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Inhibiteur formation des synapses dans une co-culture modèle intégrant GABAergiques moyennes épineux neurones et les cellules HEK293 exprimant de façon stable GABA A Récepteurs

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DOI :

10.3791/52115

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14 novembre 2014

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1UCL School of Pharmacy, University College London

Dans cet article

Résumé

Les mécanismes moléculaires qui coordonnent la formation des synapses GABAergiques inhibiteurs cours de l'ontogenèse sont largement inconnus. Pour étudier ces processus, nous avons développé un système de modèle de co-culture qui intègre les neurones GABAergiques épineux moyen embryonnaires cultivées avec transfectées de façon stable rein embryonnaire humain 293 (HEK293) des cellules exprimant des récepteurs GABA fonctionnels A.

Résumé

Les neurones inhibiteurs agissent dans le système nerveux central pour réguler la dynamique et la coordination spatio-temporelle des réseaux neuronaux. Le GABA (acide γ-aminobutyrique) est le neurotransmetteur inhibiteur prédominant dans le cerveau. Il est libéré par les terminaisons présynaptiques des neurones inhibiteurs au sein de jonctions intercellulaires hautement spécialisées appelées synapses, où il se lie aux récepteurs GABAA (GABAARs) présents au niveau de la membrane plasmique des neurones postsynaptiques récepteurs de synapse. L’activation de ces canaux ioniques GABA entraîne un afflux de chlorure, ce qui entraîne des changements de potentiel postsynaptiques qui diminuent la probabilité que ces neurones génèrent des potentiels d’action.

Au cours du développement, divers types de neurones inhibiteurs présentant des caractéristiques morphologiques, électrophysiologiques et neurochimiques distinctes ont la capacité de reconnaître leurs neurones cibles et de former des synapses qui incorporent des sous-types spécifiques de GABAAR. Ce principe d’innervation sélective des cibles neuronales pose la question de savoir comment les partenaires synaptiques appropriés s’identifient les uns les autres.

Pour élucider les mécanismes moléculaires sous-jacents, un nouveau système modèle de co-culture in vitro a été établi, dans lequel des neurones GABAergiques épineux moyens, une population très homogène de neurones isolés du striatum embryonnaire, ont été cultivés avec des lignées cellulaires HEK293 transfectées de manière stable qui expriment différents GABAASous-types R. Les synapses se forment rapidement, efficacement et sélectivement dans ce système, et sont facilement accessibles pour la quantification. Nos résultats indiquent que divers sous-types de GABAAR diffèrent dans leur capacité à favoriser la formation de synapses, ce qui suggère que ce système modèle in vitro réduit peut être utilisé pour reproduire, au moins en partie, les conditions in vivo requises pour la reconnaissance des partenaires synaptiques appropriés et la formation de synapses spécifiques. Ici, les protocoles de culture des neurones épineux moyens et de génération de lignées cellulaires HEK293 exprimant GABAARs sont d’abord décrits, suivis d’instructions détaillées sur la façon de combiner ces deux types de cellules en co-culture et d’analyser la formation de contacts synaptiques.

Introduction

Le GABA est un des premiers neurotransmetteurs dans le cerveau embryonnaire, qui précède le neurotransmetteur excitateur le plus abondant une glutamate. Au cours du développement, le GABA dépolarise et excite les neurones immatures, jouant un rôle clé dans la régulation de la prolifération cellulaire, la migration et la formation de réseaux de neurones sans induire excitotoxicité. Dans le cerveau adulte, le potentiel d'inversion de GABA A du récepteur de canaux est déplacée vers des potentiels plus négatifs en raison d'une diminution de la concentration intracellulaire de chlorure. Ce changement est provoqué par la régulation positive de la potassium-chlorure de co-transporteur (KCC2), qui transporte le chlorure hors de la cellule, et, en parallèle, la régulation négative de la sodium-potassium-chlorure transporteur (NKCC1), qui a l'effet inverse 2.

Dans le cerveau, le GABA se lie principalement aux récepteurs GABA A soit B ou GABA à la médiation inhibition synaptique rapide ou lent, respectiveLy. GABA A R sont une classe de récepteurs ionotropiques également connus sous le nom heteropentameric ou canaux ioniques Cys-boucle ligand-dépendants. Deux molécules de GABA sont nécessaires pour l'activation du récepteur, qui est perméable aux ions chlorure et dans une moindre mesure, des ions bicarbonate. L'augmentation de la conductance du chlorure diminue l'efficacité de la dépolarisation, les événements excitateurs dans l'activation du neurone postsynaptique 3.

La diversité structurale de GABA A Rs est reconnue depuis longtemps comme un facteur clé dans la détermination de leur large éventail de propriétés fonctionnelles et pharmacologiques. Natif GABA A R sont des hétéro-pentamères composés de sous-unités avec plusieurs isoformes classés comme: α (1-6), β (1-3), γ (1-3), δ, ε, π et θ 3, avec une commune topologie transmembranaire comprenant un grand domaine N-terminal extracellulaire, quatre domaines transmembranaires (TMS), et un domaine intracellulaire majeure entre les MT 3 et 4 4. Leβ3 et γ2 sous-unités sont essentielles pour l'inhibition synaptique et la survie de l'organisme, parce que les souris portant suppression génétique de ces sous-unités meurent après la naissance 5,6. En revanche, les isoformes individuelles de la sous-unité α sont importants pour la fonction de connexions synaptiques spécifiques du cerveau associée à des comportements différents tels que l'anxiété, la sédation, excitation, et d'autres, mais ne sont pas, individuellement, indispensable à la vie 9.7. GABA A Rs sont les principaux sites d'action pour une variété de médicaments avec sédatif puissant, hypnotique, anxiolytique et effets anticonvulsivants, tels que les benzodiazépines, les barbituriques, les neurostéroïdes et anesthésiques 7,10,11.

Synaptic GABA A R contiennent généralement une sous-unité γ2, deux sous-unités β (plus communément β2 ou β3) et deux sous-unités α (α1, α2, α3 ou α5) 12,13. La classe prédominante des récepteurs extra-synaptique contient la sous-unité δ en combinaisonavec deux sous-unités α de (α4 ou α6), et les deux sous-unités β (β2 ou β3) 14. Localisation subcellulaire de GABA A Rs aux axones ou dendrites, soma et l'insertion dans la membrane plasmique est dépendante de la présence de sous-unités β 15,16. Cependant, l'incorporation sélective de différents sous-types GABA A R dans différents types de synapses est bien corrélée avec la présence de sous-unités α spécifiques (α1, α2, α3 ou α5) 7,17,18. Surtout, la suppression de la sous-unité α1 ou α2 chez la souris provoque des changements ultrastructuraux au niveau des synapses inhibitrices 19. Ceci suggère que le GABA A se RS peut jouer un rôle direct dans la régulation de la formation des synapses.

Les données indiquent que le développement des synapses GABAergiques est une séquence précisément coordonné des événements, dans laquelle les deux cibles neuronales contactés par différents types d'axones inhibiteurs et les récepteurs qui sont regroupés auchaque classe de synapses inhibitrices sont sélectifs et fonctionnellement à l'écoute 17,20-22. Ce principe fondamental de la spécificité au niveau des synapses GABAergiques soulève la question de savoir comment les partenaires avant et post-synaptiques se reconnaissent mutuellement lors de l'initiation de contacts synaptiques.

