Article de méthode

Une méthode hybride d'extraction d'ADN pour l'évaluation qualitative et quantitative des communautés bactériennes de la volaille Échantillons de production

DOI :

10.3791/52161

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10 décembre 2014

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1Egg Safety and Quality Research Unit, USDA-Agricultural Research Service, 2Poultry Microbiological Safety and Processing Research Unit, USDA-Agricultural Research Service, 3Department of Biochemistry and Biophysics, Oregon State University, 4College of Public Health, University of Georgia, 5Department of Biological Sciences, Center for Microbial Genetics and Genomics, Northern Arizona University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une nouvelle méthode d’extraction semi-automatisée d’ADN hybride destinée à être utilisée avec des échantillons de volaille environnementaux a été mise au point et a démontré des améliorations par rapport à une méthode d’extraction mécanique et enzymatique courante en termes d’estimations quantitatives et qualitatives des communautés bactériennes totales.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'efficacité des protocoles d'extraction d'ADN peut être très dépend à la fois du type d'échantillon objet de l'enquête et les types d'analyses effectuées en aval. Considérant que l'utilisation de nouvelles techniques d'analyse de la communauté bactérienne (par exemple, microbiomique, métagénomique) est de plus en plus répandue dans les sciences agricoles et environnementales et de nombreux échantillons de l'environnement au sein de ces disciplines peut être physiochimique et microbiologiquement uniques (par exemple, les selles et les échantillons litière / literie de le spectre de la production de volaille), les méthodes d'extraction d'ADN appropriées et efficaces doivent être choisis avec soin. Par conséquent, une méthode d'extraction d'ADN hybride roman semi-automatique a été développé spécifiquement pour une utilisation avec des échantillons de production de volaille de l'environnement. Cette méthode est une combinaison des deux types principaux de: extraction d'ADN enzymatique et mécanique. A deux étapes intense étape d'homogénéisation mécanique (en utilisant cordon de battre spécialement formulé pour enviTal échantillons) ont été ajoutés au début du procédé d'extraction d'ADN de «gold standard» enzymatique des échantillons fécaux pour améliorer l'élimination des bactéries et de l'ADN à partir de la matrice de l'échantillon et d'améliorer la récupération d'éléments à Gram positif communauté bactérienne. Une fois que la portion d'extraction enzymatique du procédé hybride a été lancé, le procédé de purification restant a été automatisé en utilisant un poste de travail robotique pour augmenter et diminuer le débit d'échantillons échantillon erreur de traitement. En comparaison avec les méthodes mécaniques et enzymatiques strictes extraction de l'ADN, cette méthode hybride roman fourni la meilleure performance globale combinée lors de l'examen quantitatif (en utilisant l'ARNr 16S qPCR) et qualitative (en utilisant microbiomique) des estimations des communautés bactériennes totales lors du traitement des excréments de volaille et des échantillons de litière .

Introduction

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Lors de l’analyse d’échantillons cliniques ou environnementaux complexes (par exemple, matières fécales, sols), deux méthodologies principales sont utilisées pour l’extraction de l’ADN. La première est une rupture mécanique de la matrice à l’aide d’une étape intense de battage des billes, tandis que la seconde est une perturbation enzymatique de la matrice pour libérer chimiquement des cellules bactériennes et inhiber simultanément les inhibiteurs de PCR de la matrice. Étant donné les différents moyens par lesquels ces deux types de méthodes d’extraction fonctionnent, il n’est pas surprenant que des études antérieures aient démontré que la méthode d’extraction de l’ADN appropriée dépend à la fois fortement de l’échantillon et de l’analyse. Des études comparatives d’extraction d’ADN ont précédemment montré que certaines méthodes sont plus appropriées pour améliorer la qualité et la quantité d’ADN à partir d’échantillons environnementaux1-3, tandis que d’autres ont démontré des améliorations pour les analyses au niveau communautaire telles que l’électrophorèse sur gel à gradient dénaturant (DGGE)4-6, le polymorphisme de longueur de fragment de restriction terminale (T-RFLP)7, l’analyse automatisée de l’espaceur intergénique ribosomique (ARISA)8 et les microréseaux phylogénétiques9. Par conséquent, des méthodes d’extraction de l’ADN appropriées doivent être utilisées, ou mises au point, en fonction des types d’échantillons environnementaux et des types d’analyses effectuées sur ces échantillons, en particulier compte tenu des progrès récents dans les analyses des communautés bactériennes.

