Larvaire interférence de l'ARN dans le rouge de la farine Beetle, Tribolium castaneum

Résumé

l'interférence ARN (ARNi) techniques de gènes knockdown-based sont au cœur de la recherche Tribolium. Ici, nous donnons un aperçu de notre technique ARNi larvaire dans Tribolium castaneum. Larvaire ARNi est une technique simple, mais puissant qui permet d'accéder rapidement à des phénotypes perte de fonction, ce qui permet aux chercheurs d'étudier les fonctions des gènes dans divers contextes.

Résumé

Le coléoptère rouge de la farine, Tribolium castaneum, propose un répertoire d'outils expérimentaux pour les études génétiques et de développement, y compris une séquence entièrement annotée du génome, transgénèse à base de transposons, et l'interférence ARN efficace (ARNi). Parmi ces avantages, les techniques de gènes knockdown basés sur l'ARNi sont au cœur de la recherche Tribolium. T. castaneum montrer une réponse de RNAi systémique robuste, ce qui permet d'effectuer l'ARNi à n'importe quelle étape de la vie par simple injection de l'ARN double brin (ARNdb) dans une cavité du corps de l'insecte.

Dans ce rapport, nous présentons un aperçu de notre technique ARNi larvaire dans T. castaneum. Le protocole comprend: (i) l'isolement de la phase appropriée de T. larves de castaneum pour injection, (ii) la préparation pour le réglage de l'injection, et (iii) l'injection de l'ARN double brin. Larvaire ARNi est une technique simple, mais puissant qui nous permet d'accéder rapidement à phenotyp perte de fonctiones, dont plusieurs phénotypes knockdown de gènes ainsi que d'une série de phénotypes hypomorphic. Comme pratiquement tous les T. tissus castaneum sont sensibles à extracellulaire ARN double brin, la technique ARNi larvaire permet aux chercheurs d'étudier une grande variété de tissus dans divers contextes, y compris la base génétique des réponses organismales à l'environnement extérieur. En outre, la simplicité de cette technique stimule plus la participation des étudiants à la recherche, ce qui rend T. castaneum un système génétique idéal pour une utilisation dans une salle de classe.

Introduction

Le coléoptère rouge de la farine, Tribolium castaneum, gagne en popularité dans divers domaines de la biologie en partie à cause de la facilité d'effectuer l'interférence ARN (ARNi) ^1-3. Techniques de gènes knockdown base ARNi permettent aux scientifiques d'effectuer perte de fonction analyse sans utiliser des méthodes génétiques complexes. T. castaneum montrer une réponse de RNAi systémique robuste, ce qui permet d'effectuer l'ARNi à tout moment par simple injection d'ARN double brin (ARNdb) dans une cavité du corps de l'insecte ^4-6. Knockdown simultanée de plusieurs gènes est également possible en T. castaneum par injection de deux ou plusieurs molécules d'ARN double brin différents dans le même temps ^7,8. En outre, une série de phénotypes hypomorphic peut être généré par réduction de la concentration d'ARNdb injecté ^8. Ces caractéristiques font de techniques de génétique inverse à base ARNi des alternatives intéressantes à la génétique à terme traditionnels en T. castaneum. Comme la quasi-tout T. castaneum tissus sont sensibles à des molécules d'ARNdb extracellulaires ^9, cette technique permet aux chercheurs d'étudier un grand nombre de tissus dans divers contextes. En outre, bien que ce rapport met l'accent sur ​​l'exécution de l'ARNi dans T. castaneum, de nombreuses procédures décrites ici sont applicables à d'autres insectes. Par conséquent, ce protocole est utile pour ceux qui souhaitent effectuer perte de fonction des analyses dans leur contexte d'intérêt en T. castaneum, ainsi que pour les chercheurs qui souhaitent appliquer une technique basée sur l'ARNi à d'autres insectes.

L'injection de l'ARN double brin dans les larves permet l'analyse fonctionnelle à des stades différents de la vie de scarabée, dont la larve, et met en scène des adultes ^4,5,10. Nous avons précédemment rapporté notre protocole de RNAi larvaire global, y compris les procédures de biologie moléculaire ^11. Dans le présent rapport, nous nous concentrons sur la description des procédures d'injection d'ARN double brin, qui sont les mieux expliquées avec des aides visuelles. Nous fournissonsprocédures détaillées étape par étape injection ainsi que des exemples de bonnes et de mauvaises injection. Ce protocole visuelle complète notre protocole précédent, et lorsqu'ils sont combinés, ils fournissent une vue plus complète des procédures ARNi larvaires dans T. castaneum. En outre, nous discutons de paramètres pour les molécules d'ARN double brin qui pourraient affecter le succès de l'ARNi, l'application de tests basés sur l'ARNi pour la recherche en physiologie, ainsi que l'applicabilité du protocole d'ARNi larvaire dans un laboratoire d'enseignement.