Les essais in vitro de co-culture ont été appliquées avec succès pour étudier certains des mécanismes de la formation des synapses et de tester le rôle des protéines transmembranaires lièvre synaptiques individuels dans ce processus. Un des trans-synaptiques interaction combinaisons de protéines communes qui fonctionnent de façon bidirectionnelle à la médiation la formation des synapses et la maturation, sont la neurexines (Nrxns) et neuroligines (LN). Nrxns sont des protéines qui présentent présynaptiques épissage alternatif à l'intérieur de leurs domaines de protéines de liaison à l'hormone de la laminine-neurexine sexe, ce qui donne lieu à de nombreuses isoformes différentes 23. Alors que le Nrxns également interagir avec d'autres protéines, LN sont pensés pour être leur omniprésent pa post-synaptiquemes partenaires 24. Ensemble, ces protéines contribuent à maintenir les membranes présynaptiques et post-synaptiques en étroite et rigide apposition 25. Les deux isoformes les plus abondantes sont NL-1 et F-2 qui sont présents à excitateurs et inhibiteurs synapses, respectivement 26. L'un des premiers systèmes de modèles de co-culture, conçues pour étudier les interactions de protéines trans-synaptique, employer différents types de cellules non neuronales, des lignées cellulaires les plus couramment immortelles tels que rein embryonnaire humain (HEK), des cellules 293, à NL- surexpriment 2. Lorsque ces cellules ont été cultivées avec les neurones pontique, une accumulation de protéines présynaptiques à proximité immédiate de la surface des cellules HEK a été observée, ce qui indique la formation de contacts synaptiques analogue. Ajout de soluble β-neurexine à ces co-cultures inhibé la formation de contacts, ce qui suggère que les interactions trans-synaptiques entre Nrxns et LN sont nécessaires pour la formation de contact synaptique 27. En outre, l'expression transitoirede β-neurexine en COS de cellules (C V-1 (simien) en O rigine, et transportant le matériel génétique S V40) en co-culture avec glutamatergique hippocampique dissocié et les neurones GABAergiques expression induite de la gephryin protéique post-synaptique et de sous-unités GABA A R γ2 et α2 aux points de contact entre ces deux types de cellules 28. Un autre exemple d'un modèle de co-culture utilisé pour étudier la formation des synapses impliqué cellules HEK293 transfectées de manière transitoire, avec sous-unités GABA A R α2 / β3 / γ2 et NL-2, et d'une population mixte de 29 neurones hypothalamiques. Cette étude a conclu que l'expression de NL-2 est une exigence absolue pour la formation de synapses inhibitrices.

Α1 Cependant, dans la récente étude de co-culture, transfectées de façon stable / β2 / γ2 GABA A R dans les cellules HEK293 ont été jugées suffisantes pour induire des synapses fonctionnelles en cas de co-cultivées avec des med GABAergiquesneurones épineux ium, sans avoir besoin de protéines supplémentaires d'adhésion trans-synaptiques ou post-synaptiques. Cependant, on a observé une augmentation importante dans la formation des synapses et la force quand NL-2 a été co-exprimé avec GABA A Rs 30. Cela indique que ce système de modèle de co-culture a des avantages sur les systèmes de modèles décrits précédemment, plus évidemment une augmentation de la sensibilité et de la fiabilité de la détection de contact synaptique. Deux facteurs importants qui contribuent à l'amélioration globale de détection de contacts synaptiques sont: i) l'utilisation de transfectées de façon stable lignées cellulaires HEK293 avec expression élevé et uniforme de sous-unités GABA A R à la surface des cellules individuelles. Cette cohérence facilite les comparaisons quantitatives entre les différentes conditions de co-culture. ii) L'utilisation d'une population pure de GABAergiques neurones épineux moyens du striatum en culture de l'embryon 31 élimine les complications et les ambiguïtés résultant de l'utilisation de populations neuronales mixtes et allows, par exemple, la sélection des types les plus appropriées post-synaptiques GABA A R qui peuvent être comparés les uns avec les autres pendant la formation des synapses.

Formation des synapses est pensé pour impliquer de nombreux signaux trans-synaptiques au sein des complexes d'adhérence cellulaire pré et post-synaptiques. En raison de la nature bidirectionnelle de signalisation synaptique et le nombre considérable de molécules d'adhérence cellulaire, il est difficile d'identifier les éléments clés impliquées dans la formation des synapses. Ainsi, la transfection d'une seule protéine d'adhésion cellulaire dans une cellule non-neuronale (dans ce cas, les deux cibles post-synaptiques les plus répandues pour GABAergiques neurones épineux moyens in vivo, α1 / β2 / γ2 ou α1 / β3 / γ2 GABA A Rs 32) considérablement réduit la complexité des signaux trans-synaptique disponibles à la surface post-synaptique et permet une analyse quantitative précise de l'efficacité de cette protéine dans la promotion de la formation des synapses.

Protocole

Sprague-Dawley rats ou BAB / c des souris consanguines (Harlan, Royaume-Uni, le nombre de femmes enceintes utilisée était de 30) étaient logés et sacrifié selon UK Home Office [et directive du Conseil des Communautés européennes du 24 Novembre 1986 (86/609 / CEE) ] lignes directrices. Le projet a été officiellement approuvé par l'École UCL du comité d'éthique pharmacie.

1. Préparation des instruments, milieu de culture, et les plats

  1. Allumez et nettoyer la hotte à flux laminaire avec 70% d'éthanol afin de travailler dans des conditions stériles à tout moment.
  2. Préparer HEK293 milieu de culture cellulaire contenant du milieu Eagle modifié pH de Dulbecco 7,4 (DMEM, 500 ml), L-glutamine (2 mM), de la pénicilline (50 unités / ml), streptomycine (50 ug / ml), et du sérum bovin fœtal (10 %).
    REMARQUE: la pénicilline et de la streptomycine sont irritants.
  3. Préparation du milieu de culture exempt de sérum neuronale, contenant du milieu Neurobasal pH 7,4 (500 ml), supplément B27 (25 ml), L-glutamine (2 mM), pénicilline(50 unités / ml), streptomycine (50 ug / ml), et de glucose (6 mM).
  4. Préparer 500 ml d'une solution saline tamponnée par HEPES (HBSS), contenant HBSS 10x stock (50 ml), de l'HEPES (1 M) (5 ml) et d'eau (445 ml), pH 7,4.
  5. Autoclave de solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4; 1 L), de l'eau (1 L), des lamelles de verre (13 mm de diamètre) et les pipettes Pasteur en verre pour les stériliser.

