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Article de méthode

Quantification de Orofacial phénotypes dans Xenopus

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DOI :

10.3791/52062

⸱

6 novembre 2014

 , 
1Biology Department, Virginia Commonwealth University

Dans cet article

Résumé

Procédé pour quantifier la taille et la forme de orofaciale embryons de Xenopus laevis a été développé. Dans ce protocole, les mesures traditionnelles de taille sont combinés avec la morphométrie géométrique pour permettre des analyses plus poussées de développement oro-faciale et des anomalies.

Résumé

Xenopus est devenu un outil important pour disséquer les mécanismes qui régissent le développement cranio-faciale et des anomalies. Une méthode pour quantifier le développement bucco-faciale permettra une analyse plus rigoureuse des phénotypes orofaciaux sur l'abrogation des substances qui peuvent génétiquement ou moléculaire manipuler l'expression des gènes ou la fonction des protéines. L'utilisation de deux images tridimensionnelles des chefs embryonnaires, dimensions telles de taille traditionnels que la largeur bucco-faciale, la hauteur et Area-sont mesurés. En outre, une mesure de la rondeur de l'ouverture de bouche embryonnaire est utilisé pour décrire la forme de la bouche. Morphométrie géométrique de ces images en deux dimensions est également effectuée pour fournir une vue plus sophistiqué de l'évolution de la forme de la région oro-facial. Sites d'intérêt sont affectés à des points spécifiques de la région oro-faciale et coordonnées sont créés. Une analyse en composantes principales est utilisé pour réduire les coordonnées de point de repère aux principaux composants qui constituent une discrimination alors le traitementgroupes. Ces résultats sont affichés sous forme de nuage de points dans lequel les individus avec des formes oro-faciales similaires se regroupent. Il est également utile pour effectuer une analyse discriminante, qui compare statistiquement les positions des points de repère entre les deux groupes de traitement. Cette analyse est affichée sur une grille de transformation où les changements de position de point de repère sont considérés comme des vecteurs. Une grille se superpose à ces vecteurs de sorte qu'un motif de déformation est affichée pour montrer où les positions historiques importantes ont changé. les changements de forme dans l'analyse de la fonction discriminante sont basées sur une mesure statistique, et peuvent donc être évalués par un p-valeur. Cette analyse est simple et accessible, nécessitant seulement un stéréoscope et logiciel freeware, et donc sera une recherche et d'enseignement ressource précieuse.

Introduction

Parmi les types les plus répandus et les plus dévastatrices de malformations congénitales humaines sont celles qui touchent la bouche et du visage, comme les fentes faciales 1. Les enfants atteints de malformations oro-faciales structures subissent des chirurgies multiples tout au long de leur durée de vie et luttent avec défigurations faciales, de la parole, de l'ouïe et des problèmes d'alimentation. Par conséquent, faciliter de nouvelles recherches dans le développement cranio et oro-facial est primordiale pour la prévention et le traitement de ces types d'anomalies congénitales chez les humains. Xenopus laevis a émergé comme un nouvel outil pour disséquer les mécanismes qui régissent le développement cranio-facial (quelques exemples 2,3,4 -11). Par conséquent, une méthode quantitative pour analyser taille et la forme des changements au cours du développement de la tête et le visage de cette espèce pourrait être très puissant 3.

Ici, nous présentons une telle méthode; combinant les mesures de taille traditionnels avec la morphométrie géométrique adaptées d'une étude Xenopus 12 et un grand nombre d'études analysant la forme du visage humain 13-15. Le but de ce protocole est de permettre aux chercheurs de quantifier la taille du visage et des formes de distinction entre les différents phénotypes oro-faciales au cours du développement normal et anormal. Cette analyse permettra de mieux différencier les défauts cranio-faciales subtiles telles que celles découlant des effets synergiques de gènes et / ou des facteurs environnementaux. En outre, cette méthode de quantification pourrait également révéler même légère amélioration ou de sauvetage d'un défaut oro-facial. Ceci permet donc un guide utile dans l'analyse des agents thérapeutiques potentiels.

