Article de méthode

Isolement et analyse fonctionnelle des mitochondries de cellules cultivées et de tissus de souris

DOI :

10.3791/52076

⸱

23 mars 2015

 ,  ,  ,  , 
1Chemistry Department, Elon University, 2Department of Neurobiology and Anatomy, Wake Forest School of Medicine, 3Neuroscience Graduate Program, Wake Forest School of Medicine, 4ALS Center Translational Science Unit, Wake Forest School of Medicine

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La comparaison du potentiel de membrane mitochondriale entre les échantillons fournit des informations précieuses sur l’état cellulaire. Les étapes détaillées de l’isolement des mitochondries et de l’évaluation de la réponse aux inhibiteurs et aux découpleurs à l’aide de la fluorescence sont décrites. La méthode et l’utilité de ce protocole sont illustrées par l’utilisation d’une culture cellulaire et d’un modèle animal de stress cellulaire.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La comparaison entre deux groupes distincts ou plus, tels que la santé et la maladie, est nécessaire pour déterminer l’état cellulaire. Les mitochondries sont au cœur de la santé cellulaire en raison de leur rôle à la fois dans le métabolisme cellulaire et la production d’énergie, ainsi que dans le contrôle de l’apoptose. Par conséquent, l’évaluation directe des mitochondries isolées et la perturbation mitochondriale offrent la possibilité de déterminer si une (dys)fonction spécifique aux organites se produit. Les méthodes décrites dans ce protocole comprennent l’isolement de mitochondries intactes et fonctionnelles à partir de cellules cultivées HEK et de foie et de moelle épinière de souris, mais peuvent être facilement adaptées pour être utilisées avec d’autres cellules cultivées ou tissus animaux. La fonction mitochondriale évaluée par TMRE et l’utilisation de découpleurs et d’inhibiteurs mitochondriaux courants en conjonction avec un lecteur de plaques fluorescentes permettent à ce protocole non seulement d’être polyvalent et accessible à la plupart des laboratoires de recherche, mais aussi d’offrir un débit élevé.

Introduction

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Les cellules vivantes Energy Bank métabolique dans la forme de graisses et d'hydrates de carbone et utilisent cette énergie pour la biosynthèse, transport membranaire et le mouvement. De l'énergie est obtenue dans le cytosol à travers la transformation des sucres alimentaires en ATP directement pendant la glycolyse. Cependant, la principale source de la production d'ATP dans une cellule est exploitée dans les mitochondries par la chaîne respiratoire mitochondriale 1. L'architecture des mitochondries fournit l'orientation spatiale nécessaire pour la production d'ATP et efficace. Les mitochondries possèdent une double membrane séparées par un espace intermembranaire et ensemble avec la matrice, le compartiment mitochondrial plus à l'intérieur, la maison des composants et de coordonner les réactions chimiques intervenant dans la génération d'ATP. La membrane intérieure contient une série de complexes de protéines membranaires qui constituent la chaîne respiratoire ainsi que de l'ATP synthase, le complexe protéique qui réunit ADP et Pi pour la formation d'ATP. L'aubergemembrane du RE est pliée en crêtes et des électrons sont transmis le long des complexes de la chaîne respiratoire par l'intermédiaire du cytochrome c, un porteur d'électrons soluble qui se déplace entre des complexes dans l'espace intermembranaire. Comme les électrons se déplacent, l'oxydation des équivalents réducteurs se produit et des ions hydrogène sont pompés à partir de la matrice de l'espace intermembranaire. Comme conséquence de la forte concentration d'ions dans l'espace intermembranaire, un gradient électrochimique construit résultant dans un potentiel de membrane à travers la membrane mitochondriale interne (Δψ) 2. L'oxygène est l'accepteur final d'électrons de la chaîne de transport d'électrons et des ions hydrogène se écouler à travers les ATP synthases à partir de l'espace intermembranaire revenir à la matrice, et, ce faisant directement provoquer la formation d'ATP. Ce procédé tel que décrit dans son ensemble est connu comme la phosphorylation oxydative. Les plis de la crêtes augmentent la surface de la membrane interne, ce qui permet le transport d'électrons maximale et la production d'ATP à l'intérieurchaque mitochondrie. Les protéines, des enzymes et d'autres molécules impliquées dans la phosphorylation oxydative sont dérivés de deux gènes nucléaires et mitochondriales. Les mitochondries contiennent leur propre ADN circulaire, codant pour 13 protéines, ainsi que les ARNt et les ARNm nécessaires pour la production d'ATP 3. Cependant, beaucoup plus de protéines sont nécessaires et sont donc codées dans le noyau. La plupart de ces protéines nucléaires codés sont ciblés sur la matrice mitochondriale par l'utilisation de préséquences à l'extrémité N-terminale de la protéine précurseur, et leur importation est entraînée en partie par Δψ 4,5.

