Fluorescent rapide In Situ Protocole hybridation pour ARN Xist combinée avec d'immunofluorescence Histone Modification dans inactivation du chromosome X

Résumé

Nous avons développé un protocole d’hybridation in situ fluorescente (FISH) spécifique au brin facilement personnalisable combiné à l’immunofluorescence. Cela permet un examen détaillé de la dynamique de l’ARN avec un aperçu simultané de la structure de la chromatine, de l’organisation nucléaire et de la régulation transcriptionnelle au niveau de la cellule unique.

Résumé

Combinant ARN hybridation fluorescente in situ (FISH) avec immunofluorescence (immuno-FISH) crée une technique qui peut être utilisé au niveau de la cellule unique pour détecter les dynamiques spatiales de localisation d'ARN avec perspicacité simultanée dans la localisation de protéines, les modifications épigénétiques et autres détails qui peut être mis en évidence par immunofluorescence. Inactivation du chromosome X est un paradigme de longue ARN non codant (lncRNA) silençage génique médiée. transcrit spécifique (Xist) accumulation de lncRNA X-inactive (appelé un nuage Xist) sur l'un des deux chromosomes X chez les femelles-mammifères est une étape critique pour initier inactivation du chromosome X. ARN Xist interagit directement ou indirectement avec diverses enzymes de modification de la chromatine et introduit paysages épigénétiques distinctes au chromosome X inactif (Xi). Une des caractéristiques de l'épigénétique connu Xi est l'histone H3 lysine triméthyl-27 (H3K27me3) modification. Ici, nous décrivons un immuno-FISH simple et rapideprotocole pour la détection de l'ARN Xist en utilisant l'ARN FISH avec plusieurs sondes d'oligonucléotides couplés avec immunofluorescence de H3K27me3 d'examiner la localisation des ARN Xist et des modifications épigénétiques associées. Utilisant des sondes oligonucléotidiques se traduit par un temps d'incubation plus courte et une détection plus sensible de l'ARN Xist rapport au transcrit in vitro des sondes d'ARN (des ribosondes). Ce protocole fournit un outil puissant pour comprendre la dynamique de lncRNAs et sa modification épigénétique associé, la structure de la chromatine, organisation nucléaire et la régulation transcriptionnelle.

Introduction

Mammalian inactivation du chromosome X (XCI) est une stratégie pour compenser le déséquilibre de dosage de gène lié à l'X entre XX et XY, dans lequel l'un des deux chromosomes X chez les femelles est transcriptionnellement ¹ inactivé. Inactivation du chromosome X est un système modèle très longtemps ARN non codant (lncRNA) recherche. Inactivation du chromosome X est réglementée par de multiples lncRNAs, et a été largement étudiée au cours des dernières décennies à découvrir les mécanismes de diaphonie entre lncRNAs, la transcription, la structure de la chromatine et l'organisation nucléaire ^{2, 3.}

Le centr....

Protocole

1. Préparation de la sonde

1. Obtenir de multiples oligonucléotides uniques dans Xist (oligonucléotides 20-30 nucléotides de longueur, de 63 à 65 ºC température de fusion, tableau 1) avec une modification 5'-amino et de suspendre dans l'eau.
2. Piscine quantités équimolaires d'oligonucléotides avec 5'-amino modification (total 4,5 ug) et étiqueter avec colorant fluorescent amine réactive en suivant les instructions du fabricant.
   1. Dissoudre les oligonucléotides regroupés dans Final 5 pi d'eau sans nucléase et ajouter 3 pl de 1 M de bicarbonate de sodium à la solution d'oligonucléotide.
   2. Ajouter 2....

Résultats

Des images représentatives de rapide immuno-FISH sont présentés dans la figure 1A. Co-localisation du nuage et H3K27me3 signaux ARN Xist sur le Xi a été détecté dans la différenciation des cellules femelles. Au jour 12 lors de la différenciation, plus de 90% des cellules EB avait un nuage Xist (figure 1B). Des sondes oligonucléotidiques courtes efficacement pénétré dans le noyau, ce qui conduit à une visualisation de la quasi-totalité des signaux H3K27me3 co-localisée avec l'ARN Xist

Discussion

Dans cet article, nous avons présenté un rapide protocole immuno-FISH qui prend moins de 5 h pour compléter la préparation des lames, ARN Xist FISH, et l'immunofluorescence pour H3K27me3. En comparaison avec l'approche générale immuno-FISH pour les ARN Xist détection, qui a généralement besoin d'une nuit d'incubation pour l'ARN FISH, ce protocole non seulement réduit considérablement le temps passé, mais améliore également la sensibilité du système immunitaire FISH utilisant des sondes oligonucléotid.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
oligonucléotides avec modification 5'-amino	IDT
Alexa Fluor 488 Colorant réactif	Life Technologies	A32750
MicroSpin G-25 colonnes	GE Healthcare	27-5325-01
Cytospin 2	Shandon	59900102
Albumine sérique bovine, biologie moléculaire Qualité (pour tampon d’hybridation)	Roche
Histone H3K27me3 anticorps	Active Motif	61017
Alexa Fluor 555 Chèvre Anti-souris, hautement adsorbé	croisé Life Technologies	A21424
ProLong Gold réactif anti-décoloration	Life Technologies	P36931

10715859103