Haute résolution microscopie électronique de la Helicobacter pylori Cag sécrétion de type IV Système Pili Produit dans différentes conditions de Fer Disponibilité

Résumé

Nous décrivons ici une méthode pour visualiser l’organite bactérien oncogénique connu sous le nom de système de sécrétion Cag de type IV (Cag-T4SS). Nous constatons que le Cag-T4SS est produit de manière différentielle à la surface de H. pylori en réponse à des conditions variables de disponibilité du fer.

Résumé

Helicobacter pylori est une bactérie de forme hélicoïdale à Gram négatif qui colonise la niche gastrique humaine de la moitié de la population humaine^1,2. H. pylori est la principale cause de cancer gastrique, la deuxième cause de décès liés au cancer dans le monde³. L’un des facteurs de virulence qui a été associé à un risque accru de maladie gastrique est l’îlot de pathogénicité Cag, une région de 40 kb dans le chromosome de H. pylori qui code pour un système de sécrétion de type IV et la molécule effectrice apparentée, CagA^4,5. Le Cag-T4SS est responsable de la translocation du CagA et du peptidoglycane dans les cellules épithéliales de l’hôte^5,6. L’activité du Cag-T4SS entraîne de nombreux changements dans la biologie de la cellule hôte, notamment la régulation à la hausse de l’expression des cytokines, l’activation des voies pro-inflammatoires, le remodelage du cytosquelette et l’induction de réseaux de signalisation cellulaire oncogénique^5-8. Le Cag-T4SS est une machine macromoléculaire composée de composants de sous-assemblage couvrant la membrane interne et externe et s’étendant de la cellule à l’espace extracellulaire. La partie extracellulaire du Cag-T4SS est appelée « pilus »⁵. De nombreuses études ont démontré que les pili Cag-T4SS se forment à l’interface hôte-pathogène^9,10. Cependant, les caractéristiques environnementales qui régulent la biogenèse de cet organite important restent largement obscures. Récemment, nous avons rapporté que les conditions de faible disponibilité du fer augmentaient l’activité de Cag-T4SS et la biogenèse du pilu. Nous présentons ici un protocole optimisé pour cultiver H. pylori dans des conditions variables de disponibilité du fer avant la co-culture avec des cellules épithéliales gastriques humaines. De plus, nous présentons le protocole complet pour la visualisation du phénotype hyper-pilié présenté dans des conditions de restriction en fer par des analyses de microscopie électronique à balayage à haute résolution.

Introduction

l’infection à H. pylori est un facteur de risque important de cancer gastrique¹. Cependant, l’issue de la maladie varie et dépend de nombreux facteurs tels que la génétique de l’hôte, la diversité génétique des souches de H. pylori et des éléments environnementaux tels que le régime alimentaire de l’hôte¹¹. Des rapports antérieurs ont établi qu’il existe une corrélation entre l’infection à H. pylori, la carence en fer (mesurée par la diminution des concentrations de ferritine et d’hémoglobine dans le sang) et l’augmentation de la production de cytokines pro-inflammatoires, y compris la sécrétion d’IL-8, ce qui conduit finalement à une progression accrue de la maladie gastrique¹². L’infection aiguë à H. pylori est également associée à l’hypochlorhydrie qui altère la capacité de l’hôte à absorber le fer nutritif et finit par entraîner des modifications de l’homéostasie du fer¹³. Ces résultats cliniques suggèrent que la disponibilité du fer dans la niche gastique pourrait être un facteur important dans l’issue de la maladie. En fait, des modèles animaux d’infection à H. pylori ont démontré qu’une faible consommation alimentaire de fer exacerbe les maladies gastriques¹⁴. Les niveaux réduits de fer chez ces animaux nécessitent que H. pylori induise une réponse d’acquisition de fer afin d’obtenir le fer nécessaire à la réplication bactérienne. H. pylori a la capacité de perturber le trafic du fer dans les cellules hôtes pour faciliter la réplication bactérienne de manière dépendante de CagA¹⁵. Il est intéressant de noter qu’il a été démontré que l’îlot de pathogénicité cag est régulé par le facteur de transcription sensible au fer Fur^16,17. De plus, les souches Cag+ sont associées à une inflammation accrue et à des maladies gastriques telles que le cancer¹. Ces résultats soutiennent un modèle selon lequel H. pylori modifie l’expression de Cag-T4SS dans le but d’obtenir du fer à partir de cellules hôtes qui résident dans un environnement appauvri en fer, ce qui entraîne des résultats exacerbés de la maladie.