2. Préparation de HEK293 lignée cellulaire stable exprimant α1 / β3 / γ2-GABA A R

  1. Plaque 2x10 6 cellules HEK293 dans une plaque de culture de tissu de 10 cm stérile et incuber à 37 ° С dans une humidifié à 5% de dioxyde de carbone (CO 2) l'atmosphère (CO 2 de l'incubateur) afin d'atteindre 70-90% de confluence pendant une nuit.
  2. Le jour suivant, transfecter des cellules HEK293 avec le GABA A R sous-unité α1 d'ADNc dans le vecteur 3,1 (+) de l'expression RDCp incorporant le disulfate de G418 (Tableau 1) du gène de résistance,et le GABA A R sous-unité β3 de l'ADNc dans le vecteur d'expression incorporant la phléomycine D1 (tableau 1), le gène de résistance (à la fois sous le contrôle d'un cytomégalovirus humain précoce immédiat (CMV)), en utilisant une formulation de liposomes cationiques, qui forme un complexe avec négativement molécules chargées d'acide nucléique (tableau 1) selon le protocole du fabricant.
  3. Brièvement, ajouter 500 ul de milieu de sérum réduit (pH 7,4; tableau 1) et 7,5 ug de chaque construction d'ADNc à un tube de 15 ml à centrifuger stérile, suivi par 15 pi de liposomes transfection réactif tampon, et doucement mélanger avant de laisser à la température ambiante pour 5 min.
  4. A ce mélange, ajouter 8,75 ul de réactif de transfection liposomale et mélanger doucement avant de laisser à la température ambiante pendant 30 min. Suite à cela, ajouter 3 ml de milieu de culture HEK293 de cellules (sans antibiotiques), une pipette le contenu du tube de centrifugation deux fois de haut en bas, transfer goutte à goutte sur les cellules en croissance dans une boîte de culture de tissu de 10 cm, et incuber pendant 48 heures à 37 ° С dans une humidifié à 5% de CO 2 atmosphérique (CO 2 incubateur).
  5. Laver les cellules HEK293 doucement avec du PBS stérile, pH 7,4, et diluer les cellules HEK293 transfectées dans de nouvelles boîtes de culture de tissu de 10 cm, dans les rapports suivants: 1: 3, 1: 5, 1: 7, 01:10, 01:15 et 01:20. Cela garantit que les cellules ne deviennent pas trop confluente.
  6. Début de la sélection des cellules HEK293 exprimant les sous-unités GABA A R en ajoutant 800 ug / ml de chaque marqueur de sélection antibiotique, G418, et la phléomycine D1, au milieu de culture. Incuber les cellules à 37 ° С dans une humidifié à 5% de CO 2, atmosphère (incubateur à CO 2) et de remplacer le milieu contenant l'antibiotique (10 ml) tous les 2 jours.
  7. Lorsque de petites colonies blanches commencent à se former (généralement, après environ 7 jours), sélectionner avec soin une colonie unique à partir de chacun des plats et collecter à l'aide d'un P1000 stérilepointe de la pipette. Transférer dans un puits d'une plaque de culture tissulaire à 24 puits contenant 500 pi de milieu et remettre en suspension par pipetage soigneusement le milieu de haut en bas. Assurez-vous que exactement une colonie est transférée dans chaque puits (un total de 5-20 colonies est conseillé). Incuber les cellules à 37 ° С dans une humidifié à 5% de CO 2, atmosphère (incubateur à CO 2) et de remplacer le milieu contenant l'antibiotique tous les 2 jours.
  8. Une fois que les colonies deviennent 70 à 80% de confluence, le milieu pipette doucement de haut en bas pour déloger les cellules de la partie inférieure de la plaque de culture tissulaire à 24 puits. Transférer et répartir la suspension de cellules entre deux puits dans une plaque de culture tissulaire à 6 puits. Incuber les cellules à 37 ° С dans une humidifié à 5% de CO 2, atmosphère (incubateur à CO 2) et de remplacer le milieu contenant l'antibiotique tous les 2 jours.
  9. Une fois que 70 à 80% de confluence, les cellules de recueillir une des deux puits contenant les cellules provenant de la même unique côlonlysats de protéines et y préparer. Brièvement, les cellules laver 2 fois avec du PBS, pH 7,4, et ajouter 200 ul de 2% de dodécylsulfate de sodium (SDS) dans du PBS, pH 7,4. Recueillir le lysat et le transférer dans le tube à centrifuger. Mesurer la concentration en protéine en utilisant le réactif de protéine BCA (voir tableau 1) selon le protocole du fabricant. Analyser l'expression de α1 et β3 sous-unités de récepteurs GABA A par SDS / PAGE et immunoblot en utilisant des anticorps spécifiques de la sous-unité (spécifique anti-α1 lapin et le lapin anticorps GABA A R anti-spécifique β3, voir le tableau 1 pour les informations sur ces des anticorps).
  10. Déloger et transférer clones seulement positifs des puits restants à de plus grandes boîtes de 6 cm de culture de tissus. Incuber les cellules à 37 ° С dans une humidifié à 5% de CO 2, atmosphère (incubateur à CO 2) et de remplacer le milieu contenant l'antibiotique tous les 2 jours.
  11. Peu à peu, d'étendre les colonies de cellules uelon la sélection par antibiotique en les transférant à 10 cm des boîtes de culture de tissu et enfin à des flacons de culture de tissus (flacons T-75). Incuber les cellules à 37 ° С dans une humidifié à 5% de CO 2, atmosphère (incubateur à CO 2) et de remplacer le milieu contenant l'antibiotique tous les 2 jours.
  12. Plaque 70.000 cellules de chaque colonie sur des lamelles de verre (13 mm de diamètre) et de fixer les cellules à analyser l'expression de la surface cellulaire et la co-localisation de sous-unités GABA A R par immunofluorescence.
  13. Sélectionner le clone positif de cellules HEK293 exprimant de hauts niveaux de deux α1 et β3 sous-unités de récepteurs GABA A, la plaque 2 x 10 6 cellules dans une boîte de culture tissulaire stérile de 10 cm et incuber à 37 ° С dans un 5% de CO2 atmosphère humidifiée ( incubateur à CO 2) pendant la nuit. Veiller à ce que les cellules sont incubées en contenant un antibiotique (G418 et phléomycine D1) moyen à tout moment.
  14. Le jour suivant, la transfection de cellules HEK293 cellules par GABA A R γ2s sous-unité de l'ADNc dans le pcDNA 3.1 ™ (+) de vecteur d'expression incorporant le gène de résistance à l'hygromycine B en utilisant un réactif de transfection des lipides des liposomes non (tableau 1).
    Remarque: cette méthode de transfection permet une meilleure survie et une plus grande efficacité de l'expression de protéines étrangères dans les lignes à croissance lente stables de cellules qui sont sous sélection continue avec des antibiotiques.
  15. Dans 15 ml d'un tube de centrifugation stérile, ajouter 250 ul d'un amplificateur et une condensation de l'ADN tampon (tableau 1) et 1,4 pg de γ2s GABA A ADNc de sous-unité de récepteur. Ajouter 11.2 pi de Enhancer et vortex pendant 1 seconde avant de quitter à la température ambiante pendant 5 min.
  16. Ajouter 35 pi de liposomes non réactif de transfection lipide et vortex pendant 10 secondes avant de laisser à la température ambiante pendant 10 min. Ajouter 3 ml de G418 / phléomycine D1 contenant du milieu pipette et le contenu du tube de centrifugation de haut en bas deux fois befminerai transférer goutte à goutte sur les cellules en croissance dans une plaque de culture de tissu de 10 cm. Incuber les cellules pendant 48 heures à 37 ° С dans une humidifié à 5% de CO 2, atmosphère (CO 2 incubateur).
  17. Laver les cellules doucement avec du PBS stérile et les diluer dans de nouvelles boîtes de culture tissulaire de 10 cm, dans les rapports suivants: 1: 3, 1: 5, 1: 7, 01:10, 01:15 et 01:20.
  18. Point de sélection de cellules α1 / de β3-HEK293 exprimant la sous-unité γ2s en ajoutant 800 ug / ml de marqueur de sélection antibiotique hygromycine B au G418 / phléomycine D1 milieu contenant. Remplacer l'ancien milieu avec le G418 frais / phléomycine D1 / moyen Hygromycine B contenant (10 ml) tous les 2 jours.
  19. Répéter les étapes 02.07 à 02.12, en vertu de sélection continue à G418 / phléomycine D1 / hygromycine B contenant un milieu de culture cellulaire.
  20. Stocker les clones positifs à -140 ° C dans un milieu de culture cellulaire sans antibiotique et 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO) pour l'utilisation future.
  21. Testez le niveaud'expression de α1, β3 et γ2s sous-unités GABA A R par immuno et immunofluorescence dans chaque clone après dégivrage, parce que l'expression peut changer en raison de réduction de la survie de cellules dans le choix des antibiotiques.

3. Entretien de lignées cellulaires HEK293

  1. Décongélation d'un flacon de contrôle des cellules HEK293 ou les exprimant Rs soit α1 / β2 / γ2-GABA A (tableau 1) ou α1 / β3 / Rs γ2-GABA A (décrit ci-dessus) dans 10 ml de milieu de culture de cellules dans un 15 ml stérile tube de centrifugeuse. Centrifugeuse à 440 g pendant 5 min pour éliminer l'excès de DMSO.
  2. Retirer les cellules du surnageant et remettre en suspension dans 1 ml de milieu de culture de cellules fraîches.
  3. Tout d'abord ajouter 9 ml de milieu de culture de cellules fraîches à une boîte de 10 cm pour culture de tissu revêtu de poly-D-lysine (0,1 mg / ml), puis 1 ml de cellules remises en suspension. Agiter doucement, d'un côté à-côté, pour disperser les cellules et incuber à 37 ° С dans une humidifié5% de CO 2, atmosphère (CO 2 incubateur).
  4. Le jour suivant, aspirer le milieu pour enlever les débris cellulaires et le remplacer par 10 ml de milieu de culture de cellules HEK293 frais.
  5. Sélectionner des lignées cellulaires stables avec des antibiotiques pour éliminer toutes les cellules qui ne manifestent pas les sous-unités GABA A R et manquent par conséquent également l'expression des marqueurs de résistance aux antibiotiques. Pour la ligne / β2 / γ2 cellulaire stable de α1, remplacer milieu normal avec du milieu de culture cellulaire frais contenant G418 (800 ug / ml). Pour la ligne α1 / β3 / cellulaire γ2, remplacer par du milieu de culture cellulaire frais contenant G418 (800 ug / ml), la phléomycine D1 (800 ug / ml) et l'hygromycine B (800 ug / ml). ATTENTION! G418 est un produit irritant et Hygromycine B est corrosif, toxique et irritant.
  6. Passage des cellules dans une nouvelle boîte de culture tissulaire par l'ensemencement à une densité inférieure à une fois qu'ils atteignent> 70% de confluence. Aspirer 10 ml de milieu de culture de cellules et laver deux fois brièvement avecPBS, pH 7,4. Ajouter 1 ml de solution de trypsine-EDTA, une solution de la protease trypsine (trypsine à 0,05%) et un agent chélatant le Ca2 + EDTA (0,02%) dans du PBS, pH 7,4, pour détacher les cellules de la boîte. ATTENTION! Trypsine-EDTA solution est un irritant.
  7. Ajouter 10 ml de milieu de culture cellulaire contenant les antibiotiques corrects, à l'antenne et aspirer les cellules. Centrifuger les cellules à 440 xg pendant 5 min et les remettre en suspension dans 5 ml de milieu de culture cellulaire.
  8. Passage des cellules en utilisant une dilution 1:10 dans un nouveau flacon de culture tissulaire (ballon T-75) contenant du milieu frais de culture de cellules et les antibiotiques appropriés. Incuber les cellules à 37 ° С dans une humidifié à 5% de CO 2, atmosphère (incubateur à CO 2) et de remplacer le milieu tous les deux jours. Passage des cellules lorsque> 70% de confluence (voir l'étape 2.8).