Au-delà de la contribution aux bioénergétique d'une cellule, les mitochondries influencent également les principaux processus métaboliques telles que le TCA et le bêta-oxydation, la signalisation cellulaire par régulation de calcium, ainsi que d'un rôle clé dans l'apoptose 6. Plus précisément, pendant les périodes de stress cellulaire, les protéines famille Bcl-2 qui résident sur ou interagissent à la membrane externe mitochondriale peut causer mitochondrialperméabilité de la membrane externe (MOMP) 7,8. Au cours de la MOMP, le cytochrome c et d'autres protéines sont libérées dans le cytosol, et avec plusieurs protéines cytosoliques former un complexe appelé apoptosome 9,10. Le apoptosome active caspases qui vont à cliver les protéines cellulaires et de l'ADN pendant la phase d'exécution de l'apoptose. Dès que MOMP se produit, ΔΨ est effondré et la production d'ATP arrêtée. Ainsi, la fonction mitochondriale, comme l'apoptose est déclenchée est compromise et des changements dans ΔΨ peut être corrélée à la santé cellulaire mitochondriale et 12. Alors que l'apoptose est un critère d'évaluation dans de nombreux modèles de la maladie, la fonction mitochondriale et la modification de ΔΨ peut aussi fournir des informations précieuses sur l'origination et / ou progression de la maladie. Par exemple, des changements structurels et fonctionnels mitochondriaux ont été documentés au cours de maladies neurodégénératives 13,14.

Dans la première partie du protocole, isolation des mitochondries intactes qui conservent leur ΔΨ est décrite. Des cellules HEK-293T ont été exposées à différentes concentrations et combinaisons de TNF-α recombinant, IL1-β et IFN-γ pour induire l'apoptose. Ces cytokines ont été choisis parce qu'ils sont fréquemment signalés à être élevée dans les échantillons primaires septiques humaines 15 et la voie extrinsèque de l'apoptose peut être déclenchée par l'interaction de se lier à son récepteur TNF-α 6. Comme il existe des variations subtiles nécessaires pour isoler les mitochondries fonctionnelles de tissus primaires par rapport à des cellules en culture, et parce que de nombreuses recherches utilise des animaux, le protocole décrit également comment isoler les mitochondries de foie et la moelle épinière antérieure de la sclérose latérale (ALS) modèle de souris.

La seconde partie du protocole a été conçu pour contrôler des perturbations au potentiel de la membrane mitochondriale en utilisant un colorant fluorescent sensible au potentiel d'un lecteur de plaque fluorescente. Différences entre le statut cellulaire (à savoir, en bonne santé vs malsaine) se différencient par la quantification de la résistance de ΔΨ de mitochondries isolées conjointement avec des agents de découplage, des inhibiteurs de la chaîne respiratoire, des inhibiteurs et des ionophores complexes, lesquels provoquent une dissipation du potentiel de la membrane mitochondriale. La sain les mitochondries, plus le changement de ΔΨ lors d'un traitement avec des inhibiteurs mitochondriaux, par conséquent, la réponse des mitochondries peut être utilisé comme un indicateur de la fonction mitochondriale (dys).

