Isolement et analyse fonctionnelle des mitochondries de cellules cultivées et de tissus de souris

Résumé

La comparaison du potentiel de membrane mitochondriale entre les échantillons fournit des informations précieuses sur l’état cellulaire. Les étapes détaillées de l’isolement des mitochondries et de l’évaluation de la réponse aux inhibiteurs et aux découpleurs à l’aide de la fluorescence sont décrites. La méthode et l’utilité de ce protocole sont illustrées par l’utilisation d’une culture cellulaire et d’un modèle animal de stress cellulaire.

Résumé

La comparaison entre deux groupes distincts ou plus, tels que la santé et la maladie, est nécessaire pour déterminer l’état cellulaire. Les mitochondries sont au cœur de la santé cellulaire en raison de leur rôle à la fois dans le métabolisme cellulaire et la production d’énergie, ainsi que dans le contrôle de l’apoptose. Par conséquent, l’évaluation directe des mitochondries isolées et la perturbation mitochondriale offrent la possibilité de déterminer si une (dys)fonction spécifique aux organites se produit. Les méthodes décrites dans ce protocole comprennent l’isolement de mitochondries intactes et fonctionnelles à partir de cellules cultivées HEK et de foie et de moelle épinière de souris, mais peuvent être facilement adaptées pour être utilisées avec d’autres cellules cultivées ou tissus animaux. La fonction mitochondriale évaluée par TMRE et l’utilisation de découpleurs et d’inhibiteurs mitochondriaux courants en conjonction avec un lecteur de plaques fluorescentes permettent à ce protocole non seulement d’être polyvalent et accessible à la plupart des laboratoires de recherche, mais aussi d’offrir un débit élevé.

Introduction

Les cellules vivantes Energy Bank métabolique dans la forme de graisses et d'hydrates de carbone et utilisent cette énergie pour la biosynthèse, transport membranaire et le mouvement. De l'énergie est obtenue dans le cytosol à travers la transformation des sucres alimentaires en ATP directement pendant la glycolyse. Cependant, la principale source de la production d'ATP dans une cellule est exploitée dans les mitochondries par la chaîne respiratoire mitochondriale ^1. L'architecture des mitochondries fournit l'orientation spatiale nécessaire pour la production d'ATP et efficace. Les mitochondries possèdent une double membrane séparée....

Protocole

Toutes les expériences animales conformes aux Instituts nationaux de la Santé et des lignes directrices ont été approuvées par l'Université Wake Forest de protection des animaux et l'utilisation Comité. Les couples reproducteurs pour SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1 G93A) 1Gur] modèle de souris ont été obtenus à partir de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). De type sauvage (WT) femelles et les mâles SOD1G93A non transgénique [B6SJL-TgN (SOD1 G93A) 1Gur] ont été élevés pour générer des souris SOD1G93A et littermates WT non transgéniques qui ont été utilisés dans les expériences.

1. Les modèles pour les enquêtes

1. La culture ....

Résultats

Le traitement des cellules HEK-293T avec 200 pg / ml de TNF-α, 40 ng / ml de IL1-β, et 75 ng / ml d'IFN-γ (* 3) pour 24 à 48 heures conduit à des quantités progressives de la mort cellulaire (Figure 1A ). La viabilité cellulaire a été évaluée en utilisant des dosages MTT et démontre qu'il existe toujours ~ diminution de 10% de la viabilité cellulaire à un traitement de 24 heures et environ 20% de diminution de traitement 48 h. Les cellules traitées avec des concentrations similaires (100 pg / ml de TNF-.......

Discussion

Le traitement des cellules HEK-293T avec les cytokines recombinantes provoque des quantités modérées de la mort cellulaire de plus de 48 h (Figure 1). La quantité de la mort cellulaire induite par TNF-alpha traitement est similaire aux études précédemment rapportées ³⁰ et la viabilité cellulaire diminue après co-administration de multiples cytokines qui sont supérieures à des quantités sommatives avec toute cytokine seule est également conforme à la littérature ^31,32. La capacité d.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
L-glutamique	Sigma	G1251	Peut utiliser le sel de potassium à la place.
acide malique	Sigma	M8304	Peut utiliser le sel de potassium à la place.
KH2PO4	Sigma	P0662
K2HPO4	Sigma	P3786
EGTA	Sigma	E3889
Trisma base	Sigma	T6066
MOPS	Sigma	M3183
CCCP	Sigma	C2920	Diluer jusqu’à 100 μ ; M en tant que stock de travail en éthanol et stocké à -20  ; ° ;C.
Valinomycin	Sigma	V0627	Fabriquer en DMSO et utiliser en tant que 5  ; μ ; Stock de travail M. Magasin à -20  ; ° ;C.
saccharose	Fisher	S5-500
KCN	Mallinckrodt	6379	Faire un stock concentré dans de l’éthanol puis diluer avec de l’eau  ;
roténone	Sigma	R8875	Hautement toxique. Fabriqué en éthanol.
oligomycine	Sigma	O4876	Hautement toxique. Fabriqué en éthanol.
ADP	Sigma	A2754
TMRE	Sigma	8717-25mg	Dilué 100  ; μ ; Stock M avec EB immédiatement avant utilisation.
DMEM	Gibco	11965-084	1x régulier (glycémie élevée).
Pen/Strep	Invitrogen	15140-155
L-glutamine	Fisher	SH3002101	Stocker les aliquotes à -20  ; ° ; C
FBS	Lonza	14-501F	origine américaine, qualité premium. Chauffer, inactiver et stocker les aliquotes à -20  ; ° ;C.
Trypsine-EDTA	Sigma	T4049
DMSO	SIgma	D2650
Colorant de dosage des protéines (5x)	Bio-Rad	500-0006	N’importe quel dosage de protéines peut se substituer.
BSA	Fisher	BP1600-100	Faire 2 mg/ml de stock dans l’eau pour le dosage des protéines.
Poudre MTT	Sigma	M2128	Filtre sterlize 5 mg/ml stock fabriqué en PBS. Stocker les aliquotes à -20  ; ° ; C; Stocker à 4 ° ; C jusqu’à 1 semaine.
Solution de tergitol (NP-40)	Sigma	NP40S
Recombinant Human IL-1B	Gibco	PCH08014	Une fois ouvert, stocker les aliquotes à -20  ; ° ; C
Humain recombinant TNF-alpha	Gibco	PHC3015L
IFN-gamma humain recombinant	Gibco	PHC4031
Dulbeccos PBS (-/-)	Sigma	D8537	Assurez-vous qu’il est exempt d’ions Mg2+ et Ca2+.
Cytochrom c kit ELISA	R& D systems	DTC0	Human pour cellules HEK-293T.  ;