Haute résolution microscopie électronique de la Helicobacter pylori Cag sécrétion de type IV Système Pili Produit dans différentes conditions de Fer Disponibilité

Résumé

Nous décrivons ici une méthode pour visualiser l’organite bactérien oncogénique connu sous le nom de système de sécrétion Cag de type IV (Cag-T4SS). Nous constatons que le Cag-T4SS est produit de manière différentielle à la surface de H. pylori en réponse à des conditions variables de disponibilité du fer.

Résumé

Helicobacter pylori est une bactérie de forme hélicoïdale à Gram négatif qui colonise la niche gastrique humaine de la moitié de la population humaine^1,2. H. pylori est la principale cause de cancer gastrique, la deuxième cause de décès liés au cancer dans le monde³. L’un des facteurs de virulence qui a été associé à un risque accru de maladie gastrique est l’îlot de pathogénicité Cag, une région de 40 kb dans le chromosome de H. pylori qui code pour un système de sécrétion de type IV et la molécule effectrice apparentée, CagA^4,5. Le Cag-T4SS est responsable de la translocation du CagA et du peptidoglycane dans les cellules épithéliales de l’hôte^5,6. L’activité du Cag-T4SS entraîne de nombreux changements dans la biologie de la cellule hôte, notamment la régulation à la hausse de l’expression des cytokines, l’activation des voies pro-inflammatoires, le remodelage du cytosquelette et l’induction de réseaux de signalisation cellulaire oncogénique^5-8. Le Cag-T4SS est une machine macromoléculaire composée de composants de sous-assemblage couvrant la membrane interne et externe et s’étendant de la cellule à l’espace extracellulaire. La partie extracellulaire du Cag-T4SS est appelée « pilus »⁵. De nombreuses études ont démontré que les pili Cag-T4SS se forment à l’interface hôte-pathogène^9,10. Cependant, les caractéristiques environnementales qui régulent la biogenèse de cet organite important restent largement obscures. Récemment, nous avons rapporté que les conditions de faible disponibilité du fer augmentaient l’activité de Cag-T4SS et la biogenèse du pilu. Nous présentons ici un protocole optimisé pour cultiver H. pylori dans des conditions variables de disponibilité du fer avant la co-culture avec des cellules épithéliales gastriques humaines. De plus, nous présentons le protocole complet pour la visualisation du phénotype hyper-pilié présenté dans des conditions de restriction en fer par des analyses de microscopie électronique à balayage à haute résolution.

Introduction

l’infection à H. pylori est un facteur de risque important de cancer gastrique¹. Cependant, l’issue de la maladie varie et dépend de nombreux facteurs tels que la génétique de l’hôte, la diversité génétique des souches de H. pylori et des éléments environnementaux tels que le régime alimentaire de l’hôte¹¹. Des rapports antérieurs ont établi qu’il existe une corrélation entre l’infection à H. pylori, la carence en fer (mesurée par la diminution des concentrations de ferritine et d’hémoglobine dans le sang) et l’augmentation de la production de cytokines pro-inflammatoires, y compris la sécrétion d’IL-8, ce qui con....

Protocole

1. H. pylori croissance dans différentes conditions de Fer Disponibilité et co-culture avec des cellules humaines épithéliales gastriques

1. Sélectionnez H. pylori souche PMSS1 pour ces études car il a une île de pathogénicité cag intact et exprime un système IV de sécrétion de type fonctionnement. Utiliser également un mutant de la cage isogéniques (PMSSI Δ cage) comme contrôle négatif. Cultiver les bactéries sur des plaques de TSA complétées avec du sang de mouton à 5% (plaques de gélose au sang) pendant 24 heures à 37 ° C en présence de 5% de CO _2.
   NOTE: Préparer les réactifs et assembler des m....

Résultats

Dans ce rapport, nous avons démontré que les conditions de disponibilité est variable de fer ont la capacité de moduler H. pylori Cag-T4SS pili biogenèse à l'interface hôte-pathogène. Lorsqu'elle est cultivée dans le milieu seul, H. pylori constitue un moyen de pili 3 / cellule. Lorsque H. pylori est cultivé en fer épuiser conditions (à l'aide du chélateur dipyridyle synthétique) qui sont sous-inhibitrice pour la croissance des bactéries (Figure 1), les bactéries produisent de.......

Discussion

Le fer est un oligo-élément essentiel pour la plupart des formes de vie, y compris les bactéries pathogènes. Dans un effort pour limiter la viabilité des micro-organismes envahisseurs, les hôtes vertébrés séquestrent fer éléments nutritifs dans un processus connu sous le nom "immunité nutritionnelle» ^18. En réponse à cela, les bactéries pathogènes ont évolué à utiliser le fer comme une molécule de signalisation mondiale de sentir leur environnement et de réglementer l'élaboration de caractéristiques .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
			brucella modifié
Peptone à partir de caséine (10 g/L)	Sigma	70172
Digestion peptique de tissus animaux (10 g/L)	Sigma	70174
Extrait de levure (2 g/L)	Sigma	92144
Dextrose (1 g/L)	Sigma	D9434
Chlorure de sodium (5 g/L)	Thermo Fisher	S271-10
Cholestérol (250X) (4 ml/L)	Life Technologies	12531018
Chlorure ferrique (100 ou 250 uM)	Sigma	157740-100G
Dipyridyl (200 uM)	Sigma	D216305-100G
RPMI
RPMI+HEPES (1X)	Life Technologies	22400-121
Sérum fœtal bovin ( 100 ml/L)	Life Technologies	10438-026
Préparation pour la microscopie électronique
Paraformaldéhyde (2,0 % aqueux)	Microscopie électronique Sciences	15713
Glutéraldéhyde (2,5 % aqueux)	Microscopie électronique Sciences	16220
Cacodylate de sodium (0,05 M)	Microscopie électronique Sciences	12300
Tétroxyde d’osmium (0,1 % aqueux)	Microscopie électronique Sciences	19150
Éthanol (absolu)	Sigma	E7023
Peinture argentée colloïdale	Microscopie électronique Sciences	12630
Souches d’échantillons MEB	Microscopie électronique Sciences	75220
Lamelles	Thermo Fisher	08-774-383
IL-8 Évaluation des
Quantikine IL-8 ELISA kit	R& D Systems	D8000C