Protocole

1 T. Stocks castaneum et la culture

1. Décider d'un T. souche castaneum à utiliser pour l'expérience.
   NOTE: Plusieurs T. de laboratoire établi souches castaneum sont disponibles. Ga-1 (Géorgie-1) est la souche parentale de Ga-2 qui a été utilisé pour séquençage du génome ^3. Depuis Ga-1 part la plupart des polymorphismes de l'ADN (tels que des polymorphismes nucléotidiques simples, ou SNP) avec Ga-2, et est plus sain que Ga-2 en raison de moins consanguinité, il est idéal pour les expériences de RNAi. Pu-11 est une autre souche pratique à utiliser , comme la protéine fluorescente jaune (EYFP) expression accrue unique dans l'avenir primordia de l'aile permet de distinguer le dernier stade larvaire d'autres stades (voir Figure S4 de Clark-Hachtel et al. 2013 ^12). Il est important de documenter ce qui coléoptère souche a été utilisée dans l'expérience, en tant que fonds génétiques semblent nettement affect RNAi phénotypes ^13.
2. Préparer T. castaneum farine de culture par addition de 5% (en poids) de la levure de bière pré-tamisée à la farine de blé entier organique (après mélange, stocker la farine de culture à -20 ° C). Aliquoter la farine de culture (à température ambiante) dans six onces bouteilles en plastique Drosophila d'achat d'actions (environ 40 g / bouteille).
3. Culture T. castaneum à 30 ° C avec 70% d'humidité. Utilisez un incubateur à humidité contrôlée, si possible. Ajouter 30-40 adultes par flacon de culture (ratio mâle: femelle 1: 1) pour démarrer la culture.
   NOTE: Bien que la moisissure est rarement un problème à 30 ° C, des températures plus basses (par exemple 25 ° C) avec 70% d'humidité peut provoquer la croissance de moisissures dans la farine de culture. Abaisser l'humidité si cela se produit.
4. Transférer les adultes à un nouveau flacon de culture toutes les deux semaines pour le repiquage (voir l'étape 5.2 à 5.5 pour savoir comment isoler les adultes à partir de farine de culture).
   NOTE: Il faut environ trois semaines pour obtenir le dernier stade larvaire. Alternatvement, T. castaneum cultures peuvent être conservés à une température inférieure (20-25 ° C), mais avec une période plus longue mise en culture (temps de développement à 25 ° C est d'environ le double de celui à 30 ° C).

2 Préparation des solutions et instruments pour larvaire ARNdb injection

1. Synthétiser des molécules d'ARNdb homologues au gène cible par transcription in vitro. Stocker à -80 ° C. Voir Philip et Tomoyasu 2011 ¹¹ pour les procédures détaillées de biologie moléculaire. Voir également la discussion d'un certain nombre de paramètres qui doivent être pris en considération lors de la conception des molécules d'ARN double brin.
2. Ajouter 10 ml de tampon phosphate 0,1 M de sodium (pH 7,6 à 25 ° C) en mélangeant 8,5 ml de 1 M de Na ₂ HPO ₄ avec 1,5 ml de 1 M de NaH ₂ PO _4. Vérifier le pH avec un pH-mètre et ajuster en conséquence.
3. Ajouter 1 ml de tampon 10x par injection en mélangeant 10 ul de 0,1 M de tampon phosphate de sodium (pH 7,6 à 25 ° C), 100 _6; l de 0,5 M de KCl, 100 pi de colorant alimentaire vert, et 790 ul d'eau distillée deux fois (le trou DDH ₂ O). Diluer le tampon 10x d'injection pour faire 2x tampon d'injection (200 pi de tampon 10x + d'injection 800 ul trou DDH ₂ O). 10x et stocker à la fois des tampons 2x injection à 4 ° C jusqu'à utilisation.
4. Préparez-it lames de verre.
   1. Couvrir une lame de verre entier avec une forme de colle repositionnable pour préparations injectables larvaires. Pour adultes ou des pupes injections, faire deux bandes minces de colle le long des bords plus longs de la diapositive.
   2. Laissez la colle sécher pendant plusieurs jours, ce qui assure que la colle reste assez collante pour adhérer coléoptères à la diapositive, tout en restant suffisamment souple pour faciliter leur enlèvement après l'injection.
      REMARQUE: Si la colle reste trop collante, utiliser un doigt et tapez sur la colle, ce qui permettra de réduire le pouvoir collant. Chaque diapositive peut contenir jusqu'à 40 ou 50 coléoptères, et peut être réutilisé jusqu'à ce qu'il ne parvient pas à tenir solidement les animaux. Alterntivement, ruban adhésif double face peut également être utilisé, bien que la bande est parfois pas adhésif suffisant pour contenir les larves.
5. Faire un panier etherisation.
   1. Retirez le piston d'une seringue de 10 ml à usage unique, et couper la seringue dans la moitié autour de la ligne 6 ml.
   2. Jeter la moitié inférieure de la seringue. Brièvement chauffer la surface de la partie supérieure de la seringue avec un brûleur à gaz de coupe, et pousser rapidement la matière plastique fondue sur un morceau de maille de nylon pour coller le filet sur la seringue. Coupez l'excédent de maille, une fois le plastique durcit.
6. Préparez la bouteille d'éther. Ajouter 30 ml d'éther dans un goulot étroit de 100 ou 250 ml flacon en verre. Ajouter plusieurs morceaux de papier de soie pour renforcer l'évaporation de l'éther.
   REMARQUE: Ether présente un risque d'incendie et est également néfaste. Toujours manipuler l'éther sous une hotte. Fermez le couvercle hermétiquement lorsqu'il n'est pas utilisé.
   NOTE: La glace peut être utilisé comme une alternative plus sûre (comme dans une salle de classe), bien que le sedation est moins efficace.

