Ici, nous décrivons un test simple pour la quantification de la réponse alimentaire chez l’hydre induite par la forme réduite du glutathion. Ce test repose sur la mesure de la distance entre l’extrémité apicale du tentacule et la bouche de l’hydre.
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Article de méthode
Mesure induite glutathion-réponse d'alimentation à Hydra
Dans cet article
Résumé
Résumé
Hydra est l’un des organismes les plus primitifs possédant un système nerveux et une chimiosensation pour détecter une réduction du glutathion (GSH) pour capturer la proie. Le mouvement des organismes proies provoque une décharge mécanosensorielle des cellules urticantes appelées nématocystes de l’hydre, qui sont insérées dans la proie. La réponse alimentaire chez l’hydre, qui comprend l’enroulement des tentacules pour amener la proie vers la bouche, l’ouverture de la bouche et l’engloutissement consécutif de la proie, est déclenchée par la présence de GSH dans le liquide libéré de la proie blessée. Pour pouvoir identifier le mécanisme moléculaire de la réponse alimentaire chez l’hydre qui est inconnu à ce jour, il est nécessaire d’établir un test pour mesurer la réponse alimentaire. Ici, nous décrivons une méthode simple de quantification de la réponse alimentaire dans laquelle la distance entre l’extrémité apicale du tentacule et la bouche de l’hydre est mesurée et le rapport de cette distance avant et après l’ajout de GSH est déterminé. Il s’est avéré que le rapport, appelé propagation relative des tentacules, donnait une mesure de la réponse alimentaire. Ce test a été validé à l’aide d’un modèle de famine dans lequel l’hydre affamée montre une réponse alimentaire améliorée par rapport à l’hydre nourrie quotidiennement.
Introduction
Hydra est l’organisme le plus primitif possédant un système nerveux et une chimiosensation pour détecter une réduction du glutathion (GSH) pour capturer la proie1. Il se nourrit d’une variété d’animaux tels que des nématodes, des crustacés, des larves d’insectes, des têtards et des poissons nouvellement éclos1. Le mouvement de ces organismes proies provoque une décharge mécanosensorielle des capsules urticantes appelées nématocystes de l’hydre, qui sont insérées dans la proie2. Le GSH présent dans le liquide libéré de la proie blessée active par la suite la réponse alimentaire chez hydra, ce qui comprend l’enroulement des tentacules pour amener la proie vers la bouche, l’ouverture de la bouche et l’engloutissement consécutif de la proie. Il a été démontré que plusieurs molécules, telles que la dopamine3, le glutamate4, le GABA, la glycine5, les récepteurs NMDA6 et l’allatotropine7, sont impliquées dans la réponse alimentaire de l’hydre. Il a également été démontré que la réponse chimiosensorielle induite par le GSH est modulée par l’état alimentaire de l’animal, de sorte que l’hydre affamée présente une réponse alimentaire accrue1. Une telle augmentation de la sensibilité au GSH est biologiquement pertinente, car en cas de famine, l’hydre doit trouver ses proies à une sensibilité plus élevée.
Bien que la réponse alimentaire induite par le GSH puisse être clairement observée au microscope, les méthodes généralement utilisées pour mesurer les observations de la réponse alimentaire sont non quantitatives. Dans la plupart des cas, le temps pendant lequel la bouche de l’hydre reste ouverte a été pris comme mesure de la réponse alimentaire8,9 ; Alors que dans un autre cas, la quantification était basée sur le nombre d’hydres par rapport à une population montrant la réponse alimentaire10. Cependant, l’observation du temps d’ouverture de la bouche des polypes de l’hydre est lourde et sujette à des variations induites par des paramètres incontrôlables tels que la direction de l’orientation de la bouche lors des observations. De même, comme la réponse alimentaire est un paramètre quantitatif, les approches basées sur la population sont sujettes à des variations/erreurs causées par l’opinion ou le biais d’observation de l’observateur individuel. Pour contourner ces problèmes, nous avons développé une méthode de quantification relative de la réponse alimentaire chez l’hydre (Hydra vulgaris Ind-Pune11) basée sur la distance entre l’extrémité apicale du tentacule et la bouche du polype de l’hydre.
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Protocole
1. Hydra culture et la mesure de la réponse d'alimentation
- Maintenir polypes hydra en culture en les alimentant tous les jours avec des artémias et les conserver dans un moyen (1 mM de tampon Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM de NaCl, 1 mM de CaCl2, 0,1 mM de KCl, 0,1 mM et MgSO 4) contenu dans un bol verre à 18 ° C sous la lumière 12 h 12 cycles sombres de h comme décrit plus haut 12.
- Pour mesurer la réponse d'alimentation, de transfert d'âge mûr polype hydre ayant 5 à 6 tentacules à un seul puits d'une plaque de 24 puits. Retirez le moyen résiduel du bien en l'inclinant, puis ajouter immédiatement 500 pi de milieu frais.
- Préparer la solution de glutathion 9 uM dans le milieu hydre. Etant donné que la solution de glutathion est sujette à l'oxydation, en utilisant toujours une solution fraîchement préparée de glutathion pour chaque expérience.
- Transférer la plaque de la plate-forme de formation d'image d'un microscope comportant des dispositifs pour l'enregistrement de l'image. Utilisez un fond sombre telle que le comportement opolype hydre f peut être clairement illustré dans le contexte contrasté.