Deux facteurs qui augmentent l’inflammation et la morbidité sont l’expression de Cag et un faible apport alimentaire en fer. Ces faits soutiennent l’hypothèse selon laquelle une disponibilité réduite en fer augmente la production de pili Cag-T4SS à l’interface hôte-pathogène, ce qui aggrave la maladie gastrique^11-14. L’objectif de la méthode fournie dans ce manuscrit est d’établir le rôle du micronutriment fer dans la régulation de la biogenèse du pilus Cag-T4SS. Dans des travaux précédents, nous avons utilisé deux approches pour observer une augmentation dépendante du fer de l’expression de Cag-T4SS. Tout d’abord, les souches de sortie d’animaux maintenus avec des régimes riches et pauvres en fer ont été analysées et ont révélé que les souches de sortie de régime pauvre en fer produisaient plus de pili Cag-T4SS que les souches de régime riche en fer¹⁴. Deuxièmement, la culture in vitro de la souche H. pylori 7.13 dans des conditions de remplissage en fer a entraîné une réduction de la formation de pili, tandis que les cellules cultivées en présence d’un chélateur de fer ont produit beaucoup plus de pili.

Nous avons continué à étudier la régulation dépendante du fer du phénotype de Cag-T4SS pili et proposons le protocole optimisé suivant et des résultats représentatifs réalisés avec une souche supplémentaire d’Helicobacter pylori, PMSS1. La raison d’être du développement de cette technique était de corréler l’augmentation de l’activité de Cag-T4SS dans des conditions de limitation du fer avec l’augmentation de la formation de piux de Cag-T4SS. L’implication et l’utilisation plus larges de cette technique fourniront des conditions de culture optimisées qui se traduiront par une production élevée de pili Cag-T4SS. Ce test sera utile aux chercheurs qui cherchent à déterminer la composition et l’architecture du Cag-T4SS en enrichissant pour cette importante caractéristique de surface bactérienne. La préparation et la visualisation d’échantillons par microscopie électronique à canon à émission de champ présentent de nombreux avantages par rapport aux techniques alternatives telles que les méthodes de microscopie optique pour visualiser le Cag-T4SS et conviendront aux chercheurs intéressés par l’étude de la régulation de cet organite¹⁰.

Protocole

1. H. pylori croissance dans différentes conditions de Fer Disponibilité et co-culture avec des cellules humaines épithéliales gastriques

1. Sélectionnez H. pylori souche PMSS1 pour ces études car il a une île de pathogénicité cag intact et exprime un système IV de sécrétion de type fonctionnement. Utiliser également un mutant de la cage isogéniques (PMSSI Δ cage) comme contrôle négatif. Cultiver les bactéries sur des plaques de TSA complétées avec du sang de mouton à 5% (plaques de gélose au sang) pendant 24 heures à 37 ° C en présence de 5% de CO _2.
   NOTE: Préparer les réactifs et assembler des matériaux comme indiqué dans le matériel et équipement tableau. Les concentrations finales pour chaque réactif est indiquée entre parenthèses.
2. Grattez les bactéries de la plaque à l'aide d'un coton-tige stérile et inoculer dans un bouillon Brucella modifié préparé à partir de composants (voir Matériels et ustensiles de table) et complété avec le cholestérol. Incuber les cultures pendant la nuit à 37° C dans l'air ambiant supplémenté avec 5% _de CO2 avec agitation à 200 tours par minute (rpm).
   NOTE: Le cholestérol est utilisé à la place de sérum de veau fœtal en raison du fait que le sérum est complexe; contenant de nombreuses sources de nutriments tels que le fer hémique qui provoque la variabilité des résultats.
3. Le jour de la culture bactérienne, ensemencer les cellules épithéliales gastriques AGS humaines (ATCC CRL-1739) sur le poly-D-lysine lamelles traitées dans des plaques de 12 puits (environ 1 x 10 ⁵ cellules par puits).
4. Le jour suivant, les cultures bactériennes diluées à une DO600 de 0,3 dans un bouillon Brucella modifié, seul ou additionné de 100 uM de _FeCl3, 200 uM de dipyridyle (un chélateur de fer synthétique) ou 200 pM de dipyridyle plus 250 uM de _FeCl3. Incuber les cultures pendant 4 heures à 37 ° C dans l'air ambiant supplémenté avec 5% _de CO2 avec agitation à 200 tours par minute.
5. Bactéries centrifuger à 1000 xg pour recueillir des cellules et supprimer surnageants avant la remise en suspension in un volume égal de bouillon Brucella modifié frais supplémenté avec du cholestérol. La mesure de la DO600 de la culture (DO 600 = 1,0 = 5,5 x 10 ⁸ cellules / ml) et ajouter des bactéries aux cellules epitheliales en une multiplicité d'infection (MOI) de 20: 1. Réaliser des dilutions en série et des cellules bactériennes en plaque sur des plaques de gélose au sang pour évaluer la viabilité de la cellule bactérienne.
6. Incuber H. cellules épithéliales gastriques humaines pylori et AGS co-cultures de 4 heures à 37 ° C en présence de 5% CO ₂ dans des conditions statiques avant de procéder à la microscopie électronique à balayage (MEB) la préparation d'échantillons.

