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Article de méthode

Les analyses toxicologiques pour Effets d'essais d'un médicament épigénétique sur le développement, la fécondité et de la survie du paludisme moustiques

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DOI :

10.3791/52041

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16 janvier 2015

 ,  , 
1Department of Entomology, Virginia Tech

Dans cet article

Résumé

Un protocole est développé pour examiner les effets d’un médicament épigénétique DZNep sur le développement, la fécondité et la survie des moustiques. Nous décrivons ici les procédures d’exposition aqueuse de DZNep aux moustiques immatures et d’exposition sanguine de DZNep aux moustiques adultes, en plus de mesurer l’inhibition de l’hydrolase de l’HSA.

Résumé

Résistance insecticide pose un problème majeur pour les programmes de lutte contre le paludisme. Les moustiques se adapter à un large éventail de changements dans l'environnement rapidement, faire du paludisme contrôler un problème omniprésent dans les pays tropicaux. L'émergence de populations résistantes aux insecticides justifie l'exploration de nouvelles voies de cibles de médicaments et composés pour le contrôle des moustiques vecteurs. Médicaments épigénétiques sont bien établis dans la recherche sur le cancer, mais pas beaucoup est connu au sujet de leurs effets sur les insectes. Cette étude fournit un protocole simple d'examiner les effets toxicologiques de 3-déazaneplanocine A (DZNep), un médicament épigénétique expérimental pour le traitement du cancer, sur le vecteur du paludisme, Anopheles gambiae. Une augmentation dépendante de la concentration de la mortalité et de diminution de la taille a été observée chez les moustiques immatures exposés à DZNep, alors que le composé réduit la fécondité des moustiques adultes par rapport au témoin traitements. En outre, on observe une diminution de toxicomanes en S -adénosylhomocystéine (SAH) activité hydrolase chez les moustiques après une exposition à DZNep rapport à contrôler traitements. Ces protocoles prévoient le chercheur avec une procédure simple, étape par étape pour évaluer plusieurs paramètres toxicologiques pour un médicament expérimental et, à son tour, de démontrer une approche unique multi-broches pour explorer les effets toxicologiques des médicaments ou composés de épigénétiques solubles dans l'eau intérêts contre les moustiques vecteurs et autres insectes.

Introduction

Le paludisme est responsable pour le plus grand nombre de décès liés à insectes dans le monde. Quelque 219 millions de cas se produisent chaque année dans le monde, entraînant environ 660 000 décès, principalement en Afrique 1. Malgré les efforts concertés, les programmes de lutte contre le paludisme sont confrontés à plusieurs défis. Bien que les moustiquaires imprégnées d'insecticides à effet rémanent dans les composants et sous forme de pulvérisation de clés du programme, la résistance aux insecticides chez les populations locales entravent ces efforts 2. L'augmentation rapide des populations de moustiques résistants aux insecticides est largement attribuable à la capacité des moustiques vecteurs du paludisme se adapter rapidement aux changements dans leur environnement et d'exploiter différentes niches 3,4,5. Pour surmonter les mécanismes existants de la résistance aux insecticides, l'exploration de nouvelles cibles d'insecticide et des composés de la prochaine génération est justifiée. Un protocole simple, étape par étape pour déterminer l'efficacité des insecticides expérimentaux sur les différentes étapes de la vie de paludisme mosquitoes pourrait considérablement améliorer ces efforts.