3 Préparation de larves d'appareils d'injection

1. Passer une étape mécanique XY sur un microscope à dissection.
   REMARQUE: XY mécanique étapes sont disponibles auprès de grandes entreprises de microscope. Sinon, platines de microscope bon marché peuvent également être utilisés pour la plupart des microscopes de dissection avec quelques modifications (voir le tableau des matériaux par exemple).
2. Placez un manipulateur d'aiguille mécanique près de la scène mécanique XY.
3. Assemblage d'une seringue d'injection. Utilisation d'un robinet à quatre voies (avec des connexions Luer) pour connecter une ml seringue à usage unique 30 à un support d'aiguille de verre, ce qui permet la manipulation de la seringue d'injection, sans affecter la pression dans l'aiguille d'injection (voir Philip et Tomoyasu 2011 ¹¹ de la seringue d'injection détaillée assemblage).

4. aiguilles d'injection de traction

1. Tirez aiguilles de verre borosilicate (B100-50-15, OD: 1 mm, ID: 0,5 mm, 15 cm de longueur) par unextracteur aiguille.
   REMARQUE: Pour Sutter P-87 ou P-97, utilisent le paramètre "Heat = 70, Pull = 45, Vel = 75, Temps = 90" ou suivez le chapitre 2 de la pipette Cookbook: cellules adhérentes, C. elegans, la drosophile, et le poisson-zèbre - programmes recommandés. Les paramètres optimaux varient en fonction du modèle de l'extracteur de l'aiguille. Le réglage de l'aiguille d'injection chez la drosophile générique est un bon point de départ.
2. Magasin tiré aiguilles dans un boîtier en plastique (par exemple, un boîtier de CD en plastique) et le fixer avec du mastic de fixation amovible.

5 Isolement et sélection des larves

1. Placez un tamis n ° 25 sur un récepteur de tamis.
2. Placer le contenu du flacon de culture (coléoptères et de farine de culture) sur le tamis, et tamiser le contenu immédiatement. Ne laissez pas le contenu sur le tamis sans tamisage, car les larves rapidement essayer de creuser à travers le tamis et se coincer. Tamiser agressivement le contenu à laisser tomber la farineà travers et laisser les larves plus âgées (généralement de 6 ^ème et 7 ^ème stade larvaire), les nymphes et les adultes (avec leurs cuticules du casting-off, exuvies) derrière sur le tamis.
3. Transférer le matériel restant sur le tamis (scarabées et exuvies) pour le bac de semences. Continuez à taper sur la casserole pour empêcher les insectes de s'échapper.
4. Retirez le exuvies et les particules de farine restant sur la surface des coléoptères par soufflant doucement sur le plateau de semences.
5. Appuyez sur le carter d'amorçage pour déplacer le contenu vers le fond de la casserole. Ensuite, laissez la casserole inexploité pendant plusieurs secondes. Attendez que les adultes, qui sont plus mobiles que les autres étapes, à sortir de la pile. Retirer adultes en utilisant un pinceau de l'art (par exemple, 1 cm de largeur).
6. Nymphes séparé en frappant doucement la casserole de semences tout en gardant la bouche de la casserole légèrement vers le bas, sous forme de pupes ont tendance à rouler plus vite vers la bouche. Utilisez un pinceau pour retirer les nymphes, ne laissant que les larves sur le plateau de semences.
7. Plas les larves isolé dans une boîte de Petri propre. Sélectionnez un stade approprié de larves pour injection et les placer dans une boîte de Pétri séparée.
   REMARQUE: Early dernier stade larvaire (1-2 jours après la mue larvaire) sont souvent approprié lors de l'analyse de l'effet ARNi sur la morphologie des adultes ainsi que sur la métamorphose. Il est cependant parfois nécessaire d'effectuer l'ARNi à l'avant-dernière (ou même plus tôt) étape pour évaluer la fonction du gène précoce (par exemple, les figures 3E-3H. Voir aussi Clark-Hachtel et al. 2013 ^12). Utilisation pupes comme référence de taille pour déterminer le stade de larves. Le dernier stade larvaire sont légèrement plus longues que les pupes. En variante, pu-11 peut être utilisé pour identifier le dernier stade larvaire et pour déterminer l'évolution temporelle de l'évolution du dernier stade larvaire (Figure S4 de Clark-Hachtel et al. 2.013 ^12).
8. Gardez les larves sélectionné dans une boîte de Pétri jusqu'à etherisation. Placez le restede larves et d'autres étapes de coléoptères (tels que les nymphes et les adultes) de nouveau dans un flacon de culture avec de la farine et de le retourner à l'incubateur.

