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Article de méthode

Fluorescent rapide In Situ Protocole hybridation pour ARN Xist combinée avec d'immunofluorescence Histone Modification dans inactivation du chromosome X

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DOI :

10.3791/52053

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26 novembre 2014

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1Division of Reproductive Sciences, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous avons développé un protocole d’hybridation in situ fluorescente (FISH) spécifique au brin facilement personnalisable combiné à l’immunofluorescence. Cela permet un examen détaillé de la dynamique de l’ARN avec un aperçu simultané de la structure de la chromatine, de l’organisation nucléaire et de la régulation transcriptionnelle au niveau de la cellule unique.

Résumé

Combinant ARN hybridation fluorescente in situ (FISH) avec immunofluorescence (immuno-FISH) crée une technique qui peut être utilisé au niveau de la cellule unique pour détecter les dynamiques spatiales de localisation d'ARN avec perspicacité simultanée dans la localisation de protéines, les modifications épigénétiques et autres détails qui peut être mis en évidence par immunofluorescence. Inactivation du chromosome X est un paradigme de longue ARN non codant (lncRNA) silençage génique médiée. transcrit spécifique (Xist) accumulation de lncRNA X-inactive (appelé un nuage Xist) sur l'un des deux chromosomes X chez les femelles-mammifères est une étape critique pour initier inactivation du chromosome X. ARN Xist interagit directement ou indirectement avec diverses enzymes de modification de la chromatine et introduit paysages épigénétiques distinctes au chromosome X inactif (Xi). Une des caractéristiques de l'épigénétique connu Xi est l'histone H3 lysine triméthyl-27 (H3K27me3) modification. Ici, nous décrivons un immuno-FISH simple et rapideprotocole pour la détection de l'ARN Xist en utilisant l'ARN FISH avec plusieurs sondes d'oligonucléotides couplés avec immunofluorescence de H3K27me3 d'examiner la localisation des ARN Xist et des modifications épigénétiques associées. Utilisant des sondes oligonucléotidiques se traduit par un temps d'incubation plus courte et une détection plus sensible de l'ARN Xist rapport au transcrit in vitro des sondes d'ARN (des ribosondes). Ce protocole fournit un outil puissant pour comprendre la dynamique de lncRNAs et sa modification épigénétique associé, la structure de la chromatine, organisation nucléaire et la régulation transcriptionnelle.

Introduction

Mammalian inactivation du chromosome X (XCI) est une stratégie pour compenser le déséquilibre de dosage de gène lié à l'X entre XX et XY, dans lequel l'un des deux chromosomes X chez les femelles est transcriptionnellement 1 inactivé. Inactivation du chromosome X est un système modèle très longtemps ARN non codant (lncRNA) recherche. Inactivation du chromosome X est réglementée par de multiples lncRNAs, et a été largement étudiée au cours des dernières décennies à découvrir les mécanismes de diaphonie entre lncRNAs, la transcription, la structure de la chromatine et l'organisation nucléaire 2, 3.

Le centre d'inactivation X (XIC) situé sur le chromosome X est un locus génétique complexe constitué d'un certain nombre de gènes qui produisent des ARN non codants 4. X-inactive transcrit spécifique (Xist) lncRNA chez les mammifères euthériens est un de ces lncRNA qui joue un rôle crucial dans inactivation du chromosome X 5,6. transcriptions de Xist entourent l'emplacement du future Xi pour lancer inactivation du chromosome X, et apparaît comme un nuage quand visualisées en utilisant l'ARN FISH; cette formation est appelé le "Xist Couverture" 7. Étant donné que l'ARN Xist interagit avec diverses enzymes de modification de la chromatine, la co-localisation des nuages ​​Xist avec différentes modifications épigénétiques de la chromatine et la transcription silencieux répressif est observée au cours de l'inactivation du chromosome X-8. Par exemple, l'ARN Xist interagit avec polycomb complexe répressive 2 (PRC2) qui est responsable de H3K27me3 et induit un état ​​de la chromatine répressive 9. L'apparition du nuage de Xist sur ​​le Xi et son co-localisation avec la modification H3K27me3 intensive représente un paysage de hétérochromatine facultative du Xi 10,11.

