Fluorescence Basé Technique d'extension d'amorce pour déterminer transcription Points de départ et des sites de clivage de RNases In Vivo

Christopher F. Schuster; Ralph Bertram

doi:10.3791/52134

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Article de méthode

Fluorescence Basé Technique d'extension d'amorce pour déterminer transcription Points de départ et des sites de clivage de RNases In Vivo

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DOI :

10.3791/52134

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31 octobre 2014

Christopher F. Schuster¹ , Ralph Bertram¹

¹Department of Microbial Genetics, Interfaculty Institute of Microbiology and Infection Medicine Tübingen (IMIT), Faculty of Science, University of Tübingen

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons ici une méthode d’extension d’amorce basée sur la fluorescence pour déterminer les points de départ transcriptionnels à partir de transcrits bactériens et le traitement de l’ARN in vivo à l’aide d’un séquenceur de gel automatisé.

Résumé

L'extension d'amorce à base de fluorescence (FPE) est une méthode moléculaire pour déterminer les points de départ de la transcription ou des sites de traitement de molécules d'ARN. Ce résultat est obtenu par transcription inverse de l'ARN d'intérêt en utilisant des amorces marquées par fluorescence spécifiques et l'analyse ultérieure des fragments d'ADNc obtenus par électrophorèse dénaturante sur gel de polyacrylamide. En même temps, une réaction classique de séquençage de Sanger est exécuté sur le gel vers la carte les extrémités des fragments d'ADNc à leurs bases correspondantes exactes. Contrairement à 5'-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends), où le produit doit être cloné et séquencé plusieurs candidats, la majeure partie des fragments d'ADNc générés par extension d'amorce peut être détecté simultanément en une seule opération de gel. En outre, l'ensemble de la procédure (à partir de la transcription inverse de l'analyse finale des résultats) peut être complété en une journée de travail. En utilisant des amorces marquées par fluorescence, l'utilisation de réactifs dangereux isotope radioactif étiquetépeut être évitée et les délais de traitement sont réduites comme produits peuvent être détectés au cours de la procédure d'électrophorèse.

Dans le protocole suivant, nous décrivons une méthode d'extension d'amorce fluorescente in vivo pour détecter de manière fiable et rapide des extrémités 5 'des ARN de déduire la transcription des points de départ et les sites de traitement de l'ARN (par exemple, par les composants du système toxine-antitoxine) en S. aureus, E. coli et d'autres bactéries.

Introduction

^Une extension d'amorce est une méthode moléculaire pour déterminer les extrémités 5 'des molécules d'ARN spécifiques à une résolution d'une base. L'avantage à d'autres méthodes telles que 5'-RACE (amplification rapide des extrémités d'ADNc) est le délai d'exécution rapide et la capacité d'analyser facilement un mélange de différentes longueurs de molécules d'ARN.

Cette méthode fonctionne en soumettant des molécules d'ARN à des réactions de transcription inverse en utilisant des amorces fluorescentes spécifiques, générant des fragments d'ADNc de certaines longueurs. Ces molécules d'ADNc sont longent les réactions de séquençage d....