6 Préparation d'aiguilles d'injection

1. Placer une aiguille de verre préalablement tiré sur une lame de microscope en verre en utilisant soit gommette ou un adhésif double face. En utilisant des pinces, tester la fin tiré de l'aiguille tout en regardant dans le microscope à dissection pour voir où les courbes de pointe. Prenez la zone légèrement vers le côté de la pointe de l'endroit où les virages en aiguille avec la pince et tourner à briser.
2. Gardez de bonnes aiguilles et jeter autres. Considérons un bon aiguille ayant une ouverture qui est ni trop grand ni trop petit (environ 0,05 mm de diamètre. Figures 1A et 1B), et est inclinée à rendre la pénétration de la cuticule des larves plus facile (figures 1B et 2A-2B). Envisager une mauvaise aiguille (i) trop petit, ce qui rend l'absorption de la solution ARN double brin dans l'aiguille difficulte (étape 7) (figures 1D et 2D), (ii) trop grande, provoquant des blessures et des larves possible létalité lors de l'injection (figures 1C et 2F), (iii) émoussé, rendant la pénétration de la blessure difficile et de plus en plus cuticule.
3. Insérer l'aiguille dans le porte-aiguille.
   1. Tout d'abord, dévisser la pointe du porte-aiguille et placez l'extrémité arrière de l'aiguille dans la pointe de titulaire. Ensuite, placez le joint en caoutchouc sous la pointe de titulaire (au moins 1 cm de l'extrémité arrière de l'aiguille de verre).
   2. Insérez l'arrière de l'aiguille dans le support, avec le joint d'étanchéité en caoutchouc complètement inséré dans l'ouverture du porte-aiguille. Vissez l'extrémité arrière sur le support.
4. Placer le porte-aiguille monté sur le manipulateur d'aiguille. Maintenir le support d'aiguille proche de l'horizontale. Ajustez la position du manipulateur, de sorte que la pointe de l'aiguille se trouve dans le centre de la vue en regardant à travers le microscope.

7 Solution Frontloading ARN double brin dans l'aiguille

1. Préparer la solution d'injection d'ARNdb juste avant l'injection par l'ajustement de la concentration avec le trou DDH ₂ O et le mélange de la solution avec des volumes égaux d'ARNdb de tampon d'injection 2x (étape 2.3). Conserver la solution mixte sur la glace. Voir la discussion en ce qui concerne la concentration ARN double brin.
2. Couper l'extrémité d'un embout de pipette jetable de 20 pi. Ajouter 10 ul de la solution dans l'embout de pipette garni. Retirez délicatement la pointe de la pipette de la pipette tout en gardant le liquide à la pointe en fournissant une contre-pression. Sinon, retirez délicatement la pointe et de passer ensuite la solution à la fin de la pointe en fournissant une pression avec un doigt.
3. Placez la pointe de la pipette avec la solution ARNdb sur la platine du microscope à l'aide gommette avec l'ouverture vers la pointe de l'aiguille.
4. En regardant à travers le microscope, se déplacer lentement vers la pointe chargé de l'aiguille jusqu'à ce que la pointe de l'aiguille est juste à l'intérieur de la pointe de la pipette et chargé dans la solution.
5. Tout en regardant dans le microscope, tirez doucement sur le piston de la seringue d'injection à tirer lentement la solution ARN double brin dans l'aiguille.
   NOTE: Ne surchargez pas l'aiguille. Comme la fin de l'ARN double brin solution se rapproche de la pointe de l'aiguille, ralentir la vitesse de traction et arrêter le chargement de la solution avant la pointe de l'aiguille atteigne air. Si de l'air atteint la pointe, la solution sera établi rapidement dans le porte-aiguille, causant des problèmes graves de contamination. Procédures de nettoyage détaillées du porte-aiguille sont décrites dans Philip et Tomoyasu 2011 ^11.
6. Retirer la pression de la seringue d'injection et le porte-aiguille par l'ouverture du robinet d'arrêt. Ensuite, déplacez la pointe de la pipette de la pointe de l'aiguille. Relevez l'aiguille en place de la scène pour éviter d'endommager accidentellement l'aiguille tout en plaçant les larves sur la scène. Retirez la pointe de la pipette vide de la scène.