Utilisation des mitochondries isolées plutôt que dans l'évaluation in situ de la fonction offre la preuve définitive que d'une pathologie ou de traitement module directement changements à l'organite 16-18. Bien qu'il existe des méthodes de la littérature pour isoler les mitochondries de cellules en culture, ils sont vagues 17 et / ou utilisent de l'équipement spécialisé 16. Ce protocole décrit en détail la méthode d'isolement et estfacilement adaptable à d'autres lignées cellulaires, y compris les tissus et les cultures primaires 13,14,19,20. De nombreuses études de mitochondries isolées utilisent les mêmes découpleurs et inhibiteurs mitochondriaux utilisés dans ce protocole, mais avec une électrode Clark (21 est un exemple représentatif de nombreux articles dans la littérature), qui est encore un morceau très spécifique et spécialisée de l'équipement. En outre, cette méthode traditionnelle a des limitations telles que faible débit et haute complexité 22,23 et nécessite une quantité importante de mitochondries (~ 500 ug / réaction). Dans ce protocole, la fluorescence TMRE potentiel de membrane de la sonde de détection est utilisé en conjonction avec un lecteur de plaque fluorescente, qui est une machine standard dans de nombreux laboratoires. TMRE est largement considéré car il pénètre rapidement les cellules et les mitochondries isolées et peut être utilisé à de faibles concentrations 24. Plusieurs réactions peuvent être rapidement mis en place en tandem et lots analysés en utilisant ce protocole. En outre, la réactions nécessitent une petite quantité beaucoup de mitochondries isolées (~ 10 pg / réaction). En exigeant moins de matériaux, échantillons de tissus ou de culture cellulaire plus petits peuvent être utilisés comme point de départ pour l'isolement de mitochondries, plusieurs répétitions ou réactions peuvent être mis en place, et assez matériel potentiellement pour d'autres expériences de mitochondries isolées telles que la production d'ATP, la consommation d'oxygène, ou l'importation les dosages sont possibles.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les expériences animales conformes aux Instituts nationaux de la Santé et des lignes directrices ont été approuvées par l'Université Wake Forest de protection des animaux et l'utilisation Comité. Les couples reproducteurs pour SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1 G93A) 1Gur] modèle de souris ont été obtenus à partir de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). De type sauvage (WT) femelles et les mâles SOD1G93A non transgénique [B6SJL-TgN (SOD1 G93A) 1Gur] ont été élevés pour générer des souris SOD1G93A et littermates WT non transgéniques qui ont été utilisés dans les expériences.