La combinaison de mesures faciales et morphométrie géométrique que nous présentons ici permet une analyse statistique plus complet de la taille et la forme de la région oro-faciale que les protocoles actuels qui utilisent en grande partie l'un ou l'autre 15-18. En outre, nous présentons une méthode simple pour évaluer à la fois la médiane et plans latéraux dele visage sans nécessiter d'équipement d'imagerie en trois dimensions sophistiqués utilisés dans les études actuelles 13,19.

Nous démontrons ce protocole sur Xenopus laevis embryons traités avec un inhibiteur du récepteur de l'acide rétinoïque qui induit le développement bucco-faciale anormale et une fente palatine 2,3 médian. La quantification des dimensions et de la forme de la région orofaciale dans ces embryons ont révélé des changements dans le milieu du visage qui est analogue à l'homme avec des fentes palatines similaires et des modèles de souris 20,21. Cependant, ce protocole peut être utilisé pour évaluer les effets d'autres composés sur le développement orofaciale, tels que des substances naturelles, des herbicides ou des protéines telles que des facteurs de croissance. En outre, la taille et de la forme change oro-faciales résultant de la perturbation de l'expression des gènes par la perte ou le gain d'expériences de fonction (en utilisant morpholinos antisens ou bacs à légumes / Talens) peuvent également être quantifiés en utilisant ce protocole. Enfin, nous avons développé cette méthode specifically à évaluer Xenopus morphologie; cependant, il est facilement modifiée pour l'analyse de tout vertébré. D'autres applications pourraient aussi inclure l'utilisation de ce protocole pour comparer espèces étroitement apparentées pour les études évolutives ou écologiques. Bien que l'exemple que nous fournissons ici utilise ce protocole pour décrire l'analyse de la région oro-faciale, il pourrait facilement être modifié pour l'analyse d'autres régions, des organes ou structures.

Ce protocole de quantification orofaciale deviendra une ressource précieuse pour la communauté de la recherche, ainsi que d'un excellent outil d'enseignement pour les étudiants de premier cycle comme une vidéo de démonstration.

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Protocole

Toutes les expériences réalisées en utilisant Xenopus laevis ont été approuvés par IACUC (protocole # AD20261).

1. Réactifs Préparation et matériel requis

  1. Réactifs:
    1. Faire 1 L de 10x MBS (modifié Saline Barth) solution 22. Ajouter du NaCl (880 mM), KCl (10 mM), MgSO 4 (10 mM), HEPES (50 mM, pH 7,8), et de NaHCO 3 (25 mM) à 1 L d'eau distillée. Ajuster le pH à 7,8 avec NaOH.
    2. Faire 1 L de 1x MBS en diluant 100 ml de 10x solution de MBS dans 900 ml d'eau distillée. Ajouter 0,7 ml de solution M CaCl 2 1.
    3. Faire 1 L de 0,1x MBS en diluant 100 ml de solution 1x MBS dans 900 ml d'eau distillée. Pour 1 L de 0,1x MBS solution, ajouter 1 ml de 10 mg / ml solution gentamicine pour une utilisation dans la culture de l'embryon.
    4. Faire MBS élevées de sel par dissolution de 4 ml de 5 M de NaCl dans 100 ml de 10x MBS. Puis ajouter de l'eau distillée jusqu'au volume total est de 1 L.
    5. Assurez-éthanol à 70% en diluant 100% eTHANOL éthanol à 70% de l'eau distillée.
    6. Assurez-BMS-543 par la préparation d'une solution mère à 10 mM dans le diméthylsulfoxyde (DMSO).
    7. Ajouter 4% de paraformaldéhyde (PFA) par addition de 4 g de poudre de paraformaldehyde à 50 ml d'eau distillée. Chauffer sur une plaque chauffante à environ 65 ° C, à quel point ajouter 5 M NaOH goutte à goutte jusqu'à ce que la solution se dégage.
      1. Une fois que la solution se dégage, retirer du feu et ajouter 50 ml 2x PBS et 100 pi de Tween-20. Laisser refroidir à la température ambiante sur la glace. Ajuster le pH à entre 7,2 et 7,5 en utilisant du HCl.
    8. Ajouter une solution saline tamponnée au phosphate avec du Tween (PBT) en dissolvant 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4 et 0,24 g de KH 2 PO 4 dans 800 ml d'eau distillée. Utilisation de HCl, ajuster le pH à 7,4. Ajouter 2 ml de Tween-20. Ajuster le volume final avec de l'eau distillée à l'égalité de 1 L.
    9. Faire une solution de cystéine en dissolvant 1 g de cystéine dans 50 ml d'eau distillée ou 0,1x MBS. Ajouter 1,5 ml de NaOH 5 M une ajuster le pH à 7,8.
    10. Faire un benzocaïne solution mère à 10% en ajoutant 10 g de poudre à base de benzocaïne à 100 ml EtOH à 100%. Pour l'euthanasie des hommes et des embryons prêts pour la fixation adultes, diluer à une solution à 0,05%.
    11. Ajouter une solution de stockage des testicules en ajoutant 1 ml de sérum de veau à 9 ml de tampon L15.
  2. Outils et équipements nécessaires:
    1. Obtenir l'équipement énuméré dans le tableau des matériaux et équipements, illustré à la figure 1.
    2. Modifier un outil pipette. Placez l'extrémité d'une pipette Pasteur en verre dans une flamme d'un brûleur Bunsen. Tournez la pointe de la pipette jusqu'à ce qu'il fonde et forme une extrémité fermée arrondie.
    3. Aplatir la pâte à modeler dans le fond d'une boîte de Petri en plastique, lisser à couvrir la totalité de la plaque (de toute taille peut être utilisé) (Figure 1Aiv).
      1. Appuyez légèrement sur une aiguille de taquineries directement dans le plat revêtu d'argile à un angle de 45 °. Tenez l'aiguille là, et se déplacer lentement le Petriparabole horizontalement pour créer une ligne de dépression (Figure 1bi). Répétez l'opération pour le nombre souhaité de lignes.
      2. Utilisez l'extrémité d'un outil de pipette en verre pour faire peu profondes dépressions circulaires, dans chaque ligne du plat revêtu d'argile à placer la tête de l'embryon (Figure 1Bii) et l'aide à l'organisation des embryons, alors qu'elle photographiait.
      3. Pour la photographie, remplir plat avec PBT (Figure 1Biii). Entre les utilisations, laver le plat et la surface de l'argile avec de l'eau stérile, puis 70% d'éthanol.