Les études pharmacologiques des effets du médicament sur des lignées cellulaires et des modèles animaux ont établi l'utilisation de médicaments épigénétiques comme un outil utile pour moduler la génétique et de la physiologie des cellules et des organismes. méthylation de l'ADN et de modification des histones sont deux mécanismes épigénétiques qui affectent l'expression génique dans des organismes multicellulaires, sans changer la séquence d'ADN sous-jacente 6. Les modifications post traductionnelles telles que la méthylation jouent un rôle crucial dans le maintien de l'intégrité cellulaire et l'expression des gènes, et peuvent affecter plusieurs processus fondamentaux 7,8,9. Recherche dans certaines espèces d'insectes ont souligné l'importance de l'épigénétique dans des procédés impliquant l'ovogenèse et endiguer la maintenance de la cellule 10, ainsi que la compensation de dosage 11. Toutefois, ces aspects dans les vecteurs de maladies sont encore à explorer. L'utilisation d'un composé à moduler ce système chez les moustiques peut nous fournir ensites dans les nouvelles voies de cibles d'insecticide. 3-déazaneplanocine A (DZNep) est un inhibiteur d'histone méthylation connu, qui ont un impact sur ​​les différents types de cancers ont été étudiés 12,13,14,15,16. DZNep est un médicament soluble dans l'eau stable qui inhibe indirectement épigénétique histone lysine N -méthyltransférase (EZH2), un composant du complexe répressif 2 Polycomb (PRC2) dans des cellules de mammifères. PRC2 joue un rôle important dans la régulation de la croissance des cellules souches dans les organismes multicellulaires, et la méthylation des histones est un aspect clé de la médiation PRC2 silençage génique. Chez les souris immunodéprimées, les cellules pré-traitées avec DZNep ont été montré pour être moins tumorigène 17. Ce médicament est de plus utilisée pour étudier d'autres maladies, telles que la non-alcoolisées maladie du foie gras, dans lequel est impliqué EZH2 18. DZNep est un S -adenosylhomocysteine ​​établie (SAH) hydrolase inhibiteur de 19, 20. L'inhibition de la SAH-hydrolase résultats dans unaccumulation de SAH et, à son tour, conduit à l'inhibition de l'activité méthyltransférase en limitant disponibles groupes donneurs de méthyle. SAH est un dérivé d'acide aminé utilisé par de nombreux organismes, y compris les insectes, dans leurs voies métaboliques. Une étude récente a montré que DZNep à faibles doses peut affecter diapause et retarder le développement chez les insectes 21.

Ici, un protocole robuste pour étudier les effets d'un composé soluble dans l'eau sur les différentes étapes de la vie de moustiques est développé. Les trois parties de ce protocole comprennent des instructions pour examiner les effets d'un composé soluble dans l'eau sur les moustiques femelles adultes immatures, de sang-alimentation et de l'activité enzymatique de mâles adultes et les moustiques femelles. Premièrement, DZNep est dissous dans l'eau pour étudier le développement de moustiques immatures et la survie. Ceci est réalisé à deux concentrations de comparer les différences résultant de dix fois plus de l'exposition au médicament. Pour explorer l'effet de la drogue sur les moustiques femelles adultes, DZNepest ajoutée au sang de mouton défibrillation et nourris artificiellement le sang aux femmes. Par la suite, les résultats de la drogue sur la fécondité est examinée. Enfin, un dosage de l'activité enzymatique est réalisée en utilisant l'acide 5,5'-dithiobis (acide 2-nitrobenzoïque) (DTNB), comme indicateur pour déterminer l'effet de la SAH-hydrolase sur DZNep inhibition chez le mâle adulte et les moustiques femelles. Bien que ce protocole est développé avec un moustique vecteur du paludisme, Anopheles gambiae, il peut être facilement adapté à l'étude des effets des composés d'intérêt sur ​​les espèces de moustiques ou d'autres insectes. Les techniques décrites dans le présent protocole ne peuvent être efficacement appliquées à un médicament avec une solubilité limitée ou pas dans l'eau ou des milieux aqueux.

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Protocole

NOTE: Les trois parties du protocole décrivent l'exposition aqueuse du médicament DZNep à larves de moustiques, une exposition sur la base de sang de DZNep aux femelles adultes pour étudier son effet de la fécondité, et SAH hydrolase inhibition par DZNep mesurés en utilisant une technique colorimétrique simple. Une représentation schématique de ces essais est représenté sur la Figure 1.

1. immatures développement Mosquito et la survie dosages

NOTE: Cette section explique l'utilisation d'un médicament soluble dans l'eau qui affecte le développement des larves de moustiques et de survie.