1. Les modèles pour les enquêtes

  1. La culture cellulaire
    1. Maintenir des cellules de rein embryonnaires humaines (HEK-T293), les cellules dans du DMEM supplémenté avec 10% de sérum inactivé à la chaleur bovin foetal, 1% de pénicilline-streptomycine et 1% de L-glutamine, à 37 ° C dans 5% de CO2.
    2. Cultiver les cellules dans des flacons T75 et leur permettre d'atteindre 90% de confluence.
    3. Effectuer le fractionnement cellulaire par traitement à la trypsine (0,25% de trypsine-EDTA) pendant 3-5 minutes à 37 ° C dans 5% de CO 2 , L'inactivation de la trypsine avec un volume égal de milieu cellulaire, et la centrifugation des cellules pendant 5 minutes à 700 xg à 4 ° C.
    4. Aspirer les médias et resuspendre le culot cellulaire dans des milieux de culture.
    5. cellules de semences dans le ballon ou la plaque appropriée 7 x 10 4 cellules dans un flacon T75 48 heures avant la cytokine traitement. Cela devrait donner ~ 70% de la densité au moment du traitement.
    6. cellules de mourir de faim de sérum 24 heures plus tard en aspirant les médias et le remplacer par le même volume de milieu sans sérum (DMEM, stérile).
    7. Préparer TNF-α, IL1-β, IFN-γ et, à partir de poudre lyophilisée avec de l'eau ultra-pure à une concentration de travail de 5 pg / ul, 10 ng / pl et 10 ng / pl, respectivement et les ajouter aux puits / flacons.
    8. Traiter de sérum de cellules privées par l'addition de cytokines solubilisés directement dans le milieu de culture cellulaire de flacons appropriés. Les traitements consistaient en des cytokines individuelles, un cocktail de tous les trois (dénommé "* 3"), ou sterile eau comme témoin (dénommé "0").
    9. Incuber les cellules traitées pendant 24, 48 ou 72 heures avant que l'évaluation et la récolte.
  2. L'évaluation de viabilité cellulaire
    1. Ajouter une solution à 5 mg / ml d'acide 3- (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -2,5-diphényltétrazolium (MTT) dans 1 x PBS.
    2. Pour les plaques à 12 puits, ajouter 100 ul de solution de MTT à chaque puits et mélanger doucement en tournant pour assurer une distribution uniforme.
    3. Incuber les plaques pendant 15 min-1 heure à 37 ° C dans 5% de CO 2, et vérifiez sous un microscope pour la présence de coloration violette. Si aucun violet est présente, agiter à nouveau et permettent aux cellules de incuber dans des intervalles de 5 min jusqu'à ce que le violet est observé. La quantité de temps nécessaire doit être déterminé par chaque chercheur.
    4. Aide d'une pipette à répétition, ajoutez 700 pi de MTT solvant (HCl 4 mM et 0,1% de NP40 dans l'isopropanol) à chaque puits et basculer la plaque (s) à la température ambiante pendant 5 à 10 min, ou jusqu'à ce que la couleur pourpre avait laissé les cellules . Si pourprecouleur ne sort pas des cellules, ajouter un 200 pi supplémentaires de solvant et de continuer à tourbillonner.
    5. Pour l'analyse, prendre 100 pi de chaque puits et la placer dans une plaque de 96 puits et lire sur un lecteur de plaque à l'aide de 570 nm et une longueur d'onde de 630 nm de référence, cependant 595 nm est également acceptable tant que les mesures sont prises à des paramètres cohérents.
  3. modèle animal de la SLA
    1. Toutes les expériences animales conformes aux Instituts nationaux de la Santé et des lignes directrices ont été approuvées par l'Université Wake Forest de protection des animaux et l'utilisation Comité. Les couples reproducteurs pour SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1 G93A) 1Gur] modèle de souris ont été obtenus à partir de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). De type sauvage (WT) femelles et les mâles SOD1G93A non transgénique [B6SJL-TgN (SOD1 G93A) 1Gur] ont été élevés pour générer des souris SOD1G93A et littermates WT non transgéniques qui ont été utilisés dans les expériences.
    2. Effectuer génotypage avec des amorces standards contre SOD1 mutante 25.

2. Isolement des mitochondries

NOTE: Il est important de travailler rapidement et de garder tout sur la glace tout au long de la procédure.