2. Xenopus laevis culture d'embryons et l'inhibiteur Traitements

  1. La fécondation in vitro et la culture des œufs de xénope:
    1. Obtenir et culture des embryons de Xenopus laevis en utilisant la norme publiée méthodes 22,23.
    2. En bref, euthanasier un mâle adulte par immersion dans une solution à base de benzocaïne à 0,05%. Disséquer les testicules et magasin dans un tampon de stockage des testicules. Injecterfemelles adultes avec la gonadotrophine chorionique humaine (HCG), ramassez les œufs dans des MBS élevées de sel, et fertiliser in vitro avec testicules disséqués (Figure 2A, B).
    3. embryons de la culture dans 0,1X MBS à 15 ° C jusqu'à ce que le stade désiré est atteint (embryons au stade suivant le tableau normal de Xenopus laevis par Nieuwkoop et Faber 24,25).
      1. Ici, les embryons de la culture jusqu'au stade 22 (après la fécondation de 24 heures (HPF)), et retirez la membrane vitelline sous un microscope stéréoscopique en utilisant deux paires de pinces aiguisées. embryons de transfert avec un standard, disponible pipette de transfert à une boîte de Petri propre (100 mm de diamètre) contenant 30-40 ml de 0,1x MBS.
  2. Inhibiteur de traitement des embryons de Xenopus (illustrées sur la figure 2):
    1. Remplir les puits nécessaires d'une boîte de culture de 24 puits avec 1 ml de 0,1x MBS aide d'une pipette-homme calibré. Délimiter l'extérieur du puits avec un point marque bienER (figure 2D, en médaillon). Utilisez le marqueur pour marquer également le contenu pour être ajoutés à chaque puits sur la boîte 24 puits de culture couvercle. Copier cette information sur une page de 24 puits mis en place dans le cahier de laboratoire.
    2. Transfert 5-10 embryons dans chaque puits en utilisant un standard, disponible pipette de transfert (figure 2C). Placer le même nombre d'embryons dans chaque puits.
    3. Compléter ou supprimer les MBS de 0,1x afin qu'il soit au niveau de la ligne 1 ml marqué (figure 2D). Ajouter le volume approprié de DMSO (de sorte que le volume final de DMSO est de 1%) et agiter doucement. Veillez à ne pas ajouter DMSO trop près des embryons, et éviter tout contact des embryons avec la surface de la mémoire tampon.
    4. Ajouter le volume approprié de produits chimiques dans les puits désignés et agiter doucement à nouveau. Ici, ajouter 1 pl de 10 mM BMS-453 (un antagoniste des récepteurs de l'acide rétinoïque) et 9 pi de DMSO à 1 ml de 0,1 x MBS.
    5. Si le produit chimique est sensible à la lumière, enrouler lâchement le culplat ture dans une feuille d'aluminium. embryons de la culture dans un incubateur à 15 ° C jusqu'à ce que la scène souhaitée. Dans cet exemple, le traitement des embryons pour 16-18 heures.
  3. Lavage des embryons sur le traitement et l'élevage jusqu'à un stade de têtard:
    1. Déposer la moitié aux trois-quarts de la solution avec une pipette de transfert jetable. Veillez à ne pas déranger les embryons. En utilisant une nouvelle pipette de transfert, remplissez le puits avec 0,1X MBS. Répétez cette opération 3-6 fois.
    2. embryons de transfert à une grande boîte de Pétri (150 mm de diamètre) contenant 100 ml de 0,1x MBS avec la gentamicine (1 ml / l). Incuber les embryons à 15 ° C jusqu'à ce qu'ils atteignent stade 42-45 (82-100 HPF).
    3. Changer la MBS 0,1X solution contenant de la gentamicine quotidien, et supprimer des embryons morts rapidement pour éviter la contamination ou la mort d'embryons. Notez le nombre d'embryons morts dans le cahier de laboratoire.