2. SEM de la préparation d'échantillons pour visualiser les H. pylori Cag-T4SS Pili

1. Retirer H. pylori et les co-cultures AGS à partir du surnageant incubateur et décanter la culture (sauf pour l'IL-8 ELISA). Laver doucement trois fois avec 0,05 M de tampon cacodylate de sodium (pH 7,4). Fixer les échantillons pendant 2-4 heures à la température ambiante dans une solution de 2,0% de paraformaldéhyde, 2,5% De glutaraldéhyde, et un tampon de cacodylate de sodium 0,05 M. Après fixation primaire, laver échantillons trois fois avec le tampon de cacodylate de sodium 0,05 M.
2. Effectuer fixation secondaire en utilisant du tétroxyde d'osmium à 0,1% dans du tampon cacodylate de sodium 0,05 M en deux étapes séquentielles 10 min de fixation. Après fixation secondaire, laver échantillons trois fois avec le tampon de cacodylate de sodium 0,05 M.
3. Après la fixation primaire et secondaire, déshydrater échantillons par lavage séquentiel avec des concentrations croissantes d'éthanol, selon le tableau 1.
4. Après déshydratation de l'éthanol, effectuer trois lavages successifs de dioxyde de carbone liquide. Puis échantillons secs à un point critique en utilisant un sèche-linge de point critique à une température de 31,1 ° C et une pression de 1073 psi.
5. Mont lamelles de talons sur des échantillons d'aluminium SEM et de la peinture avec une fine ligne de l'argent colloïdal au bord de l'échantillon pour atteindre la terre appropriée et éviter de charger lors de l'imagerie SEM.
6. échantillons de manteau avec 5 nm deor-palladium en utilisant une machine de revêtement par pulvérisation pour augmenter le signal d'électrons secondaires échantillon et l'effet de bord.

3. Paramètres d'imagerie pour analyses résolution SEM haut

1. Voir les échantillons avec un microscope électronique à balayage Gun à émission de champ (FEG-SEM).
2. L'image dans un mode à vide élevé à une distance de travail de 5 à 10 mm.
3. Réglez la tension d'accélération de 5 kV.
4. Régler la taille de place à 2-2,5.
5. Inclinez l'échantillon entre 15-25 degrés pour obtenir une meilleure vue de l'interface hôte-pathogène.
6. Donner la priorité à l'imagerie de bactéries adhérentes aux bords des cellules épithéliales à fort grossissement pour la visualisation, en tant que ces zones d'interaction hôte-pathogène sont enrichies en bactéries formant des pili.