8. ARNdb injection

1. Placez les larves dans le panier de etherisation. Utilisez moins de 10 larves si l'apprentissage de la technique. Utilisez 30-40 larves en un seul tour, une fois à l'aise avec la technique.
2. Placez le panier de larves dans la bouteille d'éther et fermer le couvercle.
   REMARQUE: Ether présente un risque d'incendie et est également néfaste. Effectuez cette étape sous une hotte.
3. Larves étheriser pendant environ 3 min. Vérifiez les larves de mouvement après 3 min. Placez-les dans la bouteille d'éther pour un autre 30 secondes si elles sont toujours en mouvement. Ne pas étheriser plus de 5 min, car cela pourrait augmenter la létalité.
   REMARQUE: Le temps de etherisation optimal peut varier en fonction de la température et de l'humidité.
4. Transférer les larves éthérée du panier au bord antiadhésive d'une lame de verre collante. En utilisant des pinces et en regardant dans le microscope, ramasser chacun de larves par un et les placer sur la diapositive. Disposez-les latéralement et tapoter sur leurs corps ftête de rom à la queue avec les pinces, les étirant légèrement que vous allez, pour s'assurer qu'ils sont fixés sur la lame.
5. Placer la lame collant avec des larves sur la platine du microscope.
6. Insérez l'aiguille chargée ARNdb doucement dans la face dorsale de la larve pour éviter d'endommager le système nerveux central. Evitez également la ligne médiane dorsale, comme le cœur larvaire se trouve ici. Dans cette étape et les suivantes, en utilisant toujours la scène à déplacer les larves à l'aiguille (au lieu d'utiliser le manipulateur d'aiguille pour déplacer l'aiguille).
   REMARQUE: Le site d'injection spécifique n'a pas d'importance que l'ARNi dans T. castaneum semble être systémique. Cependant, il est généralement plus facile à injecter dans la face dorsale des segments thoraciques ou abdominales.
7. Après l'insertion de l'aiguille dans les larves, retirez l'aiguille légèrement vers l'arrière pour laisser place à l'ARN double brin à entrer dans la cavité de corps de la larve.
8. Pousser doucement sur la seringue d'injection jusqu'à ce que la couleur verte des larves de tour (ou la couleur de la mémoire tampon d'injection) et de regardertretched et complet.
   REMARQUE: Si l'apprentissage de la technique, essayer d'injecter autant que possible afin de déterminer la quantité de solution qui peut être injecté dans une larve sans létalité importante. Il est généralement d'environ 0,5-0,7 pi.
9. Retirez l'aiguille de la larve. Lors du retrait de l'aiguille, tirez légèrement sur la seringue d'injection pour éviter la perte ARN double brin (être aussi attention à ne pas tirer en l'air).
10. Injecter toutes les larves de la diapositive. Veillez à supprimer les larves qui n'ont pas été injecté avec succès. Injection complète avant que les larves se réveiller (environ 10 min).
11. Retirer la lame de larves injecté du microscope d'injection et laisser la lame pendant 5 min jusqu'à ce que plus toutes les larves se remettre de la etherisation.
12. Avec des pinces et sous un microscope de dissection, soulevez doucement les larves de la tête à la queue pour les libérer de la diapositive collante. Placez les larves nouvellement libérés dans une boîte de Petri propre. Laisser les larves sur la boîte de Pétri pendant 10-15 minutes pour permettre l'injection wplaies à coaguler.
13. Passer les larves dans un nouveau flacon avec de la farine et propre étiquette appropriée, y compris le nom de la souche, le type d'ARNdb injecté, la concentration de l'ARN double brin, le nombre de larves injectées, et la date.
14. Culture du larves injecté à 30 ° C avec 70% d'humidité. Respecter les larves des phénotypes ARNi régulièrement.
    NOTE: La dernière nymphose de stade dans les 7 jours. Ensuite, les nymphes se Eclose en adultes après 7 jours (s'il n'y a pas d'anomalie dans le calendrier causée par ARNi).

9 Confirmation de sacrifiés et phénotypiques analyses

1. Envisager d'évaluer l'efficacité de l'ARNi abattre par plusieurs différentes techniques de biologie moléculaire, tels que quantitative de transcription inverse-PCR (qRT-PCR) et Western Blot. Voir Miller et al. 2012 ⁷ et Philip et Tomoyasu 2011 ¹¹ pour détaillé qPCR et Western Blot protocole, respectivement.
2. Analyser les phénotypes liés ARNi.
   REMARQUE: ARNi connexesphénotypes peuvent être observées à plusieurs étapes et sous différentes conditions de culture, en fonction des gènes qui ont été ciblées. ARNi peut affecter le dendroctone morphologie, la métamorphose, la physiologie et le comportement. Combien de fois la présence du phénotype est cochée et dans quelles conditions les coléoptères sont élevés doivent être adaptées aux questions précises objet d'une enquête par l'ARNi.

Résultats

Une des étapes clés pour l'injection réussie est de faire une bonne aiguille. Comme décrit dans l'étape 6, la pointe de l'aiguille doit être cassé avant l'injection de T. castaneum. Des exemples de bonnes et de mauvaises aiguilles sont présentés dans la figure 1. Une bonne aiguille a une pointe acérée et rigide, avec un diamètre d'ouverture d'environ 0,05 mm (figure 1B).

La figure 2 présente une injection réussie (Figures 2A et 2B), ainsi que plusieurs cas d'injections infructueuses (figures 2C-2F). Avec une aiguille d'injection de taille appropriée, la pointe de l'aiguille pénètre dans la cuticule des larves avec une résistance minimale (figure 2A), et la solution d'ARNdb (vert) s'écoule dans les larves sans fuite (figure 2B). Ne pas sur injection, car il provoquer un débordement de la solution ARNdb même avec une aiguille d'injection de taille appropriée (Figure2C). Si la pointe de l'aiguille est trop mince, la pointe de l'aiguille échoue souvent à pénétrer la cuticule et coudes larvaire, ce qui rend difficile l'injection (figure 2D). Si cela se produit, tailler la pointe de l'aiguille est parfois utile. Les aiguilles sont souvent encore utilisables, mais avec quelques difficultés à pénétrer la cuticule larvaire (figure 2E). Cependant, une grande quantité de la solution ARNdb est facilement poussée hors de l'aiguille même avec une légère pression sur la seringue d'injection, ce qui entraîne souvent un trop-plein de la solution d'ARNdb (figure 2F).

