Il peut être difficile de visualiser et d’accéder à l’embryon de poulet pendant le développement. Nous avons développé une méthode ex ovo qui est simple, rentable et qui peut facilement être utilisée dans une salle de classe ou un cadre de recherche. Cette méthode permet d’accéder à l’embryon dans les derniers stades du développement embryonnaire (HH 40).
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Article de méthode
Optimisé Ex-ovo Culture des embryons de poulet aux stades avancés de développement
Dans cet article
Résumé
Résumé
La recherche en anatomie, en embryologie et en biologie du développement s’est largement appuyée sur l’utilisation d’organismes modèles. Afin d’étudier le développement chez les embryons vivants, des organismes modèles, tels que le poulet, sont souvent utilisés. Le poulet est un excellent organisme modèle en raison de son faible coût et de son entretien minimal, mais il présente des défis d’observation car il est enfermé dans une coquille d’œuf opaque. Afin de bien voir l’embryon pendant qu’il se développe, la coquille doit être fenêtrée ou retirée. Des techniques de fenêtrage et d’ex ovo ont été développées pour aider les chercheurs dans l’étude du développement embryonnaire. Cependant, chacune des méthodes présente des limites et des défis. Nous présentons ici une technique simple et optimisée de culture ex ovo d’embryons de poulet qui permet d’observer le développement embryonnaire du stade HH 19 aux stades tardifs de développement (HH 40), lorsque de nombreux organes se sont développés. Cette technique est facile à adopter dans les classes de premier cycle et les laboratoires de recherche plus avancés où des manipulations d’embryons sont effectuées.
Introduction
L’ovoculture ex a joué un rôle important dans l’étude du développement du poulet1, 2. Cette méthode de culture a été utilisée pour étudier les maladies neurologiques, le développement des membres, le développement craniofacial, et comme modèle pour étudier les malformations associées au diabète 3, 4, 5.
Il existe de nombreuses variantes de la technique ex ovo. L’approche la plus courante consiste à utiliser une tasse en polystyrène6,7,8 ou un bol en verre5. Dans ces méthodes, la tasse ou le bol est tapissé d’une pellicule plastique pour bercer l’embryon, un couvercle est placé sur la tasse et l’embryon est ensuite placé dans un incubateur avec une humidité appropriée6. Cependant, cette configuration peut être techniquement difficile. Le premier défi est la pellicule plastique qui est utilisée pour bercer l’embryon. Cette écharpe est difficile à travailler et n’adhère souvent pas très bien à la coupe. Pour résoudre ce problème, un élastique est placé autour du bonnet pour maintenir l’enveloppe en place. Malgré cela, l’enveloppe peut toujours glisser, ce qui est fatal à l’embryon. La pellicule plastique peut se déchirer ou être perforée par des pinces ou des aiguilles qui peuvent être utilisées lors de manipulations et d’observations d’embryons. Enfin, cette configuration n’est pas très stable et les élèves peuvent facilement renverser les gobelets. La hauteur des cupules rend également très difficile de placer l’embryon sous un stéréomicroscope, qui a un objectif limité à la hauteur du stade. Ces défis rendent difficile pour les étudiants de premier cycle de travailler avec des embryons de poussins vivants dans les laboratoires d’enseignement, tels que les cours avancés de biologie du développement.
Les défis ci-dessus dans la méthode ex ovo ont amené les chercheurs à se tourner vers la méthode de fenêtrage 9,10 pour observer le développement embryonnaire des poussins. Dans cette technique, un trou ou une « fenêtre » est pratiqué dans la coquille de l’œuf recouvrant l’embryon. Le trou peut être refermé avec du ruban adhésif ou de la cire9 pour permettre un développement embryonnaire ultérieur. Bien que la méthode du fenêtrage présente certains avantages, tels que la possibilité de visualiser le développement embryonnaire et un entretien facile, cette méthode présente également plusieurs limites. La première est que la fenêtre doit être assez grande pour voir l’embryon entier (surtout à des stades avancés). Deuxièmement, les grandes fenêtres sont difficiles à sceller ; Une mauvaise étanchéité entraînera des problèmes de stérilité et de survie. L’utilisation de cire fondue comme scellant ajoute une autre étape peu pratique et salissante au protocole. Par conséquent, bien que la méthode du fenêtrage puisse être idéale pour les embryons de poussin aux jeunes stades (HH 11 – HH 27), il n’est pas facile de visualiser l’embryon entier à des stades avancés.