Techniques cytogénétiques, comme l'ADN / ARN FISH ont parcouru un long chemin de la méthode traditionnelle en utilisant des sondes radiomarquées 12 aux techniques récentes et avancées avec une sensibilité accrue etl'imagerie de fluorescence en utilisant plusieurs sondes oligonucléotidiques 13,14. ADN / ARN FISH couplé avec immunofluorescence a été régulièrement utilisé comme un outil cytologique de comprendre l'organisation spatio-temporelle nucléaire, localisation d'ARN, la structure de la chromatine et modifications. La préparation de sonde la plus standard pour ARN FISH implique l'utilisation de plasmide ou de chromosomes artificiels (BAC) clones bactériens et leur étiquetage ultérieure soit avec translation de coupure ou amorçage aléatoire 15. Cependant, près de 70% des gènes chez la souris et 40% des gènes chez l'homme montrent un chevauchement des sens et antisens transcriptions 16, donc nécessitant une méthode de FISH spécifique de brin afin de distinguer sens et antisens transcriptions. In vitro des sondes d'ARN transcrits (ribosonde ) sont souvent utilisés pour spécifique de brin ARN FISH 17,18; Toutefois, il se agit de la préparation d'un clone de plasmide ou d'un produit PCR avec T7, SP6, ou le promoteur de T3 et ribosondes de synthèse. En outre, des ribosondes dérivé de génomeic ADN ou ADNc contiennent souvent des régions non-spécifiques et les éléments répétitifs, qui se traduisent par un bruit de fond élevé. Un autre problème est que ribosondes, qui sont à quelques centaines de nucléotides de long et contiennent plusieurs fluorophores, ne peuvent pas pénétrer efficacement dans le noyau. Pour éviter cela, plusieurs sondes oligonucléotidiques courtes marqués avec un fluorophore unique à la fin ont été développées qui ont une bonne sensibilité, la puissance du signal uniforme, et la facilité de purification et de manipulation 14. En outre, les oligonucleotides d'ADN sont généralement plus stables que les ARN. Nous avons appliqué une stratégie similaire en utilisant des oligonucléotides ARN Xist dans FISH 19 avec immunofluorescence de comprendre la dynamique de l'Xi épigénétiques induites par Xist lncRNA pendant le processus d'inactivation du chromosome X. Ce protocole décrit la création de sondes oligonucléotidiques et une bonne préparation des cellules, ainsi que l'utilisation de l'immunofluorescence et l'ARN FISH. ARN Xist FISH utilisant oligonucle multiplesotides est approche rentable à long terme si ARN Xist FISH est effectuée régulièrement dans son laboratoire. Cette technique peut être utilisée pour identifier lncRNAs dans les cellules tout en traçant simultanément son co-localisation avec des modifications ou des facteurs épigénétiques. Un avantage majeur du protocole est la possibilité de modifier facilement pour l'adapter à ses intérêts de recherche.

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Protocole

1. Préparation de la sonde

  1. Obtenir de multiples oligonucléotides uniques dans Xist (oligonucléotides 20-30 nucléotides de longueur, de 63 à 65 ºC température de fusion, tableau 1) avec une modification 5'-amino et de suspendre dans l'eau.
  2. Piscine quantités équimolaires d'oligonucléotides avec 5'-amino modification (total 4,5 ug) et étiqueter avec colorant fluorescent amine réactive en suivant les instructions du fabricant.
    1. Dissoudre les oligonucléotides regroupés dans Final 5 pi d'eau sans nucléase et ajouter 3 pl de 1 M de bicarbonate de sodium à la solution d'oligonucléotide.
    2. Ajouter 2 ul DMSO pour le flacon de colorant et vortex amine réactive brièvement.
    3. Mélanger la solution d'oligonucléotides avec le colorant réactif dans du DMSO et on incube le mélange à température ambiante pendant 1 heure dans l'obscurité.
  3. On purifie les sondes oligonucléotidiques marquées par fluorescence par colonne G-25 suivie d'une précipitation à l'éthanol.
    1. Centrifugeuse colonne G-25 à 750 x g pendant 1 minute pour éliminer l'excès de tampon de stockage.
    2. Ajouter de l'eau sans nucléase 40 pi au mélange d'étiquetage produit dans l'étape 1.2.3 et appliquer à la colonne G-25. Centrifuger à 750 g pendant 2 min.
    3. Ajouter 50 ul d'eau sans nuclease, 10 ul de 3 M d'acétate de sodium (pH 5,2) et 250 ul d'éthanol à la sonde purifiée de l'étape 1.3.2. Conserver à -80 ° C pendant 30 min et centrifuger à 21 000 g pendant 15 min à 4 ° C.
    4. Laver les oligonucleotides précipitées une fois avec 1 ml d'éthanol à 70%.
    5. Remettre en suspension dans 50 pi d'eau sans nuclease ou TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA) à une concentration finale d'environ 10 uM.
  4. Diluer les sondes oligonucléotidiques marquées par fluorescence à une concentration finale de 250 nM avec un tampon d'hybridation (10% formamide; 2x SSC [NaCl 300 mM; citrate de sodium 30 mM]; 2 mg / ml de BSA; 10% de sulfate de dextrane).
    NOTE: Avec ce protocole FISH rapide, oligonucléotide ppeignoirs dans Xist ont été conçus et utilisés à une concentration supérieure à la normale protocole FISH en utilisant des sondes oligonucléotidiques dans le but de raccourcir le temps d'incubation pour l'hybridation.