  1. Hatch A. oeufs gambiae à 28 ° C dans l'eau distillée (dH 2 O) et les larves arrière stade leur 2 ème.
  2. Prenez une DNAse six puits, RNAse plaque de culture cellulaire et versez 10 ml dH 2 O dans chaque puits.
  3. Sélectionnez larves de moustiques au 2 ème stade et ajouter 15 larves par puits. Avant d'ajouter 2 ème stade larvaire à l'assiette, put les sur une serviette de papier pour 2-3 sec pour enlever l'excès d'eau.
  4. puits d'étiquetage avec des bandes de couleur à randomisent expérience. Étiqueter deux puits par concentration d'essai sur chaque plaque (Figure 2).
  5. Préparer un chlorhydrate 1 mM DZNep (MW = 298,73) solution mère en dissolvant 0,3 mg DZNep dans 1 ml de dH 2 O. Ajouter solution stock de DZNep.HCl aux puits marqués pour atteindre une concentration finale de 0,5 uM et 5,0 uM.
    NOTE: La solution stock peut être conservé à 4 ° C pour le court terme (un jour à un mois) ou -20 ° C pour le long terme (plus d'un mois).
    REMARQUE: Ajout de la solution de stock pour concentrations susmentionnées ne changera pas le volume d'eau dans les puits de manière significative. Toutefois, en cas de concentrations beaucoup plus élevées, il est souhaitable de dissoudre le composé dans le milieu des larves pour éviter toute dilution inutile du composé.
  6. Ajouter la même quantité de nourriture pour poissons en flocons à chaque puits. Recouvrir la plaques et les incuber à 28 ° C dans un incubateur.
  7. Enregistrer le taux de mortalité pour les larves de moustiques DZNep-traités et non traités, après une période d'exposition de 24 h. Retirez et jetez les larves morts. Répétez cet enregistrement tous les jours jusqu'à ce que toutes les larves meurent ou se nymphoser et émerger comme adultes. Notez la taille des larves tous les deux jours, ce est à dire, le jour 0, 2, 4, 6, 8, jusqu'à ce qu'ils se transforment en pupes.
  8. Analyser les données de développement et de mortalité des larves en utilisant un logiciel statistique adéquate d'analyse.
    NOTE: Un graphique à barres peut être utilisé pour représenter les données de mortalité dans Microsoft Excel. Analyse multidimensionnelle de la variance (MANOVA) réalisée avec un logiciel tel que JMP ou SPSS va révéler si des doses différentes du médicament entraîner la survie significativement différent des larves de moustiques.

2. Fécondité Assay en administrant des drogues Grâce Feeder artificielle à moustiques femelles

NOTE: Cette section décrit l'ajout de la drogue à un sange en l'amenant à moustiques femelles adultes en utilisant un système d'alimentation artificielle.

  1. Mettre en place des cages de moustiques adultes avec le même nombre de moustiques mâles et femelles pour le contrôle et la cage de test. Fournir une solution sucrée à 10% trempé dans des boules de coton à la fois les cages jusqu'à ce que les femmes sont prêtes pour l'alimentation (3-5 jours est optimale pour Anopheles gambiae).
  2. 2 heures avant le repas de sang, enlever les boules de coton pour assurer femelles ont faim.
  3. Assembler deux dispositifs d'alimentation sanguins artificiels qui se composent d'un grand entonnoir inversé à fond de verre (diamètre = 50 mm, longueur = 70 mm) et une matière plastique entourant scellée avec de la colle industrielle. Fixez des tubes en plastique (diamètre = 7 mm) à deux sorties «mangeoires (diamètre = 10 mm) via des connecteurs pour entrées et sorties de l'eau. Étiqueter les deux mangeoires que "Control" et "5 uM DZNep."
  4. En utilisant un élément de chauffage disponible dans le commerce, mis en place le programme pour l'alimentation. Dans "Menu" Aller à "Paramètres"et sélectionnez "Consignes"; programmes préchargés apparaîtront. Sélectionnez "SP1" et régler la température de 37 ° C.
    NOTE: L'élément chauffant se assure que le sang administré est maintenue à une température constante. Paramètres de programme supplémentaires peuvent être utilisés pour différentes espèces de moustiques ou d'insectes.
  5. Remplissez un seau avec de l'eau et plongez l'élément de chauffage dans l'eau.
  6. Coupez un morceau carré de Parafilm (50 mm x 50 mm) et l'étirer de faire un film membraneuse mince. Couvrir le fond des mangeoires artificielles avec le Parafilm. Coupez un autre morceau de Parafilm (50 mm x 10 mm), l'étirer et sceller les bords des mangeoires.
  7. Assembler le système, la connexion des lignes d'alimentation et l'élément de chauffage par les tubes. Une fois terminé, basculer sur le système et sélectionnez "SP1". Appuyez sur "Entrée" pour démarrer le système.
    REMARQUE: L'eau va se échauffer à 37 ° C et maintenu à cette température.
  8. Surveiller etempérature de l'eau de e en utilisant un thermomètre dans le réservoir d'eau.
    REMARQUE: Les connecteurs et tubes aident à maintenir une circulation constante de l'eau à travers le système de sorte que la température du sang reste à 37 ° C.
  9. Remplissez un bac à fond plat avec une solution d'eau de Javel à 10% qui sera utilisé pour décontaminer tout déversement de sang.
  10. Ajouter 2 ml de sang de mouton défibrillation à un tube à microcentrifugation. Nommez ce que "Control". Répétez le processus pour le tube expérimentale étiquetés comme "5 uM DZNep" .Add 6 pi de solution stock DZNep (voir l'étape 1.5) au tube expérimentale intitulée «5 uM DZNep" Mélanger délicatement le sang et médicaments en inversant plusieurs fois. Incuber le tube 10 min à température ambiante.
  11. En utilisant une pipette, ajouter 2 ml de contrôle et de test sanguin vers le haut de mangeoires étiquetés en conséquence. Jeter la pipette dans la solution d'eau de Javel. Couvrir la cage avec un sac sombre et respirer de l'air sur la cage périodiquement pour encourager females pour l'alimentation.
  12. Laissez les moustiques se nourrissent pendant environ 30 min. Une fois que l'alimentation est terminée, éteignez l'élément de chauffage, prendre les mangeoires et les dépouiller le Parafilm. Faire tremper le chargeur dans une solution d'eau de Javel pour environ 5 min et bien rincer à l'eau déminéralisée.
  13. Enlevez les mangeoires et de mettre des boules de coton avec de l'eau de sucre sur les cages pendant 48 heures. Placer un plat d'œufs contenant de l'eau et le papier filtre dans les cages de nuit pour faciliter la ponte. Étiqueter chaque plat d'œufs avec la concentration d'essai ou de contrôle respective.
  14. Retirez le plat d'œufs lendemain et examiner le nombre et la structure des œufs sous un microscope stéréo. Obtenir des images en utilisant le logiciel Q-colors5. Comptez le nombre d'œufs. Analyser différence dans le nombre d'œufs obtenus à partir de tests et de contrôle des cages.
    REMARQUE: Un test t non apparié peut être utilisé pour déterminer si le nombre d'oeufs sont significativement différentes (p ≤0.05).