4. Analyses statistiques pour évaluer Pili Quantifications

1. Analyser H. pylori pili Cag-T4SS utilisant le logiciel ImageJ pour quantifier le nombre de pili / cellule ainsi que pour cent des cellules présentant l'pili phephénotype selon les instructions ci-dessous.
2. Fichiers micrographiques ouvrir dans le logiciel ImageJ. Identifier en tant que pili de structures formées entre la cellule bactérienne et une cellule hôte, avec une largeur uniforme (10-13 nm) et la longueur (60-150 nm).
   REMARQUE: La structure de pilus est présent sur ​​les souches bactériennes WT, mais absent sur ​​des souches isogéniques tels que Δ cage souches mutantes, qui abritent une inactivation dans le gène codant pour la majeure ATPase que l'assemblage de type IV pouvoirs sécrétion de pilus.
3. Calibrer l'outil de mesure en traçant une ligne avec l'outil de ligne droite, puis en cliquant sur l'onglet "Analyser". Sélectionnez "Scale Set" dans le menu déroulant et entrez la valeur de la barre de grossissement dans la case "Distance connu" et régler l'unité de longueur sur le paramètre approprié (nm). Cliquez sur "OK".
4. Mesurer Cag-T4SS pili en utilisant l'outil de ligne droite à tirer sur la longueur ou la largeur du pili, puis appuyez sur "Ctrl-M" pour mesurer chaque pili. Observez une boîte de dialogue avec les valeurs mesurées. Notez ces valeurs ou copier et coller dans un tableur.
5. Utilisez la longueur et la largeur des paramètres précédemment établis ^24, caractéristiques de ne pas tenir compte qui ne correspondent pas au profil de Cag-T4SS. Puis quantifier le nombre de pili fondée sur des valeurs qui sont à l'intérieur des seuils 10-13 nm de largeur et 60-150 nm de longueur.
6. Analyser la quantification de pili statistiquement par le test t de Student bilatéral utilisant le logiciel GraphPad Prism.

5. Facultatif: évaluation de la sécrétion d'IL-8 en corrélation avec Pilus production

1. Utilisation de surnageants de l'étape 2.1, effectuer un IL-8 ELISA selon les instructions du fabricant avec le kit (voir Matériels et ustensiles de table).
2. Analyse de l'IL-8 sécrétée par les cellules hôtes et le calcul de la IL-8 pour cent par rapport à induction WT PMSS1 cultivées dans du milieu seul. Effectuer une analyse statistique utilisant bilatéral test t de Student en utilisant GraphPad Prism siftware.

Résultats

Dans ce rapport, nous avons démontré que les conditions de disponibilité est variable de fer ont la capacité de moduler H. pylori Cag-T4SS pili biogenèse à l'interface hôte-pathogène. Lorsqu'elle est cultivée dans le milieu seul, H. pylori constitue un moyen de pili 3 / cellule. Lorsque H. pylori est cultivé en fer épuiser conditions (à l'aide du chélateur dipyridyle synthétique) qui sont sous-inhibitrice pour la croissance des bactéries (Figure 1), les bactéries produisent de...

Discussion

Le fer est un oligo-élément essentiel pour la plupart des formes de vie, y compris les bactéries pathogènes. Dans un effort pour limiter la viabilité des micro-organismes envahisseurs, les hôtes vertébrés séquestrent fer éléments nutritifs dans un processus connu sous le nom "immunité nutritionnelle» ^18. En réponse à cela, les bactéries pathogènes ont évolué à utiliser le fer comme une molécule de signalisation mondiale de sentir leur environnement et de réglementer l'élaboration de caractéristiques ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
			brucella modifié
Peptone à partir de caséine (10 g/L)	Sigma	70172
Digestion peptique de tissus animaux (10 g/L)	Sigma	70174
Extrait de levure (2 g/L)	Sigma	92144
Dextrose (1 g/L)	Sigma	D9434
Chlorure de sodium (5 g/L)	Thermo Fisher	S271-10
Cholestérol (250X) (4 ml/L)	Life Technologies	12531018
Chlorure ferrique (100 ou 250 uM)	Sigma	157740-100G
Dipyridyl (200 uM)	Sigma	D216305-100G
RPMI
RPMI+HEPES (1X)	Life Technologies	22400-121
Sérum fœtal bovin ( 100 ml/L)	Life Technologies	10438-026
Préparation pour la microscopie électronique
Paraformaldéhyde (2,0 % aqueux)	Microscopie électronique Sciences	15713
Glutéraldéhyde (2,5 % aqueux)	Microscopie électronique Sciences	16220
Cacodylate de sodium (0,05 M)	Microscopie électronique Sciences	12300
Tétroxyde d’osmium (0,1 % aqueux)	Microscopie électronique Sciences	19150
Éthanol (absolu)	Sigma	E7023
Peinture argentée colloïdale	Microscopie électronique Sciences	12630
Souches d’échantillons MEB	Microscopie électronique Sciences	75220
Lamelles	Thermo Fisher	08-774-383
IL-8 Évaluation des
Quantikine IL-8 ELISA kit	R& D Systems	D8000C