Le séquençage de nouvelle génération, en conjonction avec des évaluations communautaires plus quantitatives (par exemple, la PCR quantitative (qPCR)), est de plus en plus répandu dans les sciences environnementales et cliniques, cependant, très peu de recherches ont été effectuées pour déterminer l’effet des méthodes d’extraction de l’ADN sur ces ensembles de données. La plupart des études comparatives d’extraction d’ADN portaient sur des estimations de la communauté microbiomique à partir d’échantillons humains ou de modèles humains10,11, et non d’échantillons d’animaux agricoles. Les quelques études de séquençage de nouvelle génération axées sur la volaille ont porté sur des questions métagénomiques12, 13 ou microbiomiques14 spécifiques ; ils n’ont pas discuté de l’effet de la méthode d’extraction de l’ADN sur les analyses microbiomiques résultantes. Compte tenu de la nature complexe des échantillons environnementaux liés à la production de volaille (p. ex., matières fécales, litière/litière, sol de pâturage), les méthodes d’extraction de l’ADN doivent être choisies avec soin. On sait que les échantillons environnementaux liés à la volaille contiennent un grand nombre d’inhibiteurs de la PCR et que des dilutions d’extraits d’ADN allant jusqu’à 500 fois ont été nécessaires pour la PCR et l’analyse ultérieureen aval 15-17. Par conséquent, il est essentiel que les méthodes d’extraction de l’ADN soient optimisées pour ces types d’échantillons afin non seulement de perturber physiquement la matrice, mais aussi de pouvoir réduire/éliminer le grand nombre d’inhibiteurs présents.

Le QIAamp DNA Stool Mini Kit, une méthode d’extraction enzymatique, a été considéré comme la « référence absolue » lors de l’extraction de l’ADN à partir d’échantillons intestinaux/fécaux difficiles1,18,19 et a été appliqué avec succès à des échantillons environnementaux de volaille8,14. L’élimination enzymatique des inhibiteurs de PCR grâce à l’utilisation d’une matrice exclusive est l’un des plus grands avantages de l’utilisation de cette méthode pour ces types d’échantillons environnementaux, tout comme la capacité d’améliorer considérablement le débit (et de réduire les erreurs de traitement des échantillons) à l’aide de postes de travail automatisés. L’un des principaux inconvénients est l’absence d’une étape d’homogénéisation mécanique permettant de dissocier physiquement les cellules bactériennes de la matrice environnementale. Lors de l’analyse d’échantillons intestinaux et fécaux d’autres types de volailles, l’ajout d’une étape de battement de billes ou de perturbation mécanique dans un protocole d’extraction d’ADN a considérablement augmenté l’efficacité de l’extraction9, le rendement/la qualité de l’ADN1,4,5 et a considérablement amélioré les analyses des communautés en aval en termes de richesse, de diversité et de couverture5,6,11. Ces études ont comparé non seulement les méthodes de battage mécanique des billes à la méthode enzymatique « de référence », mais certaines ont également ajouté l’étape de battage mécanique des billes au protocole enzymatique pour améliorer les résultats6,9,11.