  4. Embryons de fixation dans paraformaldéhyde (PFA):
    1. Fixer embryons entre les stades 42 et 45 (82 et 100HPF, respectivement) en les transférant dans une nouvelle boîte de culture de 24 puits contenant 1-2 ml de MBS 0,1X. Etiqueter le couvercle avec les mêmes informations que le traitement mis en place décrite ci-dessus (section 2.2.1).
    2. Retirer MBS 0,1X autant de chaque bien que possible, tout en laissant embryons visés et assurer un contact minimal pour éviter les blessures. Ajouter 1-2 ml de solution à base de benzocaïne à 0,05% en 0,1X MBS et incuber jusqu'à ce que les embryons ne sont plus sensibles aux stimuli.
    3. Ajouter 1-2 ml de PFA à 4%. Sinon, placez les embryons dans des microtubes marqués pour la fixation, si l'on préfère.
    4. Incuber les embryons en PFA pendant 24 heures à 4 ° C sur un agitateur rotatif. Retirer PFA en effectuant 3-4 lavages avec PBT sur une période de 3-5 heures.

3. Photographier la région oro-faciale de Xenopus têtards

  1. Pré-photographie préparation (ceci est illustré sur la figure 3):
    1. Placez embryons fixes dans une grande boîte de Pétri (150mm de diamètre) contenant environ 100 ml de PBT.
    2. Faire deux incisions de couper la tête du corps (figure 3A, les lignes noires pleines). Tout d'abord, maintenir l'embryon d'une paire de pinces et de faire une incision sur le côté postérieur de l'intestin avec un scalpel stérile (figure 3B). Faire une deuxième incision sur la face antérieure de l'intestin, près du coeur, de supprimer complètement la tête (figure 3C).
    3. Pipette coupé la tête de l'embryon dans un plat revêtu d'argile (partie 1.2.2) en utilisant un standard, disponible pipette de transfert.
      1. Pour une vue frontale, utiliser deux paires de pinces pour positionner la tête de l'embryon côté postérieur à l'intérieur des dépressions circulaires. Utilisation de la pince de manipuler à la fois la tête de l'embryon et de l'argile environnante, les embryons de position de telle sorte qu'ils font face à la caméra et ne sont pas inclinées vers l'arrière ou des deux côtés (Figure 3D). Poussez délicatement l'argile environnante autour de la tête en utilisant des pinces et / ou le verreoutil pipette pour fixer la tête en place.
      2. Pour les vues latérales, utiliser une pince pour positionner la tête de l'embryon à l'intérieur des dépressions circulaires tels qu'ils sont, de leur côté, face à la même direction, et sont à plat contre l'argile. Manipuler la tête de l'embryon et l'argile environnante ainsi que les glandes de ciment de tous les embryons sont positionnés vers le bas sous le même angle (figure 3E). Utilisez les lignes dessinées avec l'aiguille taquine comme un guide pour assurer l'exactitude lors de la prise des mesures latérales.
  2. Capture d'images de la tête de têtard:
    1. Photographier la tête du têtard en utilisant n'importe quel microscope de dissection avec un appareil photo numérique ci-joint et le logiciel de la caméra correspondante. Utilisez le plus fort grossissement qui peut être maintenue constante pour tous les embryons.
    2. Centrer embryons et face à tous dans la même direction. Capturez des images en utilisant les meilleures conditions d'éclairage qui permettent de l'image la plus exacte de la région oro-facial. Positionlumières pour éviter les ombres excessives. Enregistrer les images en .tiff fichiers avec la plus haute résolution possible.