4. Préparation de GABAergique moyen épineux Neuron Culture

  1. Dans des conditions stériles préparer un nous 24ll plaque avec de la poly-L-lysine (0,1 mg / ml) doté d'un revêtement de lamelles (13 mm de diamètre) et incuber à 37 ° С dans une humidifié à 5% de CO 2, atmosphère (CO 2 incubateur).
  2. Le lendemain, aspirer avec une pipette la poly-L-lysine excès et se lavent avec deux lamelles bref 10 secondes et deux longues lavages de 5 min avec de l'eau stérile. Ajouter la laminine (0,01 mg / ml) pendant une nuit et on incube à 37 ° С dans une humidifié à 5% de CO 2, atmosphère (CO 2 incubateur).
  3. Désinfectez la zone de dissection avec 70% d'éthanol et de recueillir un ensemble d'outils de dissection tels que forceps de tissu courbe et droite, des ciseaux et une pince à épiler, et la placer dans 70% d'éthanol pour stériliser complètement les instruments de dissection.
  4. Placez le enceinte rat / souris euthanasiés avec du CO 2 sur le dos et nettoyer la peau de son abdomen avec 70% d'éthanol. Pincer la peau avec des pinces et couper autour de l'abdomen à travers la peau, les muscles et le péritoine, à révéler les organes internes et de l'utérusavec des embryons clairement. Extraire les embryons (E16-17) de l'utérus et les placer dans une boîte de Pétri avec réfrigérés PBS.
  5. Placez les embryons dans la hotte à flux laminaire et décapiter eux, recueillir les têtes dans une nouvelle boîte de Pétri avec frais HBSS.
  6. Sous un microscope de dissection, disséquer le cerveau à l'aide des pinces courbes et droites. Placez le cerveau dans une nouvelle boîte de Pétri contenant glacée HBSS.
  7. Séparer les deux hémisphères cérébraux et retirer délicatement les méninges. Coupez le long de la ligne de l'hippocampe et le cortex peler pour révéler le striatum. Observez le striatum comme une structure blanc strié à la partie antérieure de l'hémisphère.
  8. Disséquer le striatum et le couper en très petits morceaux (1 - 2 mm de diamètre) et utiliser une pipette Pasteur polie au feu de rassembler le matériel dans un tube de 15 ml à centrifuger stérile avec un volume total de 1 ml. Poli-feu assure le matériel est prélevé sans être endommagé.
  9. Utilisation de la TI poli-le-feup de la pipette Pasteur, aspirer les cellules et libérer les 8 - 10 fois. Prenant une nouvelle pipette avec une pointe de vernis-le-feu d'environ 30% de son diamètre initial (1 mm), triturer la solution encore 4 - 6 fois jusqu'à ce qu'il apparaisse homogène.
  10. Filtrer les cellules en utilisant une cellule de filtre en nylon de 100 um dans un tube à centrifuger stérile frais.
  11. Compter les cellules avec un hémocytomètre et la plaque 70 000 cellules dans 500 pi de milieu de culture neuronale par puits dans une plaque de culture tissulaire à 24 puits. Agiter les puits de gauche à droite et incuber à 37 ° С dans une humidifié à 5% de CO 2, atmosphère (CO 2 incubateur) pendant 14 jours in vitro (DIV).
  12. Après 7 jours, vérifier la pureté des cultures de neurones et, si les cellules gliales sont présents, ajouter cytosine β-D-arabinoside (Ara-C, 5 M) aux puits pour arrêter leur prolifération. Pour ce faire, retirez 250 pi de milieu de culture neuronale (pH 7,4) de chaque puits et ajouter 250 microlitres de milieu frais contiennentING Ara-C. ATTENTION! Ara-C est un irritant.

5. Co-culture Préparation

  1. Au jour 11 de culture neuronale, une couche plaque à 6 puits avec de la poly-D-lysine (0,1 mg / ml) dans des conditions stériles et incuber pendant une nuit à 37 ° С dans une humidifié à 5% de CO 2, atmosphère (CO 2 incubateur).
  2. Le lendemain (jour 12 de culture neuronale), aspirer la poly-D-lysine excès et laver les puits 2x brièvement et 2x pendant 5 min avec de l'eau stérile avant d'ajouter un milieu de culture de cellules fraîches (sans antibiotiques) pour recouvrir les puits avec une petite quantité de sérum à partir du milieu.
  3. Aspirer le milieu de culture à partir de la fiole de culture de tissu (T-75). Rincer les cellules deux fois avec du PBS avant d'ajouter 1 ml de Ca 2+ / Mg 2+ agent de -chelating EDTA (0,48 mM) qui se dissocie en douceur et de façon non enzymatique des cellules. Agiter les cellules pour les détacher de la partie inférieure du ballon de tissu.
  4. Ajouter 10 ml de milieu de culture de cellules (sans antibiotiques car cela pourrait interférer avec la transfection), aspirer les cellules et les place dans un tube à centrifuger stérile. Pellet cellules à 440 g pendant 5 min à l'aide d'un banc-centrifugeuse basse vitesse.
  5. Eliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de milieu de culture de cellules fraîches. L'utilisation d'un hémocytomètre, compter les cellules et la plaque à une densité de 3 x 10 5 cellules par puits dans une plaque à 6 puits. Agiter doucement et incuber pendant 24 heures à 37 ° С dans une humidifié à 5% de CO 2 atmosphérique (CO 2 incubateur).
  6. Le lendemain (jour 13 de culture neuronale) transfecter transitoirement les cellules HEK293 avec mCherry ADNc dans pcDNA3 construction d'expression en utilisant le réactif de transfection liposomale. En bref, dans un tube à centrifuger stérile, ajouter 500 ul de milieu de sérum réduit et 5 ug d'ADNc mCherry. Ajouter 5 ul de réactif liposomale tampon et mélanger délicatement avant de partir à la température ambiante pendant 5 min.
  7. Ajouter 8,75 pi de transfection liposomale GCIent et mélanger délicatement avant de partir à la température ambiante pendant 30 min. Pipeter le contenu du tube de centrifugation de deux fois de haut en bas, le transfert goutte à goutte dans chaque puits sur la plaque de culture de tissu à 6 puits et incuber à 37 ° С dans un 5% de CO 2, atmosphère humidifiée (incubateur à CO 2).
  8. Le jour suivant (jour 14 de culture neuronale), aspirer le milieu de chacun des six puits de culture de cellules HEK293 et ​​laver chaque puits brièvement deux fois avec du PBS (pH 7,4). Ajouter 300 ul de Ca 2+ / Mg 2+ agent de -chelating EDTA (0,48 mM) et 200 pi de trypsine-EDTA (de 0,02 à 0,48 mM) à une solution dans chaque puits et incuber à 37 ° С pendant 5 min.
  9. Ajouter 1 ml de frais HEK293 milieu de culture de cellules par puits (ce étanche la trypsine) et aspirer les cellules individuelles dans un tube de 15 ml à centrifuger stérile. Centrifuger les cellules à 440 g pendant 5 min à température ambiante et éliminer le surnageant. Remettre en suspension le culot dans 500 pl de milieu de culture neuronale (pH 7,4).
  10. En utilisant un hématimètre, compter les cellules et les semences à une densité de 30 000 cellules par puits dans une plaque de culture tissulaire 24 puits contenant les neurones. Agiter la plaque pour disperser les cellules et incuber les co-cultures à 37 ° С dans un 5% de CO 2, atmosphère humidifiée (incubateur à CO2) pendant 24 heures.