Selon les résultats des études ci-dessus, les analyses des communautés bactériennes (qualitatives et quantitatives) pourraient être améliorées à partir d’échantillons environnementaux liés à la volaille par l’ajout d’une étape d’homogénéisation mécanique à la méthode enzymatique. Par conséquent, l’objectif de cette étude était double : (1) développer une nouvelle technique d’extraction d’ADN qui utilise les aspects les plus souhaitables des méthodes d’extraction mécanique (étape d’homogénéisation puissante) et enzymatique (élimination et automatisation des inhibiteurs de PCR) et (2) comparer les évaluations quantitatives (via qPCR) et qualitatives (via la microbiomique) de la communauté bactérienne de cette nouvelle méthode aux méthodes mécaniques et enzymatiques représentatives.

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Protocole

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1. homogénéisation mécanique de volailles de l'environnement Échantillons de production

  1. Avant l'extraction, régler un bain d'eau à 95 ° C et laisser le temps du bain d'eau pour atteindre cette température.
  2. Peser 0,33 g de sol ou de matières fécales dans un 2 ml de lyse Matrice E tube.
    1. Ne pas dépasser 0,33 g d'échantillon dans le tube, car dans ce cas les solutions suivantes pour dépasser la capacité du tube.
    2. Dégeler les échantillons congelés à RT avant la pesée.
    3. Afin d'analyser un total de 1 g de sol / matières fécales, peser 3 répliquer 0,33 g échantillons pour chaque échantillon environnementale individuelle.
    4. Conserver les échantillons à -20 ° C dans les tubes de matrice coniques avant l'extraction, si nécessaire.
  3. Ajouter 825 ul de tampon phosphate de sodium et 275 ul de solution PLS à un tube d'échantillon. Mélanger en utilisant un vortex pendant environ 15 secondes, puis centrifuger les échantillons à 14 000 xg pendant 5 min.
  4. Décanter le supernaTant et ajouter 700 ul de tampon ASL. Mélanger en utilisant un vortex pendant 5 secondes.
    1. Assurez-vous que l'espace libre est (~ 10% du volume total) disponibles dans le tube conique à ce point. Se il n'y a pas d'espace de tête, les tubes vont avoir tendance à se échapper au cours de la prochaine étape d'homogénéisation qui pourrait conduire à une contamination croisée et / ou la perte de l'échantillon.
  5. Placer les échantillons dans un 24 instrument FastPrep, et homogénéiser les échantillons à une vitesse de 6,0 m / s pendant 40 s.
  6. Centrifuger l'échantillon homogénéisé à 14 000 g pendant 5 min. Transférer le surnageant dans un 2 ml microtube stérile.
  7. Pour maximiser la récupération de l'ADN de l'échantillon, répéter les étapes 1.4 à 1.6, en combinant les surnageants dans la même stérile, 2 ml tube de microcentrifugation.

2. Inhibition enzymatique des inhibiteurs d'exemples à partir d'homogénats

NOTE: Ce protocole utilise le kit QIAamp DNA Stool Mini.

  1. Incuber lasurnageant dans un bain d'eau à 95 ° pendant 5 minutes pour maximiser la récupération d'ADN à partir des cellules restantes dans le surnageant.
    1. Incuber à 70 ° C pour la plupart des échantillons contenant des organismes à Gram négatif. Toutefois, si des organismes Gram-positifs sont présentes (ce qui est le cas de la volaille échantillons fécaux), incuber à 95 ° C.
    2. Utilisez des pinces de blocage en plastique sur les microtubes de se assurer que les tubes ne seront pas «pop» ouvert et potentiellement perdre volume de l'échantillon que la pression peut se accumuler dans ces microtubes scellés.
  2. Ouvrez chaque microtube pour relâcher la pression, re-capitalisation des microtubes et mélanger à l'aide d'un vortex pendant 15 secondes.
  3. Centrifuger l'échantillon à 14 000 g pendant 1 min, retirer 1,2 ml du surnageant et le placer dans un nouveau 2 ml microtube stérile.
  4. Ajouter une onglet Inhibitex à chaque échantillon et mélanger à l'aide d'un vortex jusqu'à l'échantillon devient un liquide uniformément blanc / blanc cassé.
    1. Évitez touching l'onglet Inhibitex en le plaçant dans le tube à centrifuger contenant l'échantillon. Pour ce faire, placez le blister contenant l'onglet directement sur le tube de microcentrifugeuse ouvert et pousser délicatement la languette sur le blister et dans le tube à centrifuger.
  5. Incuber l'échantillon pendant 1 minute à température ambiante (~ 25 ° C) et centrifuger à 14 000 xg pendant 5 min.
  6. Transférer tout le liquide à un tube de 1,5 ml microcentrifugeuse stérile et centrifuger à 14 000 g pendant 5 min.
    1. Eviter les particules restantes qui peuvent avoir culot au fond du tube de microcentrifugation à la fin de l'étape 2.5 lors du transfert du liquide.