4. Mesure et analyse du visage dimensions de taille chez le xénope têtards

  1. Mesurer les dimensions oro-faciales (résumées dans la figure 4):
    1. Déterminer la largeur du visage. Identifier les points où la partie ventrale de chaque œil répond aux périphéries de la face (figure 4A, flèches), et mesurer la distance entre ces points (figure 4A, ligne rouge).
    2. Déterminez la hauteur de visage. Tout d'abord, déterminer la ligne médiane en mesurant la distance entre chaque oeil et le calcul de la marque à mi-chemin. Ensuite, dessinez des lignes horizontales qui marquent les dorsales plupart des bords des yeux et de la dorsale plus de points de la glande ciment (figure 4B, des lignes blanches). Sur la ligne médiane, mesurer la distance entre les lignes horizontales (figure 4B, ligne rouge).
    3. Déterminer til zone oro-facial. Utilisez les mêmes lignes horizontales marquent les bords dorsaux des yeux et de la glande de ciment pour guider mesure de surface (Figure 4C, lignes blanches). Commencez à l'endroit où le marquage haut de la glande ciment ligne horizontale correspond à la périphérie de la partie gauche du visage (Figure 4Ca).
      1. Trace le long du bord de la surface englobant l'œil jusqu'à l'endroit où le marquage haut des yeux ligne horizontale correspond à la périphérie de la face (Figure 4CB). Continuez de tracer le long de cette ligne dorsale plus horizontale jusqu'au point où elle rencontre la périphérie du côté droit du visage (Figure 4 cc).
      2. Trace vers le bas le long du bord de la surface englobant l'œil jusqu'à l'endroit où le marquage haut de la glande ciment ligne plus horizontale ventral répond à la périphérie du côté droit de la face (Figure 4CD). Continuez de tracer le long de ce fond unt ligne horizontaleil il rencontre le point où le suivi a commencé. Utilisez logiciel de retouche photo pour calculer la surface à l'intérieur du tracé.
    4. Déterminer la longueur du museau. Sur les images latérales, faire une ligne verticale qui marque la partie antérieure de l'œil. Ensuite, mesurer la distance horizontale entre le point le plus antérieur où le visage répond au bord dorsal de la glande ciment au marquage la partie antérieure de l'œil (figure 4D) ligne verticale.
    5. Déterminer la largeur de la bouche. Mesurer la distance horizontale entre les points gauche et droit où haut et en bas «lèvres» de l'ouverture bouche se rencontrent (figure 4E). Celles-ci pourraient être considérées comme l'équivalent de la grenouille des commissures labiales.
    6. Déterminer la bouche rondeur. Calculer bouche rondeur comme un rapport d'aspect inverse où (4   ×   [Espace]) / (π   ×   [Axe majeur] 2 >).
      1. Utilisez l'outil Lasso dans un photo-éditeur de tracer les bords de l'ouverture de la bouche, comme illustré à la figure 4F. Sélectionnez Analyser dans la barre d'outils principale et sélectionnez Mesurer. En variante, le calcul de la rondeur de la zone de mesure et le diamètre de l'ouverture de bouche.
  2. L'analyse des données de dimensions du visage:
    1. Entrée des mesures des dimensions faciales dans un programme d'analyse de données pour comparer le groupe de traitement avec la commande. Déterminer la moyenne de chaque mesure pour les deux groupes expérimentaux et de contrôle pour créer des graphiques à barres. Déterminer l'écart type afin de créer des barres d'erreur. Effectuer des tests t de Student pour comparer statistiquement les groupes.
      NOTE: Ces données peuvent être très variables en raison des taux légèrement différents de développement entre les embryons.