Ici, nous décrivons une technique de culture ex ovo améliorée et simple11 qui évite le besoin d’équipement de haute technologie, est facile à manipuler au stéréomicroscope, donne à l’embryon suffisamment de support pour effectuer des manipulations microscopiques et permet aux chercheurs de visualiser la croissance de l’embryon dans son intégralité jusqu’aux derniers stades de développement (jusqu’à HH 40-41). Grâce à ces progrès de la technique ex ovo, les individus accèdent à une compréhension plus complète du développement embryonnaire. Par exemple, la croissance vers des stades ultérieurs permet aux individus d’observer des processus de développement qui ne se produisent pas jusqu’à ce moment-là, tels que l’ossification, le développement des plumes et le développement avancé des membres et des yeux. L’ensemble de l’embryon, les membranes extra-embryonnaires et le système vasculaire sont clairement visibles. Des recherches plus avancées peuvent également être effectuées, telles que des manipulations embryonnaires (c’est-à-dire l’implantation de billes imbibées d’inhibiteurs ou l’insertion de barrières entre les couches de tissus), et les chercheurs sont alors en mesure d’observer l’effet des manipulations sur les embryons à un stade ultérieur.
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Protocole
Remarque: Toutes les fournitures sont énumérées dans le tableau 1.
1. Stockage du poulet embryons
- Incuber des œufs de poule de la souche Gallus gallus horizontalement à 37 o C avec environ 40% d'humidité et tourner oeufs une ou deux fois par jour. Mise oeufs est important de prévenir l'embryon d'adhérer à la coquille.
- Ne pas tourner l'œuf dans le 24 heures avant la mise en place de la culture contraire l'embryon sera situé ventrale à la masse de jaune et sera endommagé lors de l'ouverture de l'œuf à l'étape 3. En outre, garder les œufs à 4 o C degrés pour pas plus d'une semaine avant l'incubation au développement "d'arrêt", mais ce ne est pas idéal.
2. Mise en scène embryons de poulet
- Stade, les embryons de poulet en utilisant le Hamburger et Hamilton 12 table intermédiaire. L'étape idéale pour la mise en place de la culture ex-ovo est HH stade 19-20 (autour de 3 jours d'incubation) because ce est peu de temps après que la tête tourne à 53 HPF.
Remarque: étape HH 19-20 est caractérisé par les traits morphologiques suivantes: somites sont étendues dans la majorité de la queue, mais la fin de la queue reste non segmenté, la queue bourgeon est gondolé, l'allantoïde est petite et le système vasculaire a limité, les jambes bourgeons sont plus grandes que les ailes bourgeons et les yeux sont non pigmentée ou avoir une teinte grisâtre.
3. Retrait de l'embryon de la Shell
- Avant de retirer l'embryon de la coquille, pulvériser la coquille avec 70% d'éthanol et laisser sécher. Ne mettez pas l'œuf rapidement car cela pourrait endommager l'embryon.
- En faisant attention de ne pas modifier l'orientation de l'œuf, le crack attentivement l'œuf sur le côté inférieur (ce est à dire, le côté qui était ventrale pendant l'incubation) et libérer l'embryon dans une stérile pèsent bateau (88 x 88 x 23 mm). Essuyez peser bateaux avec 70% d'éthanol. Inspectez l'embryon de se assurer que le sac jaune ne est pas endommagé. Si le jaune hcomme cassé, jetez l'embryon, comme il ne survivra pas.
- Observer l'embryon pour se assurer qu'il est viable; le cœur bat, vasculaire semble normal, et aucune anomalie évidente sont présents. Veiller à ce que les bords du bateau peser sont secs.
- En utilisant une pipette, déposer 40 pi de pénicilline / streptomycine (5000 unités de pénicilline, la streptomycine 5 mg par ml) sur le dessus de l'albumine pour aider à prévenir l'infection.
4. Préparer la Chambre Humidité
- Placer une petite pile de KIM-lingettes et / ou un tampon absorbant en coton dans le fond d'un récipient en plastique stérile (12 x 12 x 6 cm) essuyés avec 70% d'éthanol.