3. automatisé de purification d'ADN Utilisation du poste de travail robotique QIAcube

REMARQUE: Le nombre de consommables en plastique, la disposition des adaptateurs échantillon de rotor dans la centrifugeuse, et les volumes requis des tampons / solutions dépendent de la numbre d'échantillons qui sont en cours d'exécution.

  1. Ajouter tubes d'élution et les tubes de filtre pour les emplacements appropriés dans les adaptateurs de rotor. Pour chaque échantillon, ajouter 400 ul de milieu de la fente de l'adaptateur de rotor. Placer les adaptateurs de rotor dans la centrifugeuse du poste de travail dans le bon arrangement en fonction du nombre d'échantillons en cours de purification.
    1. Assurez-vous que tous les couvercles de tubes à centrifuger sont correctement fixés dans l'adaptateur de rotor depuis un défaut de le faire pourrait entraîner en cisaillement lors d'une des étapes de centrifugation du protocole de purification.
  2. Ajouter le nombre requis de 1 000 pi et 200 pi-filtres conseils pour le poste de travail, et de remplir les bouteilles tampons fournis avec le volume requis de tampons.
    REMARQUE: Les tampons nécessaires pour ce protocole de purification (AL, AW1, AW2, et AE) sont tous contenus dans le kit QIAamp DNA Stool Mini. L'utilisateur doit fournir de l'éthanol à 100% ce qui est nécessaire pour la BU AWffres et comme une solution utilisée dans le procédé de purification.
  3. Ajouter le volume nécessaire de la solution fournie de protéinase K dans un tube de 1,5 ml microcentrifugeuse stérile et le placer dans la fente A sur le poste de travail. En outre, ajouter le nombre requis (égal au nombre d'échantillons purifiés) de 2 ml coffre-blocage des tubes à échantillon à centrifuger RB à la section d'agitateur de la station de travail.
    1. Veiller à ce que les couvercles des tubes échantillons sont bien placés dans les emplacements appropriés sur le poste de travail, car un échec de le faire se traduira par une erreur lorsque l'appareil numérise d'abord le poste de travail pour se assurer que tous les plastiques et liquides nécessaires sont disponibles pour la demande fonctionner.
  4. Utiliser l'écran tactile sur le poste de travail, sélectionnez l'ADN Tabouret - Tabouret humain - Protocole de détection de pathogènes, et de lire à travers les écrans qui suivent pour se assurer que le poste de travail a été chargé correctement. Une fois tous les écrans de contrôle sont passés, sélectionnez Démarrer pour exécuter ce protocole.
    1. Si extraire l'ADN de plus de 12 échantillons, commencer le processus d'homogénéisation (étape 1) pour la prochaine série d'échantillons, depuis une série de 12 échantillons prend ~ 72 min pour terminer sur le poste de travail.
  5. Retirez les échantillons des adaptateurs de rotor, plafonner eux, et le lieu de -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire pour les analyses ultérieures en aval.
    1. À ce stade, combiner les trois purifications répétées pour un échantillon individuel (total analysé quantité = 1 g) en utilisant un système de centrifugation / base évaporation. Combiner les répétitions et ré-élution à un volume final de 100 ul de tampon Tris-EDTA.