5. Analyse quantitative de forme oro-faciale et Morphometrics

  1. La place des repères et create repère fichier de coordonnées (illustré sur la figure 5A).
    1. Choisir repères tels qu'ils saisissent la forme de l'image cible, et peut être placé à plusieurs reprises dans le même emplacement relatif dans tous les échantillons analysés. Si une structure ne figure pas dans tous les échantillons, ne placez pas un point de repère sur cette structure.
      1. Ici, placer 24 points de repère pour représenter le milieu du visage avec des signes distinctifs comme les yeux, les narines et la bouche. Par souci de cohérence, le lieu Repères mi-chemin entre sites déjà passées (par exemple, de la bouche des repères, figure 5ai).
    2. Capturez coordonnées historiques et créer "repère fichier de coordonnées". Ouvrez la première image d'un visage de têtard (par exemple, le premier embryon de contrôle).
      1. Sélectionnez l'onglet Plugins sur la barre d'outils principale et choisir Pointpicker dans le menu déroulant. Sélectionnez l'onglet Ajouter des Points et place des points de repère dans des endroits désirés comme points de repère apparaissent sous forme de croix multicolores ( Figure 5ai).
      2. Déplacez lieux historique après le placement en sélectionnant l'outil de croix de déplacement. Lorsque tous les sites ont été placés sur l'image, sélectionnez l'onglet Afficher les résultats sur la barre d'outils principale et sélectionnez Afficher (Figure 5Aii) pour afficher les coordonnées historiques et copier dans un tableur (Figure 5Aiii).
      3. Lorsque vous collez ces coordonnées de ce premier embryon dans un tableur, laisser une ligne vide au-dessus des données. Dans la colonne B de cette ligne vide (ligne 1), tapez "LM =" avec le nombre de points de repère dans l'échantillon. Ici, entrez "LM = 24" depuis 24 sites ont été créés (Figure 5Aiii, boîte rouge).
      4. Dans la ligne ci-dessous les points de données, de type "ID =" avec un nom d'identification de l'échantillon. Voici la figure 5Aiii, entrez "ID = CON1" depuis ce est le point de repère de coordonnées données du premier embryon de contrôle (Figure 5Aiii, flèche rouge).
      5. Répétez ce processus avec des visages de chaque embryon dans l'expérience (expérimental et contrôle) jusqu'à ce que toutes les coordonnées historiques ont été saisis dans la feuille de calcul.
        NOTE: Il est important que chaque embryon est un nom unique dans le "ID =" ligne. Ici par exemple, la prochaine série de coordonnées de point de repère est donné le numéro de "CON2", car il était le deuxième embryon dans le groupe de contrôle.
      6. Copiez l'intégralité du deuxième et troisième colonnes dans un document texte et enregistrer dans un fichier .txt.
  2. Mettre en place le logiciel morphométriques pour l'analyse des données (illustré dans la figure 5B).
    1. Ici, sélectionnez Créer un nouveau jeu de données dans le menu principal du logiciel morphométrique. Nommez le fichier et l'ensemble dans les cases appropriées données (par exemple, "l'acide rétinoïque Inhibition" et "points de repère du visage», respectivement) dans l'écran pop-up (Figure 5BI). Importer le fichier comme un TPS, et select le fichier texte de coordonnées pour créer l'ensemble de données (Figure 5BI, flèche rouge).
    2. alignement des données et procrustes correspondent:
      1. Effectuer un ajustement de Procuste et l'alignement. Mettez en surbrillance l'ensemble dans l'onglet Project Tree données, choisir Préliminaires sur la barre d'outils principale, et New Procuste Fit dans le menu déroulant.
      2. Sélectionnez Aligner par axe principal et sélectionnez Exécuter Procuste Fit au fond de la boîte (Figure 5Bii, flèche rouge). Retour à la Préliminaires dans le menu déroulant, sélectionnez Générer matrice de covariance (Figure 5Biii), et sélectionnez Exécuter.
      3. Voir les corrélations de la matrice de covariance dans l'onglet Résultats.
    3. Créez un fichier "classificateur" en attribuant à chaque échantillon dans l'ensemble de la variable de classification des données appropriées à distinguer si elle appartient dans le groupe expérimental ou au groupe témoin.
      1. Étiquette à deux colonnes dans un tableur. Marquez l'en-tête de la première Column avec "ID" et entrée de la même ID donné pour chaque échantillon (par exemple, CON1, RARINHIB1, et ainsi de suite; Figure 5Biv). Étiqueter l'en-tête de la deuxième colonne avec le «traitement» et l'entrée dans chaque cellule du groupe de traitement qui correspond à l'échantillon répertorié dans la cellule adjacente d'identification.
      2. Ici, utiliser des étiquettes «contrôle et RAR inhibiteur» que les classificateurs (Figure 5Biv). Copier dans un fichier texte et enregistrer dans un fichier .txt. Variables Importer un classificateur dans le logiciel morphométrique. Choisissez match par identification, et ouvrez le fichier de texte (Figure 5Bv).