- La salle utilisée pour l'observation et l'imagerie du comportement de Hydra gratuit de feux dont l'intensité, la fluctuation des courants d'air et le bruit. De telles perturbations peuvent également causer le polype hydre à afficher contraction des tentacules - même en l'absence de glutathion.
- Laisser le polype pour se détendre pendant 5 min.
- Assurez-vous que le polype est situé le long de la région centrale du bien telle que le comportement peut être imagée clairement. Si le polype est au bord du puits, apporter au centre par le moyen de rinçage à l'aide d'une pipette de nouveau et lui permettre de se relaxer.
- Capturer une image de l'hydre à l'état détendu. Ce sera l'observation du point zéro-temps.
- Ajouter rapidement 9 uM solution de glutathion pour atteindre une concentration finale de 3 uM dans le puits. Selon le but de l'expérience et de la réponse montre hydre, tester une gamme de différentes concentrations de glutathion et chooSE concentration appropriée requise.
- Lancer le chronomètre immédiatement après addition d'une solution de glutathion et de capturer des images après chaque 15-30 sec pour 4-5 min. Ne pas modifier les paramètres d'agrandissement au cours de l'imagerie time-lapse.
- Ajouter la solution de glutathion doucement et avec un débit uniforme de telle sorte que la position de l'animal dans le puits serait très peu perturbé dans le champ de vision du microscope. Toutefois, si le polype se déplace largement après addition d'une solution de glutathion, déplacer la plaque très doucement pour amener le polype dans le champ de vision pour la capture d'image.
- Dans l'expérience de contrôle, utilisez défaut moyen glutathion tout en gardant tous les autres paramètres identiques.
- Assurez-vous d'effectuer toutes les étapes expérimentales ci-dessus au cours de la première moitié de la journée - avant 13 heures pour éviter l'effet possible du rythme circadien sur la mesure de la réponse de l'alimentation.
- Ouvrez chacune des images capturées à l'aide de l'Image Manipulation Program GIMP (GNU). Utilisez la fonction "Mesure" disponible à partir de Menu> Outils> Mesurer pour déterminer la distance entre l'extrémité apicale de chacun des tentacules et hypostome. Si l'ouverture de la bouche est observée dans aucune des images, déterminer la distance entre le centre de la bouche ouverte et l'extrémité apicale du tentacule. Reportez-vous à cette distance que la propagation de tentacule.
- Calculer la propagation de tentacule moyenne pour chaque polype avant et après exposition de glutathion. Calculer le rapport de la propagation de tentacule moyenne au point zéro de temps pour que à chacun des points de temps ultérieurs. Ce rapport sera appelé rapport tentacule propagation.
- Répétez mesures pour au moins 20 polypes.
2. Validation de la méthode utilisant leLa famine modèle
- Pour la famine, transférer quelques polypes hydra dans un bol en verre séparée et ne les nourrissez pas pendant 5 jours. Nourrir le groupe de quelques polypes de contrôle quotidien avec artémias dans un bol de taille similaire. Changer le support à la fois expérimentale bols par jour pour éviter le développement de champignons dans le milieu.
- Le jour de l'expérience, nourrir le groupe de l'hydre de commande avec artémias pendant 1 heure et utiliser ces hydre pour les expériences ultérieures après avoir retiré artémias non consommés et mort du milieu.
- Mesurer la réponse d'alimentation de l'hydre de faim par rapport à l'hydre de groupe de contrôle par la méthode décrite précédemment à l'étape 1. Pour éviter tout biais dû au temps de l'observation, alterner les mesures de chacun des affamés et contrôler polypes Hydra.
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Résultats
Le glutathion provoque hydre exposer curling des tentacules vers la bouche dans le but d'engloutir la proie. Cette curling de tentacules apporte extrémités apicales des tentacules plus près de la hypostome. Cela se traduit par la réduction de la propagation du tentacule, ou la distance linéaire entre l'extrémité apicale du tentacule et hypostome (figure 1). La propagation de tentacule relative, ou le rapport de tentacule moyenne réparties avant et après l'ajout de glutathion, en moyenne sur plusieurs po...
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Discussion
Comportement alimentaire dans hydre représente l'un des systèmes les plus chimiosensoriels ancestrales dans les métazoaires. Bien que la présence de GSH dans le liquide crustacé libéré après la capture des proies assisté nématocyste-été détecté depuis longtemps 1, ni la protéine GSHR ni le gène codant putatif / s ont été caractérisés à ce jour de Hydra. Quelques tentatives ont été effectuées pour caractériser GSH protéines de liaison à hydre 8, 14, 15. Cependant, l'identité de ces protéines...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.
Remerciements
Les auteurs remercient K. P. Madhu, Nita Beliappa et le personnel du Centre des médias de l’Institut indien d’éducation et de recherche scientifiques, Pune, pour leur aide dans la production vidéo. Les travaux ont été soutenus par un financement dans le cadre du programme du Centre d’excellence du Département de biotechnologie du gouvernement de l’Inde à SG et par une bourse postdoctorale du Département de la science et de la technologie du gouvernement de l’Inde à RK.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Incubateur réfrigéré | Panasonic | MIR-254-PE | |
| Microscope | Leica | S8AP0 ; | |
| Appareil photo pour microscope | Leica ; | EC3 | |
| Glutathion réduit | Sigma | G4251 | Stocké à 4 ° ;C. Amenez la bouteille à température ambiante avant de l’ouvrir pour éviter l’oxydation Programme |
| d’édition d’images | GIMP | Version 2.8 |
Références
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Réimpressions et autorisations