3. biochimique Dosage de Mosquito Inhibition enzymatiquepar médicaments

NOTE: Cette section décrit un dosage de l'activité de l'enzyme en utilisant DTNB comme indicateur pour déterminer l'effet de DZNep sur SAH hydrolase inhibition chez les mâles adultes et les moustiques femelles.

  1. Préparer un M de Na 2 HPO 4 (phosphate de sodium dibasique) solution à 0,1 par addition de 14,19 g de Na 2 HPO 4 à 1 L de dH 2 O. Ensuite, préparer un M NaH 2 PO 4 (phosphate de sodium monobasique) solution à 0,1 par addition de 13,79 g de NaH 2 PO 4 à 1 L de dH 2 O.
  2. Titrer le M Na 2 HPO 4 solution à 0,1 avec le 4 solution à 0,1 M NaH 2 PO à pH 8,5.
    NOTE: Ce sera la solution de travail des stocks de 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5).
  3. Préparer une solution d'homogénéisation de 0,1 M de Na 2 HPO 4 (pH 8,5) par addition de 0,3% de Triton X-100.
    NOTE: La solution d'homogénéisation peut être conservé à 4 o C.
  4. Prepare une SAH 1,6 mM (PM = 384,4) solution en dissolvant 6,15 mg de SAH dans 10 ml de 0,1 M de Na 2 HPO 4 (pH 8,5).
  5. Préparer une mM DTNB 1,6 (PM = 396,4) solution en dissolvant 6,3 mg de DTNB dans 10 ml de 0,1 M de Na 2 HPO 4 (pH 8,5). Conserver la solution de DTNB frais sur la glace jusqu'à utilisation.
  6. Préparer un mM DZNep.HCl 1 (MW = 298,73) solution en dissolvant 0,3 mg de DZNep dans 1 ml dH 2 O. Ensuite, diluer la solution 1 mM DZNep en une série de concentrations allant de 1,000 pM à 0,002 pM dans dH 2 O.
  7. Pour mesurer la SAH hydrolase inhibition par DZNep, préparer un extrait d'enzyme brute de moustiques: Homogénéiser 10 moustiques adultes non gorgés dans 1 ml de glace-froid 0,1 M NaH 2 PO 4 (pH 8,5), contenant 0,3% de Triton X- 100, en utilisant un homogénéiseur de tissu de verre. Transférer le broyat dans un tube de 1,5 ml à centrifuger.
  8. Centrifuger l'homogénat pendant 5 min à 10 000 xg à 4 ° C. Transférer le surnageant dans un environnement propre1,5 ml de tube à centrifuger. Utiliser le surnageant comme source d'enzyme pour le dosage biochimique SAH.
  9. Pour le traitement à blanc (ce est à dire, pas DZNep, aucune enzyme), ajouter 50 ul de 1,6 mM de SAH, 50 ul de 1,6 mM de DTNB, et 100 ul de 0,1 M de Na 2 HPO 4 (pH 8,5) dans les puits individuels d'un 96 puits, microplaque à fond plat.
  10. Pour le contrôle (ce est à dire, pas DZNep), ajouter 50 ul mM SAH 1,6, 50 mM DTNB 1,6 ul, 50 ul de 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) et 50 ul enzyme (SAH hydrolase obtenue à partir d'extrait brut) à la personne puits.
  11. Pour les traitements DZNep, ajouter 50 ul mM SAH 1,6, 50 mM DTNB 1,6 pi, 50 pi et 50 pi enzyme concentration choisie DZNep à des puits individuels. Préparer 4 répétitions par traitement et de contrôle.
  12. Lire la densité optique (DO) des échantillons d'enzyme SAH à 405 nm pendant 5 min à 20 secondes d'intervalle en utilisant un lecteur de microplaques de 96 puits.
  13. Soustraire la DO du contrôle d'une viergee traitement OD obtenue à partir de chaque puits. Calculer le pour cent restants activité hydrolase SAH utilisant l'équation suivante:% d'activité résiduelle = (Traitement OD / contrôle OD) x 100.