  1. Préparation du tampon d'isolement des mitochondries (MIB), un tampon d'isolement de la moelle épinière (SC MIB) et de tampon expérimental (EB)
    1. Préparer les solutions d'achat d'actions suivantes à l'avance pour MIB et EB.
    2. Ajouter 1 M Tris / MOPS en dissolvant 12,1 g de base Tris dans 70 ml de H 2 O. Ajouter MOPS sèches pour obtenir pH à 7,4. Réglez le volume à 100 ml final. Filtre stériliser et conserver à 4 ° C.
    3. Faire une M Kphos en mélangeant 80,2 ml de K 2 HPO 4 et 19,8 ml de KH 2 PO 4. Entreposer à la température ambiante.
    4. Ajouter 0,2 M EGTA / Tris en ajoutant 3,8 g de l'EGTA à 10 ml de H 2 O. Ajouter 1 M Tris / MOPS jusqu'à dissolution, ~ 30-40 ml. Ajuster à 50 ml, filtre stérile et stocker à température ambiante. Notez que le pH sera de 6,7 ~.
    5. Faire une M glutamate en faisant 10 ml deSolution 1 M d'acide glutamique. Filtre stériliser et stocker 4 ° C.
    6. Faire une Malate M en faisant 10 ml d'une solution M d'acide malique. Ajouter Tris / MOPS à 50 mM. Filtre stériliser et conserver à 4 ° C.
    7. Assurez-MIB à une concentration de saccharose 200 mM, Tris 10 mM / MOPS, pH 7,4, et 1 mM d'EGTA / Tris. Filtre stériliser et conserver à 4 ° C.
    8. Assurez-MIB SC à une concentration de 250 mM de saccharose, 20 mM de HEPES-KOH pH 7,5, 10 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl2, 1 mM d'EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM de DTT, et cocktail inhibiteur de protease.
    9. Assurez-EB à une concentration de 125 mM de KCl, 10 mM de Tris / MOPS, pH 7,4, 5 mM de glutamate, malate de 2,5 mM, 1 mM de phosphate de K, pH 7,4, 10 mM d'EGTA et / Tris. Filtre stériliser et conserver à 4 ° C.
  2. la préparation de l'équipement avant la récolte des cellules.
    1. Rincer un petit récipient en verre et l'homogénéisation pilon trois fois à l'eau stérile et placer sur la glace.
    2. Recueillir des éléments nécessaires comme une perceuse standard, SCRA cellulairepers, 1,5 ml, 15 ml et 50 ml tubes et des solutions.
  3. Les mitochondries Isolation
    1. Les cellules cultivées
      1. Pour chaque type d'échantillon, utiliser deux flacons T175 de cellules.
      2. Veiller à ce que les cellules sont ~ 90% de confluence et l'utilisation dans des expériences de contrôle, ou plaque et traiter comme décrit ci-dessus à l'étape 1.2.
      3. Sur la paillasse, les médias Aspirer et laver les cellules adhérentes deux fois avec 15 ml de PBS 1x chaque fois.
      4. Aspirer le tampon et racler flacons pour éliminer les cellules adhérentes à partir du fond du flacon.
      5. Ajouter 15 ml de PBS 1x à chaque flacon, tourbillon, et transfert à individuels tubes de 15 ml et le lieu coniques sur la glace.
      6. Une fois raclage est fait, centrifuger les tubes pendant 5 min à 700 xg, 4 ° C en utilisant une centrifugeuse dessus de table en utilisant un rotor à godet oscillant.
      7. Aspirer les surnageants de chaque pastille et remise en suspension dans 1 ml de MIB.
      8. Combiner les deux suspensions et de transférer à un petit récipient en verre pour l'homogénéisation.
      9. Ajouter MIBdans le récipient jusqu'à ce que le tampon atteint la première ligne. Homogénéiser les cellules avec le pilon attachés à une perceuse à vitesse moyenne pendant trois passes. Assurez-vous que le navire est sur la glace lors de cette étape, ne pas enlever le pilon au-dessus du liquide et d'utiliser une vitesse constante avec des passes continues.
      10. Transférer la solution homogénéisée dans un tube conique de 50 ml.
      11. Aspirer la solution dans une seringue de 3 ml en utilisant un 1 ½ aiguille de calibre 18 pouces et l'expulser dans le tube conique sur glace avec une aiguille de calibre 27 ½ pouces. Veiller à expulser la solution contre la paroi interne du tube à utiliser que la force de rupture de la membrane cellulaire.
      12. Répéter les étapes de seringue pour un total de cinq fois.
      13. Transférer la solution dans un tube conique de 15 ml et on centrifuge pendant 5 minutes à 600 xg, 4 ° C dans une centrifugeuse de dessus de table au moyen d'un rotor à godet oscillant.
      14. Retirez délicatement le surnageant et répartir entre trois tubes de 1,5 ml.
        REMARQUE: Mitochondria sont dans le surnageant après cette première rotation à basse vitesse, tandis que les membranes cellulaires et les cellules non rompues sont rassemblées en un culot.
      15. Tubes à centrifuger dans un rotor à angle fixe à 10 000 xg, 4 ° C pendant 5 min.
      16. surnageants de Aspirer et combinent les pastilles dans 100 ul MIB et placent immédiatement sur la glace.
        NOTE: Les mitochondries sont dans le culot après cette spin-haute vitesse. Les mitochondries sera généralement de maintenir leur potentiel de membrane pour ~ 2-3 ions glace après isolement et sont plus stable comme une solution de réserve concentrée dans MIB.
    2. isolement de mitochondries à partir de tissu de souris
      1. Anesthésier la souris selon le protocole IACUC. Définir un vaporisateur à 5,0% pour induire une anesthésie. A confirmé que l'animal est anesthésié par un manque de réflexe pincée de pied ou réflexe clignotent lorsque l'œil est approché ou tapoté avec un coton-tige. Garder la souris sous anesthésie à toute la procédure chirurgicale en le mettant à l'évaporateur entre 1,5% et 2,0%.