  3. Créer une analyse en composantes principales (ACP) nuage de points en sélectionnant le menu déroulant et en choisissant Variation analyse en composantes principales (figure 6Ai). Ensuite, sélectionnez l'onglet Graphiques pour voir trois onglets supplémentaires: les changements de forme de PC, valeurs propres, et les scores de PC (Figure 6Aii). L'onglet PC scores affiche le bivariate composante principale nuage des Procrustes données historiques ajustement (Figure 6Aii).
    1. Pour changer les composantes principales sont tracées, faire apparaître le menu contextuel dans l'espace de la parcelle et sélectionnez l'axe souhaité modifier (Figure 6Aiii, flèche rouge).
    2. Sélectionnez l'outil Points de données de couleur (Figure 6Aiii). Sélectionnez classificateurs précédemment importés (section 5.2.2) dans le second menu pop-up qui apparaît à déterminer la couleur de chaque catégorie (Figure 6Aiv).
    3. Afficher la quantité de variance capturée par chaque composante principale dans l'onglet Résultats (Figure 6AV). Exporter graphique dans un fichier .bmp.
  4. Créer une analyse discriminante (DFA) grille de transformation dans le logiciel morphométrique en choisissant analyse discriminante sous l'onglet Comparaison (Figure 6Bi). Dans le menu pop-up, veiller à ce que l'ensemble de données approprié est selète et le type de données est les coordonnées Procuste-fit.
    1. Mettez en surbrillance les paires de groupes à comparer, et courent de 1000 tests de permutation (Figure 6Bii).
    2. Sous Graphismes, voir la carte de vecteur des coordonnées dans l'onglet Forme de différence (Figure 6Biii). Si l'image est inversée, faire apparaître le menu contextuel dans l'espace de complot visant à renverser le schéma dans l'orientation correcte (Figure 6Biii).
    3. La direction de vecteurs reflète la différence de forme du premier groupe par rapport au deuxième, qui est affichée dans le menu de fonctions discriminantes avant de lancer l'analyse (figure 6Bii). Pour inverser la direction des vecteurs, faire apparaître le menu contextuel dans l'espace de terrain et changer le signe du facteur d'échelle de sorte qu'il est négatif (Figure 6Biii, iv). La valeur de la valeur d'échelle est réglé sur un facteur de dix qui représente le mieux les différences statistiques dans la position repère between les deux groupes sans distorsion, et est généralement laissée à la valeur par défaut (Figure 6Biv).
    4. Toujours dans le menu pop-up, changer le graphique pour une grille de transformation de superposer les vecteurs sur une grille (Figure 6Biii, v).
    5. Spécifiez le nombre de lignes horizontales et verticales de la grille dans le menu pop-up (Figure 6Biii, v).
    6. Exporter le graphique dans un fichier .bmp.
    7. Voir les distances Procrustes et Mahalinobis et p-valeurs sous l'onglet Résultats (Figure 6Bvi).
  5. Des analyses morphométriques supplémentaires qui sont utiles pour l'évaluation de plus d'un groupe de traitement
    1. Créer une grille principale de transformation de l'analyse en composantes. La forme de PC Change onglet affiche la carte de vecteur de changements de forme qui représente la variance au sein de chaque groupe d'échantillons. Utilisez le menu pop-up dans le domaine de complot visant à orienter correctement l'image et superposer des vecteurs sur une grille de transformation. Réglez le facteur d'échellede la valeur sur l'axe des x de la PC scores graphique qui correspond au centre estimé de la groupe de commande. Exporter l'image en tant que fichier .bmp.
    2. Créer un nuage de CVA. Sous l'onglet Comparaison sur la barre d'outils principale, sélectionnez canonique Variate analyse, et de souligner l'ensemble de variables de classification qui a été précédemment importé (voir section 5.2.3). Sélectionnez 1000 itérations pour des tests de permutation, et sélectionnez Exécuter. Sélectionnez l'onglet scores de CV pour voir la CVA nuage à deux variables. Ce code couleur basé sur les classificateurs téléchargées. Changer le schéma de couleur en évoquant le menu pop-up dans l'espace de la parcelle (voir la section 5.3.3). Exporter en tant que fichier .bmp.
    3. Créer un réseau de transformation de CVA. Une grille de transformation des résultats de VCA peut être généré lors de la comparaison de plus de deux groupes. Sous l'onglet Graphiques, choisir CV changements de forme pour visualiser la grille de transformation des coordonnées de point de repère. Faire apparaître le menu contextuel dans l'espace de complot visant à changerla direction du vecteur, superposer les résultats sur une grille de transformation, et spécifier le nombre de lignes de quadrillage. Exporter le graphique dans un fichier .bmp.