6. Analyse des contacts synaptiques et leur activité

  1. Après 23 h en co-culture, étudier la formation des contacts «actifs» entre GABAergiques neurones épineux moyens et des cellules HEK293 en utilisant l'absorption dépendant de l'activité de l'anticorps spécifique à un domaine luminal anti-synaptotagmine conjugué avec un colorant fluorescent (Cy5, voir le tableau 1) .
    NOTE: L'anticorps ne pouvoir accéder au domaine luminal de la synaptotagmine, à laquelle il se lie quand il ya une continuité entre la lumière de vésicules synaptiques et l'espace extracellulaire. Cela se produit en particulier lors de la libération de neurotransmetteurs, ce qui en fait antibOdy un excellent marqueur des terminaisons présynaptiques actives.
  2. Tout d'abord rincer les co-cultures avec un milieu neuronale (Neurobasal un milieu, pH 7,4; voir le tableau 1) et ajouter souris Cy5-anticorps marqué anti-synaptotagmine, dilué 1:50 dans un milieu neuronale (Neurobasal un milieu, pH 7,4), à la cultures, pendant 30 min. Incuber les cellules pendant ce temps à 37 ° С dans un 5% de CO 2, atmosphère humidifiée (incubateur à CO 2).
  3. Pour supprimer l'accès de l'anticorps, laver les co-cultures brièvement trois fois: d'abord avec PBS froid normal (pH 7,4), deuxième avec du PBS froid (pH 7,4) contenant 200 mM de NaCl, et le troisième avec du PBS froid normal (pH 7,4)
  4. Fixer les cellules avec 300 pi de paraformaldehyde à 4% / 4% de saccharose dans du PBS (PFA, pH 7,4) pendant 10 min avec agitation. Laver les cellules deux fois brièvement avec du PBS (pH 7,4) avec ensuite deux lavages de plus de 10 min.
  5. Ajouter la glycine (0,3 M) à chaque puits pendant 10 minutes avec agitation pour étancher PFA.
  6. Laver les cellules briefly deux fois avec du PBS (pH 7,4) puis avec deux longues 10 min de lavage avant d'ajouter 300 ul de solution de blocage (1% (p / v) de sérum-albumine bovine (BSA) dans du PBS, pH 7,4) afin de réduire la liaison non spécifique de des anticorps.
  7. Aspirer la solution de blocage et ajouter le cochon de Guinée anticorps anti-GABA A R-γ2 dirigé contre le γ2 domaine N-terminal 33 (1: 3000 dans du PBS, pH 7,4) pendant une nuit à 4 ° С.
  8. Le lendemain, aspirer l'anticorps primaire à partir des puits et laver les cellules brièvement deux fois avec du PBS puis avec deux longues 10 min lavages.
  9. Perméabiliser les cellules à l'aide de Triton X-100 (0,1%) dans une solution de blocage pendant 30 minutes à température ambiante.
  10. Laver les cellules brièvement deux fois avec du PBS (pH 7,4) puis avec deux longues 10 min de lavage avant d'ajouter une ou l'autre de la décarboxylase de l'acide anti-glutamique souris (TAG) 65 anticorps (1: 4000, tableau 1) ou l'anticorps de souris anti-synapsine I ( 1: 1000, tableau 1) pendant 120 minutes à t ambianteemperature.
  11. Laver les cellules deux fois brièvement avec du PBS (pH 7,4) avec ensuite deux lavages de plus de 10 min, puis ajouter une solution de blocage pendant 30 minutes à température ambiante.
  12. Centrifugeuse les anticorps secondaires appropriés (chèvre typiquement anti-Guinée porc IgG conjugué à Cy5, de chèvre anti-IgG de souris conjugué à Alexa Fluor 488 ou de chèvre anti-IgG de souris Alexa Fluor 405, le tout à 2 pg / ml) pour éliminer les agrégats d'anticorps à 21910 g pendant 10 min, et ajouter des anticorps (1: 750) à la solution de blocage. Appliquer dans les puits pendant 1 heure et couvrir de papier d'aluminium pour protéger les fluorophores exposés à la lumière et photoblanchiment conséquente.
  13. Enfin, laver les cellules brièvement deux fois avec du PBS (pH 7,4), puis avec deux plus lavages de 10 min pour éliminer tout anticorps secondaire non lié et monter les lamelles en utilisant le réactif de montage (Prolonger or, tableau 1) environ 10 pi par lamelle. Laisser 24 heures pour régler à la température ambiante tout en étant protégé de la lumière avant de passer à 4° С pour le stockage à long terme.
  14. Analyser les échantillons en utilisant un microscope confocal à balayage laser avec un objectif 63X à immersion dans l'huile. Assurer les niveaux de lumière et le gain du détecteur est réglé pour éviter la saturation.
  15. Observez contacts synaptiques comme potentiels que les régions de co-localisation entre les terminaisons présynaptiques positifs pour GAD65, Synapsin I ou Cy5-anticorps anti-synaptotagmine et les post-synaptiques des cellules HEK293 visualisées par DIC ou par la indicateur fluorescent mCherry.
  16. Comptez contacts synaptiques comme potentiels en utilisant des séries Z-pile de sections optiques (8 - 10) grâce à une profondeur de 4 - 5 um par cellule en utilisant le logiciel d'imagerie.

Résultats

Le protocole de ce système de modèle de co-culture de cellules HEK293-neurone a été finement réglé pour permettre la survie cellulaire optimale. Dans ce système, la formation de contacts synaptiques-comme et leur analyse repose sur une expression stable et uniforme de tous les trois sous-unités GABA A R qui assemblent en un récepteur fonctionnel. Il est donc important d'utiliser l'analyse immunocytochimique à l'essai pour l'expression de la sous-unité à la surface de la cellule HEK293 avant de les ajouter à des cultures de neurones. Dans ces expériences, l'expression de surface cellulaire de α1, β2 et des sous-unités γ2 (figure 1A), ou α1, β3 et γ2 sous-unités (figure 1b), a été détectée en utilisant des anticorps spécifiques de sous-unités qui se lient à des epitopes extracellulaires de ces sous-unités. Un degré élevé de co-localisation entre ces sous-unités à la surface HEK293 a été démontrée.

Après confirmation de l'expression de surface et co-localisation de GABA ALes sous-unités R dans des cellules HEK293, des co-cultures ont été préparées en utilisant des cellules HEK293 exprimant les sous-unités α1 / β2 / γ2 GABAA et R neurones épineux moyens cultivées pendant 14 jours (14 jours in vitro (DIV)). Les cellules de co-culture ont été incubées pendant 24 heures, fixées et analysées en utilisant l'immunocytochimie et microscopie confocale. Analyse des contacts indiqué que GABAergiques terminaisons axonales de GAD65 positif formés que des contacts sporadiques avec le contrôle des cellules HEK293 (Figure 2A, 2B). Le nombre de contacts détectés à 4 heures était de 7,3 ± 0,9 par cellule HEK293, et ce nombre a été réduit à 5,5 ± 0,5 connexions (moyenne ± SEM) par cellule HEK293 à 24 heures après l'ajout de cellules HEK293 pour les neurones en culture. En revanche, les terminaux GAD65 positifs axonales GABAergiques formés de nombreux contacts synaptiques comme avec des cellules HEK293 exprimant GABA A Rs. Le nombre de contacts obtenus à 4 heures après l'ajout de cellules HEK293 était de 28,3 ± 4,7 par cellule HEK293, et ce nombre était nouvelle augmentationd à 52,1 ± 6,3 (moyenne ± SEM) par cellule HEK293 à 24 h en co-culture (Figure 2A, 2B).