      2. Excise le foie et la moelle épinière de chaque animal et le lieu séparément dans le froid de la glace 1x PBS - / - pour rincer toute trace de sang.
      3. Pour le foie, le tissu transférer à un plat peser sur la glace et les couper en petits morceaux à l'aide d'une lame de rasoir frais pendant 1 min.
      4. Ajouter tissus et tampon approprié (MIB pour le foie ou SC MIB pour la moelle épinière) à la cuve jusqu'à ce tampon atteint la première ligne. Homogénéiser le tissu avec le pilon à la main pendant cinq passes. Assurez-vous que le navire est sur la glace lors de cette étape, ne pas enlever le pilon au-dessus du liquide et d'utiliser une vitesse constante avec des passes continues.
      5. Transférez les homogénats pour nettoyer tubes de 15 ml.
      6. Tubes à centrifuger dans un rotor à angle fixe à 750 xg, 4 ° C pendant 10 min.
      7. Enregistrer les surnageants dans des tubes propres et placer sur la glace.
        REMARQUE: Les mitochondries sont dans le surnageant après cette première rotation à basse vitesse, tandis que les membranes cellulaires et les cellules non rompues sont rassemblées en un culot.
      8. Remettre en suspension les pastilles de la moelle épinière in 500 pi de SC MIB.
      9. Re-homogénéiser chacun trois fois, seulement à mi-chemin le remplissage avec de la cuve SC MIB cette fois.
      10. Transférer le nouveau homogénat dans un tube frais.
      11. Centrifuger le rotor dans un angle fixe à 750 xg, 4 ° C pendant 10 min.
      12. Moissonneuse ces nouveaux surnageants, qui contiennent plus de mitochondries, le premier surnageant de chaque échantillon.
      13. Tubes à centrifuger dans un rotor à angle fixe à 10 000 xg, 4 ° C pendant 5 min.
      14. surnageants de Aspirer et remettre en suspension les boulettes de foie dans 500 pi de MIB et les pellets de la moelle épinière dans 50 ul SC MIB et placer immédiatement sur la glace.
        NOTE: Les mitochondries sont dans le culot après cette spin-haute vitesse. Les mitochondries sera généralement de maintenir leur potentiel de membrane pour ~ 2-3 ions glace après isolement et sont plus stable comme une solution de réserve concentrée dans MIB.
      15. Effectuer un dosage de la concentration de protéine pour estimer la concentration de la solution dans les mitochondries. Suivre les instructionss à l'aide d'un kit commercial Protein Assay ou méthode similaire 26. Les concentrations typiques de mitochondries sont les suivants: 2 flacons T175 rendements ~ 2 mg / ml, une foie de souris ~ 3-5 mg / ml, et une moelle épinière de souris ~ 1-3 mg / ml.
  4. c dosage de Cytochrome utilisant une R & D Rat / Souris Cytochrome c Quantikine ELISA Kit (adapté du protocole fourni par le fabricant).
    1. Immédiatement avant la mise en place des réactions, diluer mitochondries à 0,5 mg / ml concentration travailler avec EB et distribuer mitochondries dilués dans 1,5 ml tubes pour les réactions (généralement de 30 à 50 pi de mitochondries par tube).
    2. Ajouter soit EB ou le DMSO, à 1% du volume total, les mitochondries dilué et incuber les réactions sur la paillasse pour 7-10 min. Ces réactions sont stables pendant jusqu'à 30 minutes à la température ambiante si une période de temps plus longue est nécessaire.
    3. Pellet mitochondries par centrifugation dans un rotor à angle fixe à 10 000 xg, 4 ° C pendant 5 min et soigneuxLy séparer le surnageant et placer chacun dans un séparées tubes de 1,5 ml.
      REMARQUE: Tubes peut soit être congelé à -20 ° C pour une analyse ultérieure ou utilisé immédiatement.
    4. Déterminer la libération de cytochrome c par une comparaison de la concentration de cytochrome c dans le culot et le surnageant 27.
      1. Préparer les échantillons en solubilisant les pastilles dans le volume initial de la réaction avec 0,5% de TX-100 dans du PBS 1x.
      2. Pour chaque échantillon, préparer deux puits de la plaque ELISA, une pour le culot solubilisé et maintenant une pour le surnageant du mélange réactionnel par addition de 100 ul de conjugué de cytochrome c (utiliser directement de la bouteille) plus 100 ul de 0,5% Tx- 100 dans PBS 1x, et puis tout de la pastille ou le surnageant échantillon.
      3. Vortex doucement la plaque un réglage bas (niveau 2-4) pendant 20 secondes pour mélanger, couvrir et laisser incuber pendant 1 heure, 37 ° C.
      4. Ensuite, laver la plaque quatre fois avec le tampon de lavage dilué selon le fabriles instructions er. Retirer tout excès de solution en appuyant sur les puits sur une serviette en papier.
      5. Ensuite, ajouter 150 ul de 1: 1 A + B solution de développement dans chaque puits et incuber la plaque pendant 20 à 30 min à l'obscurité à température ambiante.
      6. Enfin, ajouter 50 ul de solution d'arrêt à chaque puits et prendre des lectures d'absorbance à 540 nm en utilisant un lecteur de microplaques. Calculer la quantité de libération du cytochrome c en comparant la quantité de cytochrome c dans le culot par rapport surnageant pour chaque réaction.