- Ajouter l'eau distillée stérile pour humidifier les Kim-lingettes et / ou de coton (environ 150 ml d'eau).
5. Assemblage de l'Ex Ovo Culture
- Placer le bateau peser contenant l'embryon au-dessus du rembourrage humide. Ensuite, placez la moitié d'une boîte de Pétri stérile carré (9,5 x 9,5 cm) au-dessus de til pèse bateau pour former un couvercle lâche.
- Couvrir le récipient en plastique avec son couvercle. Appuyez deux coins du couvercle, assurant une étanchéité partielle qui permet encore pour une bonne circulation de l'air intérieur de la chambre.
- Placez délicatement la configuration dans le 37 o C incubateur jusqu'au stade désiré.
- Placer les conteneurs d'eau dans l'incubateur pour aider à contrôler l'humidité, si un incubateur à humidité contrôlée ne est pas disponible. Stériliser toute l'eau dans les chambres de l'humidité et dans l'incubateur et de reconstituer au besoin pendant la période d'incubation. 40% d'humidité optimal.
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Résultats
Cette ex ovo méthode permet pour l'observation des embryons de stade précoce de développement (HH 19/20) à un stade avancé de développement (HH 40-41) (figure 1a et 1b). Mise en place de la culture à HH 19-20 augmente de survie des embryons dans la culture. Avant la rotation de la tête (avant 53 HPF) de survie est très faible dans la culture et après l'étape 21, l'embryon a tendance à coller davantage à la coquille sur l'élimination de façon moins d'embryons intacts sont obtenu...
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Discussion
Ex ovo culture et de fenêtrage à la fois des avantages et des défis. Ici, nous comparons les avantages et les défis de la tasse de styromousse ex ovo et la méthode de fenêtrage à notre ex optimisé ovo méthode présentée ici. Notre méthode permet la manipulation et l'observation aisée de l'embryon de poulet aux derniers stades de développement et nos améliorations à l'ex ovo traditionnelle méthode 1, 2, 3 en font en outre très facile à utiliser dans les c...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne ont aucun intérêts financiers concurrents en ce qui concerne l'information présentée dans ce manuscrit.
Remerciements
Nous tenons à remercier Paul Poirier, le producteur de médias, à l'Université Mount Saint Vincent pour son travail dans le tournage et l'édition de la partie vidéo de ce manuscrit. Nous reconnaissons en sciences naturelles et en génie du Canada pour le financement.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Pénicilline/Streptomycine | Sigma | P4458 | Faire de petites aliquotes pour éviter les épisodes de gel/dégel |
| Boîte de Pétri | 9,5 cm x 9,5 cm | ||
| Pesée Bateau | Fischer Scientific | 8732113 | 88 x 88 x 23 mm |
| Conteneur Ziplock | Ziplock | N/A | 12 cm x 12 cm x 6 cm |
Références
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 41, 391-394 (1974).
- Gennaro, L. D., Packard, D. S., Stach, R. W., Wagner, B. J. Growth and differentiation of chicken embryos in simplified shell-less cultures under ordinary conditions of incubation. Growth. 44, 343-354 (1980).
- Tufan, C. A., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology. Neuroanat. 3, 8-11 (2004).
- Duench, K., Franz-Odendaal, T. A. BMP and Hedgehog signaling during the development of scleral ossicles. Dev. Biol. 365 (1), 251-258 (2012).
- Datar, S., Bhonde, R. R. Shell-less Chick Embryo Culture as an Alternative in vitro Model to Investigate Glucose-Induced Malformation in Mammalian Embryos. Rev Diabet Stud. 2 (4), 221-227 (2005).
- Chick embryos in shell-less culture. Tested studies for laboratory teaching. Fisher, C. J. 5th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE), , (1983).
- Dunn, B. E. Technique for shell-less culture of the 72-hour avian embryo). Poultry Science. 53, 409-412 (1974).
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- Silver, P. H. S. Special problems of experimenting in ovo on the early chick embryo, and a solution. J Embryol Exp Morph. 8 (4), 369-375 (1960).
- Spurlin, J., Lwigale, P. A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations. Dev. Dyn. 242 (2), 148-154 (2012).
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- Sys, G. M., et al. The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J. Vis. Exp. (77), e50522(2013).
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Réimpressions et autorisations