Pour déterminer si ces contacts synaptiques comme étaient «actif», c.-à-soutenu la libération du transmetteur vésiculaire, un anticorps conjugué Cy5 vésicule-luminale domaine spécifique anti-synaptotagmine a été ajouté au milieu de co-culture après 23 heures d'incubation. Cet anticorps est seulement incorporée dans les terminaisons nerveuses présynaptiques quand un pore se forme entre la lumière de vésicules synaptiques et le fluide extracellulaire dans la fente synaptique au cours de la libération de neurotransmetteurs. Suite à la publication, le pore se referme, laissant le synaptotagmine anticorps fluorescent Cy5 conjugué attaché à synaptotagmine l'intérieur de la vésicule. De cette façon, seuls les vésicules qui participent activement à la libération de neurotransmetteurs sont marqués avec l'anticorps. Dans ces expériences, peu ou pas de contacts entre le contrôle des cellules HEK293 et ​​les bornes de neurones épineux moyens étaient «actifs & #8217; comme montré par l'absence de co-localisation entre la présynaptique GAD65 / synaptotagmine fluorescence et mCherry fluorescence dans des cellules HEK293 (figure 3A). En revanche, de nombreux contacts «actifs» ont été formés entre les bornes épineux de neurones moyennes et α1 / β2 / γ2 exprimant cellules HEK293, comme l'a révélé un degré élevé de co-localisation entre GAD65 / synaptotagmine et mCherry, exprimé spécifiquement dans les cellules HEK293 ( Figure 3B).

Α1 Pour tester si un autre sous-type de GABA A R peut également favoriser la formation de la synapse comme in vitro, nous avons co-culture / β3 / γ2 exprimant cellules HEK293 avec les neurones épineux moyens. Encore une fois, les cellules de contrôle HEK293 ont rarement reçu des contacts avec des terminaisons présynaptiques Synapsin positif atteignant 10,8 ± 0,48 (moyenne ± SEM) contacts par cellule HEK293 après 24 h en co-culture (figure 4A gauche, 4B). Cependant, les cellules HEK293 exprimantα1 / β3 / γ2 forme GABA A Rs beaucoup plus de contacts synaptiques comme avec les terminaux présynaptiques Synapsin positif de neurones épineux moyens atteignant 25,3 ± 0,27 (moyenne ± SEM) contacts par cellule HEK293 après 24 h en co-culture (Figure droit 4A, 4B). Ceci indique que α1 / β3 / γ2 GABAA R exprimé dans des cellules HEK 293 sont également capables de favoriser la formation de contact synaptique, bien que leur efficacité est inférieure à la puissance de α1 / β2 / γ2 GABAA contenant Rs.

Ces expériences indiquent que le système de co-culture modèle développé dans notre laboratoire permet une analyse quantitative de la formation de contact synaptique in vitro ainsi que l'évaluation de l'efficacité de différents sous-types de GABA A R dans ce processus. Ces expériences démontrent en outre que Rs GABA A, en plus d'être des composants fonctionnels critiques de synapses GABAergiques, peuvent jouer un rôle clédans le processus de reconnaissance et de formation de contacts synaptiques entre les neurones inhibiteurs et les cellules neuronales cibles appropriées, indépendamment des autres protéines d'adhésion synaptiques.

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Figure 1. immunocytochimique analyse de l'expression de GABA A R α1 / β2 / γ2 ou α1 / β3 / γ2 dans des lignées stables de cellules HEK293. Les anticorps qui reconnaissent les domaines extracellulaires des sous-unités GABA A R ont été utilisés pour les récepteurs d'étiquettes exprimées à la surface cellulaire. ( A) lignée cellulaire HEK293 α1 exprimer (Alexa Fluor 488), β2 (Alexa Fluor 555) et γ2 (Cy5) à des niveaux élevés. (α1 B) lignée cellulaire HEK293 exprimant (Alexa Fluor 488), β2 (Alexa Fluor 555) et γ2 (Cy5)sous-unités à des niveaux élevés. Barre d'échelle:. 10 um Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 2. GABAergiques neurones épineux moyens forment des contacts avec α1 / β2 / γ2- synapse comme exprimant les cellules HEK293 en co-culture. (A) de marquage fluorescent des terminaisons présynaptiques avec des anticorps anti-GAD65 (en vert) et les cellules HEK293 avec mCherry (en rouge, à gauche) ou le GABA A R γ2 sous-unité (en bleu, à droite), les points de co-localisation entre ces révélé marqueurs indiquant la formation de contacts synaptiques comme après 4 ou 24 h en co-culture. Barre d'échelle:. 10 pm (B) L'analyse quantitative de la synapse comme co ntacts. Cellules HEK293 ont été identifiés en fonction de leur forme comme révélé par DIC imagerie et / ou l'expression mCherry, et le nombre de contacts entre GAD-65 puncta positif (en vert) et la surface des cellules HEK293 a été compté par l'œil dans chaque section optique d'un série Z-stack (8 - 10) par cellule en utilisant le logiciel d'imagerie, et exprimée en nombre de contacts / cellule. Le graphique indique le nombre de contacts entre les neurones moyennes épineux et le contrôle des cellules HEK293 (gris clair) ou / β2 cellules / γ2-HEK293 α1 (noir) après 4 et 24 h en co-culture (moyenne ± SEM, n = 8 dans chaque état de deux expériences indépendantes). Ce chiffre a été modifié depuis Fuchs et al. (2013) 30. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 3. GABA A Rs favorisent la formation de contacts synaptiques actifs. Immunomarquage de contacts synaptiques comme formées après 24 heures de co-culture entre neurones terminaux épineux moyens positifs pour GAD65 (Alexa Fluor 405 cyan) et (a) contrôle les cellules HEK293, ou (B) HEK293-α1 / β2 / γ2, les deux cellules transfectées de manière transitoire avec mCherry construire (rouge). Contacts actifs sont identifiés par la co-localisation entre le domaine spécifique vésicule luminale anticorps anti-synaptotagmine (Cy5) et anticorps spécifique de GAD65 fois dans les terminaux présynaptiques, et mCherry exprimés dans des cellules HEK293. Barre d'échelle:. 10 um Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 4. GABAergiques neurones épineux moyens forment des contacts synaptiques comme avec α1 / β3 / sous-unité γ2- exprimant cellules HEK293 en co-culture. (A) Le marquage fluorescent des terminaisons présynaptiques avec anti-synapsine I anticorps (en vert), et de contrôle des cellules HEK293 (à gauche), ou α1 / β3 / γ2 cellules exprimant HEK293, à la fois transfectées de façon transitoire avec mCherry (en rouge), points de révélé co-localisation entre ces marqueurs indiquant la formation de contacts synaptiques semblable après 24 h en co-culture. Barre d'échelle: 10 pm (B). L'analyse quantitative des contacts synaptiques-like. Les cellules HEK293 ont été identifiés par l'expression mCherry, et le nombre de contacts entre synapsine I-positif puncta (en vert) et la surface de cellules HEK293 a été compté par l'oeil dans chaque section optique une série de Z-pile (8 - 10) par cellule en utilisant un logiciel d'imagerie, et exprimés en nombre de contacts / cellule. Le graphique indique le nombre de contacts entre les neurones épineux moyens et le contrôle des cellules HEK293 (gris clair) et / ou β3 cellules / γ2-HEK293 α1 (noir) après 24 h en co-culture (moyenne ± SEM, n = 8-12 cellules chaque état, de deux expériences indépendantes). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Bien que ce protocole ne soit pas techniquement difficile à réaliser, il ya plusieurs étapes critiques qui doivent être suivies pour obtenir des analyses de co-culture les plus précis et reproductibles. Tout d'abord, les neurones épineux moyens de culture doivent être ensemencées à une densité optimale. Si ensemencées trop peu, les neurones ont tendance à se développer très lentement et la survie est considérablement réduit. D'autre part, si ensemencée trop dense, les neurones ont tendance à se regrouper ce qui compromet l'analyse des contacts avec des cellules HEK293. En second lieu, il est recommandé d'exprimer de manière transitoire un rapporteur fluorescent, la GFP ou mCherry dans des cellules HEK293 exprimant de manière stable GABA A R, avant de les platting dans la co-culture. Cela permet la reconnaissance fiable des cellules HEK293, qui peut être compromise par similitude de forme et de taille entre ces cellules et rare survivant cellule gliale dans des cultures de neurones. Pour réaliser la transfection efficace de la GFP ou mCherry ADNc, des lignées cellulaires HEK293 doivent être en phase exponentielle de croissance etensemencées à la densité appropriée dans des plaques à 6 puits. Ensemencement Sparse suivie par transfection entraîne la croissance de cellules mal, tandis que le sursemis empêche les cellules de prendre l'ADNc. Idéalement, les cellules doivent être ensemencées de sorte qu'ils sont entre 70 à 90% de confluence le jour de la transfection. En troisième lieu, la transfection doit être optimisée pour chaque lignée cellulaire utilisée, comme certaines lignées de cellules sont plus sensibles que d'autres. En effet, le GABA Une expression constitutive de R dans les cellules HEK293 réduit la survie des cellules et la capacité des cellules à se redresser après la transfection. En outre, la survie dépend du type de GABA A Rs exprimés dans des cellules HEK293, avec certaines lignées de cellules étant significativement plus sensible que les autres. La transfection en utilisant un réactif de liposome est une méthode optimale pour l'expression de protéines étrangères dans des lignées cellulaires à croissance rapide, assurant à la fois l'efficacité de transfection élevée et le niveau d'expression. Cependant, ce réactif provoque trop de dégâts à des lignées de cellules à croissance lente, pourque nous utilisons régulièrement un réactif de transfection non liposomale. Cela fonctionne d'une manière semblable au réactif liposomique mais la quantité d'ADN requise pour une transfection efficace est réduite de manière significative. Cela permet une meilleure survie des cellules (environ 80 - 90% contre 60% à l'aide de réactifs liposomale), mais avec une efficacité de transfection plus faible (60%). Enfin, le nombre de cellules HEK293 de commande ou α1 / β2 / γ2 HEK293 exprimant cellules ajoutées à des cultures de neurones a besoin d'être optimisé. Ajout de trop peu de cellules compromet le succès de l'analyse des contacts entre les cellules et les neurones HEK293, car ils deviennent très rares. Inversement, l'ajout d'un trop grand nombre de cellules HEK293 provoque la mort des cellules neuronales dans les quelques heures.