3. Évaluation de la fonction mitochondriale (Dys)

  1. Immédiatement avant les réactions sont mises en place, diluer mitochondries à 0,5 mg / ml concentration de travail avec EB et placés dans des tubes de 1,5 ml pour les réactions (typiquement de 30 à 50 ul de mitochondries sont utilisés par tube).
  2. Traitements mitochondriales
    1. Ajouter des traitements appropriés (contrôle EB, 1 uM FCCP mélangé avec 50 nM valinomycine, 10 uM roténone, 5 uM oligomycine, 2 mM de KCN, ou 200 uM d'ADP, des concentrations finales) pour séparer les réactions à 1/10 du volume total des mitochondries dilué. Incuber les réactions sur la paillasse pendant 7 min.
      NOTE: Des précautions doivent être prises lors de la manipulation de ces substances que l'ingestion accidentelle ou absorption par la peau pourrait être nocif.
    2. Diluer TMRE, reconstitué dans de l'eau stérile à une concentration de travail de 100 um et stocké à -20 ° C, à 2 uM et ajouter un volume égal au volume de réaction mitochondrial.
    3. Incuber les réactions sur la paillasse pendant 7 min.
    4. Pellet mitochondries par centrifugation dans un rotor à angle fixe à 10 000 xg, 4 ° C pendant 5 min.
    5. la moitié de la charge du volume de surnageant de chaque échantillon sur une plaque 396 puits et lire fluorescence.
      NOTE: excitation et d'émission de longueurs d'onde TMRE doivent être optimisés selon les instructions du fabricant en utilisant le volume et la plaque qui sera utilisé pourle dosage. Utilisation d'une plaque de 384 puits standard noir avec 25 ul de 1 uM TMRE (concentration finale de réaction), le signal le plus fort a été obtenu en utilisant des longueurs d'onde d'excitation / émission   485 nm / 535 nm.
    6. Calculer la différence de pliage entre la fluorescence commande (EB) et chaque traitement en divisant la valeur de fluorescence relative (RFU) obtenu à partir du lecteur de plaques pour l'échantillon expérimental par la RFU de l'échantillon de contrôle.