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Résultats

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Pour cette étude, les fientes fraîches et échantillons de litière ont été récupérés à partir d'une maison de commerce de poulets de chair (~ 25 000 oiseaux) dans le sud-est des États-Unis. Les poulets de chair (Gallus gallus) étaient Cobb-500 traverse, et ils étaient âgés de 59 jours au moment de l'échantillonnage. Échantillons de matières fécales et des litières fraîches ont été récupérés à partir de quatre domaines distincts dans la maison (près de garniture de refroidissement, à proximité des lignes abreuvoi...

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Discussion

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La méthode d'extraction d'ADN utilisée effectué les estimations totales communautaires bactériennes quantitatifs et qualitatifs pour les deux échantillons de matières fécales et de la litière, supportant l'échantillon analyses nature dépendante des méthodes d'extraction d'ADN vu précédemment 1,3,6. Pour les deux échantillons de matières fécales et de la litière, l'ordre d'exécution des méthodes d'extraction d'ADN était différent pour le quantitatif (mécanique> Hybrid>...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Les auteurs tiennent à remercier Latoya Wiggins et Katelyn Griffin pour leur aide dans l’acquisition d’échantillons, ainsi que Laura Lee Rutherford pour leur aide dans l’échantillonnage et les analyses moléculaires. Nous tenons également à remercier Sarah Owens de l’Argonne National Lab pour la préparation et le séquençage des échantillons microbiomiques. Ces recherches ont été appuyées à parts égales par l’Agricultural Research Service, les projets CRIS de l’USDA « Pathogen Reduction and Processing Parameters in Poultry Processing Systems » #6612-41420-017-00 et « Molecular Approaches for the Characterization of Foodborne Pathogens in Poultry » #6612-32000-059-00.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Lysing Matrix E tubeMPBio6914-050Différentes tailles disponibles et les 3 derniers numéros du chat. Non. indiquer la taille (-050 = 50 tubes, -200 = 200 tubes, -1000 = 1 000 tubes)
Solution de phosphate de sodiumMPBio6570-205Peut être achetée individuellement, ou également contenue dans le kit de spinning FastDNA pour les matières fécales (Cat. N° 116570200)
Tampon PLSMPBio6570-201
Tampon ASL (560 ml)Qiagen19082
FastPrep 24 homogénéisateurMPBio11600450048 x 2 ml Adaptateur HiPrep (Cat. N° 116002527) disponible pour doubler le débit de l’étape d’homogénéisation mécanique
QIAamp DNA Stool Mini KitQiagen51504
QIAcube24 (110V)Qiagen9001292Les résultats préliminaires montrent que QIAcube HT (Cat. N° 9001793) peut être utilisé pour améliorer le rendement, mais différents consommables sont requis de cette machine et un travail plus comparatif doit être effectué.
Filtres-pointes, 1 000 ml (1024)Qiagen990352
Filtres-tiges, 200 ml (1024)Qiagen990332
QIAcube Rotor Adaptateurs (10 x 24)Qiagen990394Pour les tubes de microcentrifugation de 1,5 ml inclus dans le kit d’adaptation de rotor, il existe une alternative.  ; Il s’agit de Sarstedt Micro tube 1,5 ml Capuchon de sécurité, Cat. N° 72.690
Tubes d’échantillonnage RB (2 ml)Qiagen990381Alternative : Eppendorf Safe-Lok micro tube à essai, Cat. N° 022363352

Références

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Mots-clés

Mechanical HomogenizationEnzymatic ExtractionBead BeatingRobotic WorkstationPCR Inhibitor Removal16S rRNA qPCRMicrobiome AnalysisPoultry Fecal SamplesEnvironmental Sample Processing

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