérimentales.

Systèmes UV-flash similaires à celle décrite ici sont utilisées en routine dans de nombreux autres laboratoires et peuvent assez facilement être incorporés dans n'importe quel multi-photons imagerie microscope existant. Il offre l'avantage que le faisceau laser pour la photolyse peut être positionné librement dans le champ de vision. En outre, le système permet un repositionnement rapide et automatique du faisceau laser et le volume de sortie, respectivement, dans le champ de vision au cours de l'expérience. Oumodification de r simplifie et améliore le positionnement précis de l'endroit uncaging, de sorte que les images du logiciel d'imagerie peuvent servir à ajuster imagerie et uncaging cadres congruente.

L'ensemble de cellule entière de patch-clamp et d'imagerie de sodium à plusieurs photons dans les dendrites et les épines de neurones centraux, combiné avec un mode opératoire modifié pour uncaging induite par la lumière UV de glutamate, permet une activation fiable et focale des récepteurs du glutamate dans le tissu. Il peut donc servir à analyser les propriétés de la transmission synaptique excitatrice et de signaux de sodium dans les neurones post-synaptiques dans le tissu intact.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Capillaires en verre borosilicaté	Hilgenberg	1405059	75 x 2 mm, épaisseur de paroi 0,3 mm
Caméra	Jenoptik	ProgRes MF	IR-DIC Caméra compatible
	SVI	Huygens Pofessional X11
Spectromètre à fibre optique	Ocean Optics	USB 4000	Spectromètre à fibre optique miniature
Tubes filtrants	VWR		, 0,2 & micro ; m
Logiciel d’imagerie	Olympus Europe	Flowview Ver 5.0c, contrôleur
	Contrôle de	l’intensité du faisceau laser sur mesure + passage rapide à zéro en cas de retour via laser IR à cellule de pockels
			ATTENTION
Moniteur de puissance IR	Micromanipulateur sur
	Burleigh	PCS 5000
Système de microscope/imagerie	Olympus Europe	BX51WI/FV300	Le microscope et les systèmes d’imagerie ont été fortement modifiés
Roue à filtres ND	Newport	50Q04AV.2	Silice fondue UV, densité optique 0,05 - 2,0
Objectif	Nikon Instruments Europe	NIR Apo 60x/1.0w
Patch clamp amplificateur	HEKA	EPC-10
Extracteur de pipettes	Narishige	Modèle PP-830
Système pneumatique d’éjection de médicament	NPI Electronic	PDES-DXH
Cellule Pockels	Conoptics	350-80 LA-BK	EOM, utilisé comme interrupteur rapide et pour le réglage de la puissance
Cellule Pockels pilote	Conoptics	M302-RM	Amplificateur différentiel haute tension
Obturateur	Vincent Associates	LS6ZM2	ALMgF2 lames BeCu revêtues Contrôleur d’obturateur
Pilote d’obturateur
Logiciel de décageage	Rapp OptoElectronic	UGA40 1.1.2.6 + Laser UV NetCam
	Rapp OptoElectronic	DL-355/10	cw DPSSL Laser, 355 nm ; 10 mW ; ATTENTION
Système de balayage laser UV	Rapp OptoElectronic	UGA 40	Système de balayage galvanométrique
Nom du composé	Entreprise	Numéro de catalogue	Comments/ Description
CNQX	Sigma Aldrich	C-127	AMPA receptor antagonist ; ATTENTION
DL-AP5	Alfa Aesar	J64210	antagoniste des récepteurs NMDA ; ATTENTION
SBFI K+ sel	Teflabs	OO32
TTX	Ascent Scientific	Asc-055	Inhibiteur des canaux Na+ voltage-dépendants ; ATTENTION
NMI-caged-L-Glutamate	Torcis	1490	Glutamate en cage libéré lors de l’absorption par UV

Filtre central de puissance de faisceau IR Tiempo SpectraPhysics Mai-Tai fs-pulsed Ti :Sa laser accordable (710 - 990 nm) ;mesure sur mesure Vincent Associates Uniblitz VCM D1 Trancheuse/Vibratome Thermo Scientific Microm HM 650 V