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Résultats

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Le traitement des cellules HEK-293T avec 200 pg / ml de TNF-α, 40 ng / ml de IL1-β, et 75 ng / ml d'IFN-γ (* 3) pour 24 à 48 heures conduit à des quantités progressives de la mort cellulaire (Figure 1A ). La viabilité cellulaire a été évaluée en utilisant des dosages MTT et démontre qu'il existe toujours ~ diminution de 10% de la viabilité cellulaire à un traitement de 24 heures et environ 20% de diminution de traitement 48 h. Les cellules traitées avec des concentrations similaires (100 pg / ml de TNF-...

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Discussion

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Le traitement des cellules HEK-293T avec les cytokines recombinantes provoque des quantités modérées de la mort cellulaire de plus de 48 h (Figure 1). La quantité de la mort cellulaire induite par TNF-alpha traitement est similaire aux études précédemment rapportées 30 et la viabilité cellulaire diminue après co-administration de multiples cytokines qui sont supérieures à des quantités sommatives avec toute cytokine seule est également conforme à la littérature 31,32. La capacité d...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Cette recherche a été financée en partie par la subvention NSF CHE-1229562 (VDGM), le Bureau de la recherche de premier cycle de l’Université Elon, le Département de chimie d’Elon et le Prix Elon Lumen (TL et TAD), le Programme de bourses du Collège Elon (JAC) et le Programme de spécialisation du Collège Elon (TAD).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
L-glutamiqueSigmaG1251Peut utiliser le sel de potassium à la place.
acide maliqueSigmaM8304Peut utiliser le sel de potassium à la place.
KH2PO4SigmaP0662
K2HPO4SigmaP3786
EGTASigmaE3889
Trisma baseSigmaT6066
MOPSSigmaM3183
CCCPSigmaC2920Diluer jusqu’à 100 μ ; M en tant que stock de travail en éthanol et stocké à -20  ; ° ;C.
ValinomycinSigmaV0627Fabriquer en DMSO et utiliser en tant que 5  ; μ ; Stock de travail M. Magasin à -20  ; ° ;C.
saccharoseFisherS5-500
KCNMallinckrodt6379Faire un stock concentré dans de l’éthanol puis diluer avec de l’eau  ;
roténoneSigmaR8875Hautement toxique. Fabriqué en éthanol.
oligomycineSigmaO4876Hautement toxique. Fabriqué en éthanol.
ADPSigmaA2754
TMRESigma8717-25mgDilué 100  ; μ ; Stock M avec EB immédiatement avant utilisation.
DMEMGibco11965-0841x régulier (glycémie élevée).
Pen/StrepInvitrogen15140-155
L-glutamineFisherSH3002101Stocker les aliquotes à -20  ; ° ; C
FBSLonza14-501Forigine américaine, qualité premium. Chauffer, inactiver et stocker les aliquotes à -20  ; ° ;C.
Trypsine-EDTASigmaT4049
DMSOSIgmaD2650
Colorant de dosage des protéines (5x)Bio-Rad500-0006N’importe quel dosage de protéines peut se substituer.
BSAFisherBP1600-100Faire 2 mg/ml de stock dans l’eau pour le dosage des protéines.
Poudre MTTSigmaM2128Filtre sterlize 5 mg/ml stock fabriqué en PBS. Stocker les aliquotes à -20  ; ° ; C; Stocker à 4 ° ; C jusqu’à 1 semaine.
Solution de tergitol (NP-40)SigmaNP40S
Recombinant Human IL-1BGibcoPCH08014Une fois ouvert, stocker les aliquotes à -20  ; ° ; C
Humain recombinant TNF-alphaGibcoPHC3015L
IFN-gamma humain recombinantGibcoPHC4031
Dulbeccos PBS (-/-)SigmaD8537Assurez-vous qu’il est exempt d’ions Mg2+ et Ca2+.
Cytochrom c kit ELISAR& D systemsDTC0Human pour cellules HEK-293T.  ;

Références

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Mots-clés

Isolement des mitochondriesfonction mitochondrialepotentiel de membranefluorescence au TMREcentrifugation diff rentiellehomog n isation cellulairelecteur de plaques fluorescentd coupleurs mitochondriauxtraitement aux cytokinescellules HEK

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