Lors de l'ARNi, il est important d'avoir un contrôle positif pour déterminer que l'ARNi fonctionne correctement, et un témoin négatif pour vérifier que l'effet observé n'est pas un effet non spécifique de l'ARN double brin ou une suite de procédures d'injection (tels que le dommage causé par injection, ou une anomalie de etherisation). L'injection d'ARNdb ciblant EYFP peut servir d'bon contrôle positif lors de l'utilisation de la pu-11 souche ^5,7. Lorsque EYFP ARNdb est injecté dans le dernier stade larvaire, une réduction significative de signal de EYFP dans les futures primordia des ailes peut être observée dès une post-injection de jours (Figure 3A). Le knockdown de EYFP est terminée deux jours après l'injection de l'ARN double brin EYFP (figure 3B) et ce knockdown persiste à travers le stade de pupe (figures 3C et 3D) et tout au long de la vie de l'insecte si la concentration ARNdb est suffisamment élevée (par exemple 1 ug / ul) ^7. EYFP ARNdb peut également être utilisé en tant que contrôle négatif comme il s'agit d'une séquence d'un gène non endogène et ne doit pas provoquer des perturbations morphologiques et physiologiques (figures 3A-3D).

Nous avons fourni des images de larves ARNi pour résiduelle (VG), un gène de l'aile critique ^12, comme un autre exemple de la façon efcaces cette technique ARNi basée injection est en T. castaneum. Lorsque l'ARN double brin pour vg est injecté dans les larves de avant-dernière étape (une étape avant le dernier stade larvaire), une perte complète des structures d'ailes peut être observée au stade de pupe (figures 3E et 3F). L'adulte résultant manque aussi complètement des structures d'ailes (figures 3G et 3H). Le résultat ARNi pour vg illustre à la fois la robustesse et la nature systémique de l'ARNi dans T. castaneum.

Figure 1: (A) Exemples d'aiguilles non brisées, bonnes et mauvaises (B) La pointe d'une bonne aiguille bien cassé (C) La pointe d'une aiguille brisée qui est trop grand et pointu (D) La pointe... d'une faillite aiguille de n qui est trop mince. Les barres d'échelle (rouge) sont de 0,05 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2:... (A) une aiguille d'injection de taille appropriée insérée dans le dernier stade larvaire (B) Larve injecté de manière appropriée avec la solution vert ARNdb (C) de débordement de la solution de l'ARN double brin au niveau du point causée par la sur-injection injection (D ) d'une aiguille fine pour ne pas pénétrer dans la cuticule des larves. (E) Une grande aiguille d'injection insérée dans le dernier stade larvaire. (F) Larve injecté avec une aiguille, entraînant le débordement et la fuite de la solution d'ARNdb. Les flèches indiquent les aiguilles.ove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg "target =" _blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: Exemples de réussite ARNi dans T. castaneum. (AD) Dernière injection larvaire des résultats EYFP ARN double brin dans une réduction de l'expression de EYFP. (A) Les larves un jour après l'injection. (B) Les larves deux jours après l'injection. (C) pupes de contrôle. (D) chrysalides résultant de injection larvaire EYFP ARN double brin. Les témoins négatifs sont l'injection de la mémoire tampon (A, B) et l'introduction d'ARNdb DsRed (C, D). Pointes de flèches et des flèches indiquent l'expression de EYFP ou son absence dans les ébauches et les yeux aile, respectivement. (EH) Penultime larvaire ARNi pour vg. (E) de type sauvage chrysalide. (F) vg ARNi chrysalide. Le manque de structures d'ailes est déjà visible au stade de pupe (flèche). G) de type sauvage adulte. (H) vg ARNi adulte. structures d'ailes liées sont complètement absentes (flèche). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Il ya un certain nombre de questions importantes qui doivent être pris en compte pour garantir le succès de l'ARNi, dont la longueur et la concentration des molécules d'ARN double brin, la concurrence entre les différentes molécules d'ARN double brin (lors de la tentative multiples abattre), et la possibilité de hors-cible Effets (OTE).

ARNdb Longueur

La longueur des molécules d'ARNdb affecte l'efficacité de la réponse systémique ARNi, avec un ARN double brin plus long étant plus efficace pour déclencher l'ARNi ^7,14,15 (bien que la limite plus d'ARNdb est actuellement inconnue). La longueur d'ARNdb a besoin d'être plus longue que 50 pb pour induire l'ARNi efficace en T. castaneum ^7. ARNdb de 150 pb et 500 pb semble être idéale pour des expériences d'ARNi. Bien que plus des molécules d'ARN double brin peuvent également être utilisés, ils auront une plus grande chance de l'OTE et l'étape de gène clonage va devenir de plus en plus difficile.