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Résultats

Ici, une analyse quantitative de la taille et de la forme orofaciale a été démontrée pour comparer les embryons traités avec un inhibiteur du récepteur de l'acide rétinoïque (un inhibiteur de RAR) à des témoins non traités. Les embryons ont été traitées avec une concentration de 1 uM de cet inhibiteur chimique de l'étape 24 à 30 (26 à 35 hpf), lavées, fixées et, à l'étape 42 (82 hpf). Ils ont ensuite été traités et analysés comme décrit dans le protocole. Les résultats sont données originales, mais cohérent avec les obs...

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Discussion

Xenopus laevis est devenu un outil utile pour disséquer les mécanismes de développement de développement oro-facial sous-jacent; Cependant, il n'y a actuellement aucun protocole décrivant taille et la forme des changements de cette région chez les grenouilles. La méthode décrite ici contribuera de manière significative dans le domaine du développement oro-faciale en permettant une quantification plus rigoureuse des phénotypes oro-faciales chez le xénope et autres vertébrés.

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ont rien à divulguer.

Remerciements

Fonds de démarrage à A. Dickinson engagement soutenu ce travail.

Les auteurs tiennent à remercier Dan Nacu pour son talent artistique dans la création de la représentation schématique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Microscope de dissectionZeiss équipé d’unecaméra AxioCamICC1
Dumont #5 Pince en inoxOutils de science fine11251-10
Scalpel stérile et jetableSklar06-2015
Plaque 24 puitsFisher Scientific087721
Standard Pipettes de transfert jetablesFisher Scientific13-711-7M
Boîtes de Pétri de 150 mm x 15 mmFalcon351058
IncubateursEctothermréglés à 15 ° ; C ou 20 ° ; C
Pâte à modelerPremo, ou autre pâteen noir ou blanc
Aiguille à taquiner droiteThermo Scientific19010
Tube capillaire (pour aiguilles)FHC30-30-1Borosil 1,0 mm OD x 0,5 mm ID/Fibre, 100 mm chacun
Extracteur d’aiguille, Modèle P-97Sutter Instrument Co.Extracteur d’aiguille : P-97 Tireur de micropipette Flaming/ Bown Filament : FB300BPour les filaments, utilisez des filaments carrés Sutter de 3,00 mm de large.
PipettesGilsonF144802, F123600, F123602
BMS-453Tocris3409
DMSOBioanalytique américainAB00435-01000
CystéineSigma-Aldrich52-90-4
Poudre de paraformaldéhydeSigma-Aldrich158127
boîtes de PétriFalcom353003, 351058100 mm de diamètre et 150 mm de diamètre
100 % éthanolVWR89125-170
à modeler non toxique

Références

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