2. Préparation de la lame

REMARQUE: Les diapositives peuvent être préparé pour immuno-FISH utilisant souches de souris embryonnaires (ES) ou le corps embryoïdes (EB) la différenciation des cellules 20, 21 soit par leur culture directement sur ​​lame de poly-lysine-traité ou en utilisant cytospin avec suspension cellulaire. Ici, la préparation de lame par cytospin se affiche.

  1. Aspirer le milieu de culture dans une boîte de 6 puits. Laver avec du PBS (température ambiante), et aspirer à fond.
  2. Ajouter 0,5 ml de trypsine dans le plat à 6 puits, incuber pendant 5-10 min à 37 ° C.
  3. Ajouter 5 ml de milieu et de disperser les cellules par pipetage doucement monter et descendre plusieurs fois.
  4. Transférer les cellules dans un tube de 15 ml, centrifuger pendant 5 min à 200 x g à température ambiante.
  5. Jeter un moyenD délicatement les cellules en suspension dans 2 ml de PBS.
  6. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre, et on dilue la suspension de cellules à 4 x 10 5 cellules / ml en PBS.
  7. Assembler un toboggan, une carte de filtre et une chambre avec un clip et placez-les dans les fentes appropriées dans le rotor de la cytospin. Ajouter 250 pi de chaque échantillon préparé à l'étape 2.6 dans chaque chambre des unités assemblées dans le cytospin. Centrifuger à 1500 rpm pendant 10 min à température ambiante.
  8. Remplir trois bocaux de Coplin sur la glace avec 40 ml chacun de tampon PBS, CSK glacée (PIPES 10 mM, pH 6,8; NaCl 100 mM; mM de saccharose 300; 3 mM MgCl 2), et la zone tampon CSKT (tampon CSK avec 0,5% de Triton X-100), respectivement.
  9. Après la cytospin est terminée, transférer rapidement le glissement vers PBS glacé et incuber pendant 5 min.
  10. Placer les lames dans le tampon CSK glacée et incuber pendant 1 min.
  11. Placer les lames dans le tampon CSKT glacée et incuber pendant 5 min.
  12. Transférer le retomber dans glacée CSK buffert et incuber pendant 1 min.
  13. Transférer la diapositive dans 4% de paraformaldehyde dans du PBS et incuber pendant 10 min à température ambiante.

3. immunofluorescence

  1. Placer les lames dans une jarre de Coplin avec du PBST (1x PBS avec 0,1% de Tween-20) pour plusieurs sec.
  2. Placer les lames à une inclinaison permettant tampon restant à se écouler sur le toboggan. Essuyez soigneusement l'excès de liquide hors de la diapositive et placez-le dans une boîte pipette pointe vide avec de l'eau. Superposez la lame avec 40 ul de la solution de blocage (PBS 1x, 1% de BSA, 0,1% de Tween-20), placer délicatement une lamelle, et incuber pendant 10 min à température ambiante.
  3. Retirer la lamelle, retirez la solution de blocage, et ajouter 40 ul de l'anticorps primaire Histone H3K27me3 dilué à une concentration de 1: 500 dans une solution de blocage. Placer la lamelle couvre-objet sur la lame arrière et incuber pendant 30 min à température ambiante.
    REMARQUE: Un inhibiteur de RNase dans la solution de blocage peut être utile pour préserver l'ARN dans cet ARN FISH protocole lorsque les anticorps polyclonaux sont utilisés.
  4. Laver glisser deux fois dans des bocaux de Coplin remplis avec du PBST, pendant 5 minutes chacune, secouant doucement pendant le lavage.
  5. Placer les lames à une inclinaison permettant tampon restant à se écouler sur le toboggan. Essuyez soigneusement l'excès de liquide et placer la lame dans la boîte de pointe. Superposition avec 40 pi de l'anticorps secondaire (1: 500) dilué dans une solution de blocage, placez une lamelle, et incuber pendant 15 minutes dans l'obscurité. Pour les étapes suivantes, garder la lame dans l'obscurité à tout moment.
  6. Laver deux fois en COPLIN bocaux avec du PBST comme dans l'étape 3.4.