Des cultures de neurones épineux moyen embryonnaires devraient idéalement être préparés à partir de tissus prélevés sur des striatum embryonnaire âge de 15 ans - 17. Cependant, il arrive souvent que les embryons sont légèrement plus jeunes ou plus vieux que l'âge optimal. Dans ce cas, le nombre de neurones dans la culture ensemencée serabesoin d'être modifiée. Tissu qui est plus jeune que E15 peut avoir besoin d'être ensemencées à une densité légèrement plus faible, tandis que le tissu qui est plus âgé que E17 peut avoir besoin d'être ensemencées à une densité plus élevée, pour permettre la survie cellulaire optimale. En outre, la cytosine arabinoside (Ara-C) peut avoir besoin d'être ajouté à des cultures plus anciennes pour éviter la croissance de cellules gliales, qui est plus abondant dans les tissus âgés.

Lors de la création des co-cultures, il est important d'optimiser le nombre de plaque de HEK293 transfectées ou / β2 / γ2 cellules HEK293 exprimant de α1, comme mentionné ci-dessus. Cependant, il peut être nécessaire de déterminer pour chaque ligne de cette cellule individuelle, en raison de leurs différences de survie. Typiquement, 30 000 cellules dans un volume maximum de 50 ul doivent être ajoutés à chaque puits d'une plaque à 24 puits, qui contient déjà 500 ul de milieu de culture des neurones, car cela assure que le milieu neuronal conditionné ne soit pas trop dilué et que les conditions au sein de chaque bien rester assez constant, par exemple, La concentration de facteurs de croissance. Ajout de volumes de plus de 50 ul à chaque puits serait généralement tuer les neurones.

L'un des principaux inconvénients de la technique de co-culture est que les cultures de neurones sont créés à partir de cellules dissociées cultivés en monocouche, ce qui signifie que les neurones ont été enlevés de leur micro-environnement normal et sont incapables d'établir leur organisation anatomique normale. Par conséquent, ils ne possèdent pas les connexions appropriées, les entrées et les molécules sécrétées par d'autres cellules qui peuvent influer sur les premiers stades de développement des synapses. Par exemple, in vivo des neurones épineux moyens sont très innervée par des entrées glutamatergiques du cortex, le thalamus et d'autres régions du cerveau 34, cependant, dans nos cultures de neurones glutamatergiques synapses ne forment pas parce que ces entrées sont endommagés lors de la dissection du tissu striatal. Comment l'absence de synapses glutamatergiques fonctionnels dans les neurones épineux moyens culture affECTS leur capacité à former des synapses GABAergiques uns avec les autres et / ou les cellules HEK293 exprimant GABA A R reste une question ouverte. Cette question pourrait être facilement traitée par la culture de neurones épineux moyens avec les neurones glutamatergiques corticaux leur permettant ainsi de former des synapses fonctionnelles 35 avant l'addition des cellules HEK293. Une autre approche serait de concevoir un système de modèle de co-culture basée sur des cultures organotypique, qui maintiennent une partie de la cytoarchitecture qui peut être important pour la maturation et la formation des synapses. Cependant, les cultures organotypique ont neuropile dense et hétérogène qui peut compromettre l'analyse effectuée ici. Un autre inconvénient important de l'utilisation des tests de co-culture est que le GABA A Rs exprimé à la surface des cellules HEK293 sont pas regroupés comme ils sont dans les neurones, bien que cela ne semble pas être nécessaire pour la formation des synapses donné une assez forte expression de surface 30. Par exemple, dans le rOdent cerveau et dans les cultures de l'hippocampe, l'α1 GABA A R sous-unité se trouve dans la plupart des synapses GABAergiques sur tous les domaines post-synaptiques des cellules pyramidales. Cependant, l'α2 est spécifiquement situé dans un sous-ensemble de synapses sur le soma et des dendrites, mais est fortement enrichie dans le segment initial axone, comme l'a révélé par immunofluorescence et microscopie électronique 36. Étant donné que la formation des synapses dans les co-cultures peut toujours être détectée de manière fiable et analysé 30, ce qui suggère que la densité de GABA A R à la surface cellulaire de cellules HEK 293 peut être similaire à, ou même supérieure à la densité de ces récepteurs au sein synaptique grappes dans les neurones. Cela peut expliquer, au moins en partie, pourquoi les protéines synaptiques d'adhérence, comme neuroligin, et des protéines de la densité post-synaptique, comme géphyrine, ne sont pas nécessaires pour la formation des synapses dans les co-cultures, si les assemblées de manière appropriée Rs GABA A sont présents à suffisamment densité.

Il est bien documenté que le GABA A R sont structurellement et fonctionnellement hétérogène, et que la composition de sous-unité du récepteur détermine leur localisation sous-cellulaire et des propriétés pharmacologiques. Par exemple, l'incorporation des deux sous-unités est connu pour être une condition préalable à la localisation synaptique du GABA A Rs tandis que la sous-unité est presque exclusivement présente dans extrasynaptiques Rs GABA A. Les récepteurs qui intègrent seulement αβ combinaisons sont également pensés pour être principalement localisée aux domaines extrasynaptiques 12- 14. Que cette spécificité est maintenue dans le système de co-culture peut être facilement testée par transfection transitoire ou deux sous-unités d'ADNc dans des lignées de cellules HEK293 exprimant de manière stable les sous-unités α et β, avant leur addition à des cultures de neurones. Nos expériences préliminaires utilisant cette approche ont suggéré que des contacts synaptiques sont facilement formés seulement en présence de la sous-unité 2, ce qui indique que la spécificitéficité observé in vivo est susceptible d'être conservé in vitro (données non présentées).