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Résultats

La figure 1 est une représentation schématique des essais; il décrit les différentes étapes de la procédure indiquée dans cet article. Comme le protocole est basé sur les différents stades de vie des moustiques, il n'y a pas séquence particulière à suivre pour les expériences détaillées ici. L'utilisateur peut choisir d'effectuer un ou plusieurs tests en même temps, en fonction de la disponibilité des échantillons.

La Figure 2 montre la plaque mis en ...

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Discussion

Il ya plusieurs étapes essentielles à la bonne application de ce protocole. Pour le dosage des larves, il faut prendre soin d'étiqueter correctement et de reproduire chaque concentration d'essai. Randomisation échantillons d'essai et en ajoutant le montant désigné de médicament à des puits d'essai respectifs est une partie importante de ce dispositif expérimental mis en place. Avant d'ajouter 2 ème stade larvaire des moustiques à une microplaque de 96 puits, chaque larve peut être mis sur ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions Victor Marquez d’avoir fourni DZNep.HCl et Scotty Bolling d’avoir fabriqué les alimentateurs de sang. Les souches Mopti et SUA2La d’An. gambiae ont été obtenues auprès du Centre de recherche sur le paludisme et de ressources sur les réactifs de référence (MR4). Ce travail a été soutenu par le Fralin Life Science Institute et la subvention des National Institutes of Health 1R21AI094289 à Igor V. Sharakhov.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Microplaque à 96 puitsFisher Scientific12565561
Plaque de culture cellulaireCytoOneCC7682-7506
CentrifugeuseSorvall Fresco76003758Une autre centrifugeuse peut être utilisée
Rouleaux de ruban coloréFisherS68134
Microscope de dissectionOlympusSZ
DTNBSigma AldrichD8130
DZNep.HClSigma AldrichSMLO305
Gobelets
Papiers filtresFisher09-795E
Mangeoires en verreVirginia Tech
Homogénéisateur
Élément chauffantFisher ScientificNC0520091
IncubateurPercival scientificI36VLC8Un autre incubateur peut être utilisé
Tube de microcentrifugation, 2  ; mlAxygen22-283
Tube de microcentrifugation, 1,5 mlAxygenMCT-150-C
MicropipetteEppendorf4910 000.069
Na2HPO4Fisher ScientificM-3154
NaH2PO4Fisher ScientificM-8643
pH-mètre  ;Mettler Toledo 7easyS20
Lecteur de plaquesSpectramaxM2
SAHSigma AldrichA9384magasin à -20 ° ; C
Triton X-100Sigma AldrichT8787
à œufsde tissus en verre

Références

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