4. ARN FISH avec sondes oligonucléotidiques

  1. Préchauffer une boîte pipette pointe vide avec de l'eau au fond pour empêcher les glissements de sécher à 37 ° C pour l'ARN FISH à l'étape 4.3.
  2. Placer les lames à une inclinaison permettant tampon restant à se écouler sur le toboggan. Essuyez soigneusement l'excès de liquide de la lame de l'étape 3.6 et placer la lame dans la boîte pipette pointe avec water au fond. Ajouter 500 ul de tampon de lavage FISH (10% de formamide dans du SSC 2x) sur la lame et incuber pendant 5 minutes à température ambiante.
  3. Retirer la solution de lavage de FISH, ajouter 8 pi de sondes d'oligonucléotides sur la diapositive, placez une lamelle, et transférer la diapositive à une boîte préchauffé pipette pointe avec de l'eau au fond; incuber à 37 ° C pendant 1-2 h.
  4. Placez trois bocaux de Coplin pré-chauffé dans un bain d'eau à 37 ° C avec un tampon de lavage de poisson, tampon de lavage avec du DAPI, et 2x SSC.
  5. Après 1-2 heures d'incubation pour l'ARN FISH, mettre la lame dans le tampon préchauffé lavage FISH.
  6. Incuber la lame pendant quelques minutes jusqu'à ce que la lamelle se détache de la diapositive.
  7. Placer la lame de nouveau dans le tampon de lavage, et continuer l'incubation pendant 5 min.
  8. Transférer la diapositive à l'autre bocal de Coplin avec un tampon de lavage FISH préchauffé avec 0,5 ng / ml DAPI et incuber pendant 5 min.
  9. Transférer la diapositive à l'autre bocal de Coplin avec 2x SSC préchauffé et incuber pendant 5 kmn.
  10. Placer les lames à une inclinaison permettant tampon restant à se écouler sur le toboggan. Essuyez soigneusement l'excès de liquide et placer la lame de nouveau dans une zone de la pointe sèche. Ajouter 4 pi de antifade avec DAPI sur la lame et placez une lamelle.
  11. Sceller la lamelle avec du vernis à ongles et d'observer sous un microscope. Le coulisseau peut être stocké à 4 ° C dans l'obscurité pendant quelques mois.

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Résultats

Des images représentatives de rapide immuno-FISH sont présentés dans la figure 1A. Co-localisation du nuage et H3K27me3 signaux ARN Xist sur le Xi a été détecté dans la différenciation des cellules femelles. Au jour 12 lors de la différenciation, plus de 90% des cellules EB avait un nuage Xist (figure 1B). Des sondes oligonucléotidiques courtes efficacement pénétré dans le noyau, ce qui conduit à une visualisation de la quasi-totalité des signaux H3K27me3 co-localisée avec l'ARN Xist

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Discussion

Dans cet article, nous avons présenté un rapide protocole immuno-FISH qui prend moins de 5 h pour compléter la préparation des lames, ARN Xist FISH, et l'immunofluorescence pour H3K27me3. En comparaison avec l'approche générale immuno-FISH pour les ARN Xist détection, qui a généralement besoin d'une nuit d'incubation pour l'ARN FISH, ce protocole non seulement réduit considérablement le temps passé, mais améliore également la sensibilité du système immunitaire FISH utilisant des sondes oligonucléotid...

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Déclarations de divulgation

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Remerciements

Nous remercions Hongjae Sunwoo pour ses conseils utiles pour la conception d’oligonucléotides dans l’ARN FISH. Nous remercions également Serenity Curtis pour l’édition du manuscrit. N.Y. a été soutenu par une bourse postdoctorale pour la recherche à l’étranger de la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS). Ce travail a été soutenu par le NIH (RO1-GM102184), la Fondation de recherche March of Dimes (#6-FY12-337), et le Fonds de développement et la subvention du fiduciaire du Centre médical de l’Hôpital pour enfants de Cincinnati à Y.O.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
oligonucléotides avec modification 5'-aminoIDT
Alexa Fluor 488 Colorant réactifLife TechnologiesA32750
MicroSpin G-25 colonnesGE Healthcare27-5325-01
Cytospin 2Shandon59900102
Albumine sérique bovine, biologie moléculaire Qualité (pour tampon d’hybridation)Roche
Histone H3K27me3 anticorpsActive Motif61017
Alexa Fluor 555 Chèvre Anti-souris, hautement adsorbécroisé Life TechnologiesA21424
ProLong Gold réactif anti-décolorationLife TechnologiesP36931
10715859103

Références

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