En outre, Rs GABA A incorporant différentes sous-unités α sont localisées de façon sélective à des contacts synaptiques formés avec des types spécifiques de neurones présynaptiques. Par exemple, dans le globus pallidus, les Rs α1-GABA A sont généralement trouvés à striatopallidaux (str-GP) et palliopallidal (GP-GP) synapses, qui sont situés sur les dendrites et les régions somatiques des neurones épineux moyens, respectivement. Les Rs α3-GABA A sont situés dans des régions périsomatique de neurones épineux moyens et sont contactés par des collatéraux GP axonales locales, tandis que les Rs α2-GABA A sont situés sur les dendrites distales de ces neurones et contacté principalement par les contributions de la striatum 32. Expression de sous-unités α spécifiques des différents types de synapses et de neurones dans différents compartiments a également été démontrée dans d'autres zones du cerveau telles que Hippocampus 21 et le néocortex 18,20. Ces résultats soulèvent la question de savoir comment les synapses inhibitrices spécifiques sont formées dans le cerveau. Est-ce que l'adhésion d'un type spécifique de terminaison présynaptique induit l'insertion de sous-types spécifiques GABA A R dans les points de contact? Est-ce que les récepteurs d'un trafic à des emplacements subcellulaires spécifiques en fonction de leur composition de sous-unité, où l'insertion de la membrane plasmique est une condition préalable à l'adhésion des terminaisons axonales d'origine spécifique? À ce jour, ces questions restent sans réponse. L'utilisation de systèmes modèles réduits, tels que le système de modèle de co-culture, nous permet de commencer à répondre à ces interrogations complexes parce que le système est facilement prêter à la transfection de constructions d'ADN et de l'application des réactifs et, surtout, il est adapté pour le live analyse de l'imagerie cellulaire 30. Ainsi, en utilisant ce système modèle, nous pouvons commencer à tester le rôle de molécules individuelles, y compris les différents types de GABA A R, savoirn d'être présent à des contacts synaptiques. Un autre avantage est que les synapses dans ce modèle sous forme de système rapidement, en quelques minutes à quelques heures, la réduction de la durée d'expériences. Systèmes de modèle de co-culture similaires ont été utilisés avec succès dans le passé à l'écran pour les nouvelles molécules synaptogenic 27,37,38.

Comprendre comment le système nerveux central se développe, mûrit et forme les connexions entre les neurones de manière si complexe à contrôler, par exemple, le comportement ou la cognition, est d'une importance fondamentale. Cet objectif lointain ne sera atteint que par la délimitation des mécanismes moléculaires qui régissent les différentes étapes de la reconnaissance et de la communication cellule à cellule au cours du développement. En raison de la complexité pure, les détails moléculaires de ces interactions cellulaires multiples peuvent actuellement être étudiés avec précision que dans les systèmes réduits. Toutefois, la capacité d'augmenter la complexité de ces systèmes par l'expression de multiples combinaisons de protéines et d'étudier commentils interagir présente certains avantages en comparaison avec, par exemple, les méthodes de suppression génétiques. En effet, l'interprétation exacte des effets de la suppression d'un gène unique est souvent compromise par des changements associés à des mécanismes de compensation des effets de masquage des lésions d'origine, en particulier dans le cerveau en développement. La technique simple de co-culture mais informatif décrit ici a permis la découverte du rôle de structure de GABA A R dans la formation des synapses et ouvert la possibilité d'étudier la façon dont Rs GABA A et d'autres molécules d'adhérence cellulaire et / ou des protéines de la matrice synaptiques interagissent les uns avec les autres au cours de la synaptogenèse. Protéines de la matrice synaptique sont un intérêt particulier étant donné qu'ils ont été récemment démontré à jouer un rôle clé dans la formation des synapses glutamatergiques 39. Le développement de modèles de co-culture est importante, car ils ont le potentiel de faire progresser notre connaissance des mécanismes moléculaires qui régissent la «normale &# 8217; le développement du cerveau et ainsi augmenter notre compréhension de la façon dont ces mécanismes sont modifiés dans de nombreuses maladies neurologiques du développement, tels que l'épilepsie, la schizophrénie, les troubles du spectre autistique et bien d'autres.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Nous tenons à souligner le soutien financier de la MRC du Royaume-Uni (G0800498). Nous tenons également à remercier le Professeur JM Fritschy, Université de Zurich, pour fournir l'anticorps GABA A -R spécifique sous-unité γ2 et professeur R. Harvey, UCL Faculté de Pharmacie, pour fournir le pcDNA 3.1 (+) des vecteurs d'expression contenant la résistance aux antibiotiques des gènes pour la production de lignées de cellules HEK293 transfectées de manière stable.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)Life Technologies11960-044Chaud dans un bain d’eau à 37 ° ; C avant utilisation
L-GlutamineLife Technologies25030-024
Pénicilline/StreptomycineLife Technologies15070-063Danger : irritant
FBS (Fetal Bovin Serum)Life Technologies10106-169
NeuralbasalLife Technologies21103-049Chaud au bain-marie à 37 ° ; C avant utilisation
B27 SupplémentLife Technologies17504-044
GlucoseSigma-AldrichG8769
HBSS (10X)Life Technologies14180-046
HEPES (1M)Life Technologies15630-056
PBS (1X)Life Technologies10010-031
pcDNA 3.1(+) Vecteur d’expression de mammifère (sélection de la génétique)Life TechnologiesV790-20
pcDNA 3.1(+) Vecteur d’expression de mammifère (sélection de zéocine)Life TechnologiesV860-20
pcDNA 3.1(+) Vecteur d’expression de mammifère (sélection d’hygromycine)Life TechnologiesV870-20
HEK&alpha stable ; 1&bêta ; 2&gamma ; 2 lignesSanofi-Synthelabo, Paris
Poly-D-lysineSigma-AldrichP1149
G418 disulfate salt (Geneticin)Sigma-AldrichG5013Danger : irritant
Phleomycine D1 (Zeocin)Life TechnologiesR25001
Hygromycin BLife Technologies10687-010Danger : toxique, irritant et corrosif
Trypsine-EDTALife Technologies25300-054Chaud dans le bain d’eau à 37 ° ; C avant utilisation. Danger : irritant.
Poly-L-lysineSigma-AldrichP6282
LaminineSigma-AldrichL2020
100 &mu ; m Passoire cellulaire en nylonVWR734-0004
Cytosine &beta ;-D-arabinofuranoside (Ara-C)Sigma-AldrichC1768Danger :
Irritant Agent chélateur (Versene)Life Technologies15040-033
Réactif de transfection liposomale (Lipofectamine LTX) avec réactif tampon de transfection liposomale (réactif PLUS).Life Technologies15338-100Méthode de transfection alternative : Réactif Effectene
Réactif de transfection non liposomale (Réactif Effectene)Qiagen301425
Milieu sérique réduit (Opti-MEM)Life Technologies11058-021
Anticorps anti-Synaptotagmin de souris conjugué à Cy5Synaptic Systems105311C5
Neurobasal ALife Technologies10888-022
Chlorure de sodium (NaCl)VWR27810.364
GlycineSigma-AldrichG1726
BSA (albumine sérique bovine)Sigma-AldrichA3294
Cobaye anti-&gamma ; 2 Anticorps anti-récepteur GABAAProf. Jean Marc FritschyN/A(Institut de Zurich, Suisse) Fritschy, JM et Mohler, H. J. Comp. Neurol. 359 (1), 154-194 (1995).
Triton X-100PromegaH5141
Anticorps anti-glutamate décarboxylase (GAD)65 de sourisMerck MilliporeMAB351
Anticorps anti-synapsine de sourisSynaptic Systems106-011
Anti-&beta ; Anticorps 2/3 (BD17)Merck MilliporeMAB341
Lapin anti-&alpha ; 1 Anticorps récepteur GABAAProfesseur Anne StephensonN/A(UCL School of Pharmacy, Londres) FA Stephenson et al. J. Comp. Neurol. 416 (2), 158-172
Chèvre anti-cobaye conjuguée à l’anticorps Cy5Merck MilliporeAP1085
Anticorps anti-souris Alexa Fluor 488Merck MilliporeAP124S
Anticorps anti-souris Alexa Fluor 405 Alexa Fluor 405Life TechnologiesA31553
Anticorps anti-souris Alexa Fluor 555 Anticorpsanti-lapin Alexa
Fluor 488 Alexa Fluor 488TechnologiesA11008
Réactif de montage (Prolong Gold)Life TechnologiesP36930Utilisation à température ambiante
Life

Références

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