ARN double brin Concentration

ve_content "> Différents degrés de knock-down de gènes peuvent être obtenues en fonction de la concentration de l'ARN double brin. 1 ug / apparaît ul à une concentration de départ raisonnable, ce qui produit souvent un phénotype quasi-nulle (peut varier selon le gène (s) d'intérêt ). ARNi peut être effectuée avec une concentration plus élevée (par exemple, 7-8 ug / ul), pour obtenir un fort phénotype ARNi. ARNi avec une dilution en série de l'ARN double brin peut parfois être intéressant de réaliser une série de phénotypes hypomorphic de données supplémentaires (Tomoyasu et al., 2009 ^8, et Borràs-Castells, données inédites).

ARNi concurrence

Knockdown de gènes multiples peut être réalisé en T. castaneum en injectant plusieurs molécules d'ARN double brin différents simultanément. Cependant, il est également connu que la présence de plusieurs molécules d'ARNdb différents présents au sein de l'organisme se traduit souvent par la compétition entre les ARN double brin pour l'accès aux composants d'ARNi 7,14. Il est important d'utiliser la même longueur et la même concentration pour tous les ARN double brin lors d'une tentative knockdown de gènes multiples pour éviter un ARN double brin hors-compétition les autres (bien que d'autres ajustements de la longueur ARN double brin et la concentration peuvent être nécessaires lorsque les niveaux d'expression varient beaucoup les gènes cibles). Nous, ainsi que d'autres, avons effectué avec succès knockdown double et triple (par exemple, Tomoyasu et al., 2005 ^16, Tomoyasu et al., 2009 ^17, et Yang et al., 2009 ^18). Bien que possible, quadruple ARNi (ou plus) pourrait être difficile, car il risquerait vraisemblablement de causer une réduction significative de l'efficacité ARNi pour les quatre gènes cibles.

Off-ciblage

OTE est une préoccupation inhérente aux approches basées sur l'ARNi. Une façon de minimiser OTE est d'identifier les régions dans le gène cible qui partagent des séquences similaires avec d'autres gènes et d'éviter ces régions lors de la conception d'ARNdb. Une analyse BLAST simple contre le T. castaneum prédit ensemble des gènes peut identifier ces régions. Plusieurs outils en ligne permettent également l'évaluation du potentiel OTE (par exemple, E-ARNi ^19). Exécution de l'ARNi pour deux régions non chevauchantes du gène cible est un moyen facile et efficace pour éliminer la possibilité que les phénotypes observés sont causés par l'OTE. La possibilité de l'OTE est minimisé si l'ARNi pour deux régions ne se chevauchent pas produire les mêmes phénotypes (à moins que les deux régions ne se chevauchent pas partager une séquence similaire).

L'évaluation de gène démontable par un moyen autre que les analyses phénotypique est souvent essentiel à des données liées à l'ARNi effectivement présents. Deux principales façons d'évaluer knockdown de gènes sont qRT-PCR et l'analyse Western blot. qRT-PCR est un moyen commode pour mesurer le niveau de l'ARNm cible, et a été utilisé dans de nombreuses études liées ARNi, y compris ceux de T. castaneum (voir Miller et al. 2012 ⁷ par exemple). Howeveuh, il faut être prudent, comme nous l'avons vu récemment des cas où le niveau d'ARNm cible est régulée à la hausse par l'ARNi (si le produit de protéine est régulée à la baisse) (Borràs-Castells données non publiées). Il est actuellement inconnu si cet ARNm ARNi induit une régulation peut être généralisée ou unique de certains gènes. L'analyse Western blot est une autre façon de confirmer knockdown de gènes. Cette méthode est très fiable car il mesure la quantité du produit de la protéine finale. L'exigence d'un anticorps spécifique contre la protéine produite par le gène cible est un inconvénient de cette approche. Utilisation de plusieurs mesures indépendantes en plus à l'analyse phénotypique augmentera la confiance des données phénotypiques obtenues par l'analyse basée sur l'ARNi.

Depuis sa création en T. castaneum, l'ARNi a principalement été utilisée pour étudier la fonction des gènes dans le développement et la formation de structures. Ces T. études sur le développement castaneum ont très bien réussi à caracterizing fonctions évolutives conservées et ont divergé de gènes (revue dans Denell 2008 ¹ et Klingler 2004 ^2). Études basées ARNi Cependant, dans T. castaneum ne sont pas limités à la biologie du développement. Par exemple, l'ARNi peut être utilisée pour étudier la fonction des gènes dans un large éventail de réponses physiologiques et comportementales, y compris la tolérance au stress, la prédation, l'agression, le choix du partenaire, les modèles d'activité, et les mécanismes de défense.

Une difficulté d'appliquer l'ARNi à ces contextes est la probabilité d'effets pléiotropiques. Souvent, les gènes d'intérêt ont une variété de fonctions à travers le T. Cycle de vie du castaneum, permettant ainsi la suppression des gènes sans effets phénotypiques involontaires difficiles. Cependant, la possibilité d'effectuer facilement ARNi à des stades différents peut souvent être une stratégie efficace pour éviter ces effets pléiotropiques. Par exemple, effectuer l'ARNi chez les adultes au lieu de larves ou de pupes pourrait nous permettre de contourner UNINtendance létalité provoquée par knockdown de gènes au cours du développement précoce. La flexibilité de la réponse d'ARNi dans T. castaneum ce qui rendait ce modèle un choix attrayant pour adapter l'ARNi à des expériences de la fonction des gènes dans les réponses physiologiques et comportementales.

Le T. système de castaneum est également idéal pour une utilisation dans un laboratoire d'enseignement. T. castaneum peut être facilement mis en culture sur un mélange de farine / levure à température ambiante (25 ° C) sans repiquage fréquentes, et des techniques d'ARNi dans T. castaneum sont suffisamment simples pour être adapté à un laboratoire avec des jeunes, des scientifiques d'apprentissage. Comme ARNi devient une technique essentielle dans une variété de domaines de la biologie, il est essentiel que les élèves sont exposés à cette technique. La nature straight-forward de la technique ARNi larvaire dans T. castaneum encourage également davantage d'élèves à être impliqués dans la recherche, ce qui rend T. castaneum un candidat de choix pour une salle de classe orientée système génétique.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Farine de blé entier biologique  ;	Heartland Mill Inc. Kansas	G1
Brewer' s levure	MP Biomedicals	2903312	Tamiser la levure avec le tamis en acier inoxydable #35 avant utilisation. Portez un masque de protection et couvrez le tamis d’une pellicule plastique, car la levure tamisée est une particule fine et un danger respiratoire.
6 oz en plastique Drosophila bouteilles en stock	Fisher Scientific	11-888
Tamis	Fisher Scientific  ;	04-881N	8 po de diamètre x 2 po D. Utilisation #25 (Ouverture nominale 710 µ ; m) pour les larves, les pupes et les adultes.
Tamis	Fisher Scientific  ;	04 881 10P	8 po. diamètre #35 (Ouverture nominale : 600 µ ; m)  ; Tamis en acier inoxydable, 8 po. dia. x 2 po.D. Ce tamis est idéal pour éliminer les grumeaux de la poudre de levure.
Récepteur de tamis	Fisher Scientific  ;	04-866B	Bac
d’échantillonnage à bec de 8 po de diamètre 1,5 pinte  ;	Équipement Seedburo Co.	Modèle 33	bac de collecte
Incubateur	BioCold Environmental Inc	BC26-IN	Gardez-le 30 ° ; C avec 70 % d’humidité.
Na2HPO4	Fisher Scientific  ;
NaH2PO4	Fisher Scientific	S397-500
KCl	Fisher Scientific  ;	P217-500
Colorant alimentaire  ;	Kroger		verte, bleue ou rouge de préférence
Lame de verre de microscope.	Fisher Scientific  ;	22-038-103
Tack-It Over& Sur	d’Aleene pour les diapositives		collantes. Le ruban adhésif double face peut être utilisé comme alternative, cependant, nous avons constaté que l’adhérence varie.
Boîtier CD en plastique	Amazon
Boroslilicate verre capillaire	Sutter Instrument	BF100-50-15	D.E. 1 mm, D.I. 0,5 mm, 15 cm. Sans filament
Extracteur d’aiguille	Sutter Instrument	P-87 ou P-97  ;
Mastic de montage amovible  ;	Loctite Fun-Tak
Plumeau à gaz comprimé	OfficeMax	OM96091
Forceps	Fine Science Tool	11231-30	Dumoxel #3 (pour manipuler les coléoptères)
Forceps	Fine Science	Tool 11252-20	INOX #5 (pour casser les pointes d’aiguille)
Éther éthylique, anhydre  ;	Fisher Scientific  ;	E138-500
Maille de nylon	Flystuff/Genessee Scientific	57-102	120 µ ;
Flacon de média, 100 ml	VWR	89000-926
Stéréomicroscope	Zeiss		SteREO Discovery V12. Microscope à injection.
Stéréomicroscope	Fisher/Zeiss	12-070-513  ;	Stemi2000. Utilisez-le pour casser l’aiguille et placer les larves sur la lame collante.
Platine mécanique X-Y  ;	Zeiss	4354600000000000
Platine mécanique X-Y  ;	Microscopenet.com	A512	Manipulateur alternatif bon marché
	Narishige	M-152
Support magnétique	Narishige	GJ-1  ;
Support capillaire en verre	Narishige	IM-H1  ;
Seringue jetable 30 ml	Seringue BD	309650	BD Luer-Lok
Tip Robinet d’arrêt à quatre voies  ;	Cole-Parmer Instrument Co.	EW-30600-03	Robinets d’arrêt avec raccords Luer ; 4 voies ; glissement mâle
Pinceau Art		Pinceau à huile et acrylique Amazon Art Advantage Ensemble de pinceaux à huile et acrylique, 24 pièces	N’importe quel pinceau général fera l’affaire.

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