Une nouvelle technique pour l'analyse quantitative de la perte de cheveux chez la souris Utilisation de l'analyse des niveaux de gris

Alopécie (perte de cheveux) peut être un événement psychologiquement et émotionnellement pénible aux causes multiples. Homme-calvitie est la cause la plus commune de l'alopécie, affectant environ deux tiers des hommes de 35 ans ^1. Une tendance similaire de la perte de cheveux peut être observée chez les femelles présentant un syndrome des ovaires polykystiques. Dans ces deux troubles, la perte de cheveux est médiée androgène. Alopécie peut également se produire comme une maladie auto-immune, la pelade, qui touche 1,7% de la population ^2. L'alopécie peut se produire comme un effet secondaire de certains traitements médicaux, tels que la chimiothérapie ^3. Un pourcentage élevé (65-85%) des patients en chimiothérapie expérience dans une certaine mesure de l'alopécie ^4,5. Les conséquences psychologiques de la perte de cheveux ont été bien étudiés dans le cadre de la chimiothérapie. Alopécie induite par la chimiothérapie peut entraîner de l'anxiété, la dépression, une image négative de leur corps, réduit l'estime de soi et un sentiment réduite de bien-être ^6,7. Une haute peourcentage (47-58%) des patients atteints de cancer chez les femmes considèrent la perte de cheveux à l'aspect le plus traumatisant de la chimiothérapie, et jusqu'à 8% de baisse de traitement par crainte de la perte de cheveux ^4,6. Il existe également des preuves dans l'alopécie androgénique pour soutenir thérapie pour réduire les conséquences psychologiques et même médicaux de perte de cheveux ^8,9. De même, la pelade a été signalé à avoir des conséquences psychologiques graves ^2, et de la nature inégale de la perte de cheveux peut conduire à un résultat esthétique plus désagréable que la plupart des autres causes de perte de cheveux.

Alors que les médicaments ayant des effets anti-androgènes doux (ce est à dire, la spironolactone) avaient été utilisées avec un succès limité comme traitement pour l'alopécie, le premier médicament efficace pour l'alopécie était minoxidil ^10. Ce antihypertenseur a un effet secondaire observé de provoquer la croissance des cheveux, et est maintenant utilisé comme traitement topique pour de nombreuses formes d'alopécie. Cependant, les réponses sont souvent incomplets, certains sujets ne montrant que lentetion de la perte de cheveux plutôt que ¹⁰ repousse réel. Le finastéride est un antagoniste compétitif de taper II 5α-réductase qui bloque la conversion de testostérone en dihydrotestostérone, résultant en des améliorations dans l'alopécie androgénique au détriment de blocage androgénique partielle systémique. Les taux de réponse avec à long terme (10 ans) thérapie sont environ 50% ^11. Globalement, malgré des recherches considérables dans ce domaine, il n'y a toujours pas de thérapie adéquate pour la perte de cheveux.

Pendant des décennies, les scientifiques et les cliniciens ont examiné les méthodes de mesure de la croissance de cheveux de cuir chevelu dans les essais cliniques. Avec le développement de médicaments utilisés pour traiter l'alopécie, on a un besoin accru de moyens fiables, économiques et peu invasive de mesure de la croissance des cheveux et, plus particulièrement, la réponse au traitement. Image en technologie d'analyse pour une quantification précise de la densité des cheveux chez les patients présentant des troubles de perte de cheveux a abouti à des résultats cohérents et valables dans le passé en utilisant une variété de techniques, y compris l'analyse des images numérisées ^12, analyse de l'image de poils individuels et les lésions ¹³ peau, et le balayage au microscope à quantifier la masse de cheveux dans une région du cuir chevelu ¹⁴ défini.

Malheureusement, alors que les méthodes ci-dessus ont permis d'améliorer l'évaluation de l'efficacité pour les cheveux favorisant la croissance interventions dans les essais cliniques, ces méthodes ne ont pas été appliquées aux études sur les rongeurs dans les études précliniques. Notre objectif est de développer une méthode cohérente et fiable de quantifier la perte de cheveux chez la souris, ce qui permettra aux enquêteurs d'évaluer et de comparer de nouvelles approches thérapeutiques pour diverses formes d'alopécie plus de précision. Nous avons développé une méthodologie utilisant des équipements facilement disponibles dans la plupart des laboratoires qui permettront quantification rapide et fiable de la densité des cheveux chez la souris avec des cheveux bruns ou noirs. Cette méthodologie a été testée dans des modèles murins de l'alopécie induite par la chimiothérapie, la pelade, l'alopécie et de Waxing. Un protocole détaillé est présenté pour l'exécution de ces mesures, y compris les données de validation de C57BL / 6 et C3H / HeJ souches de souris. Comme cette technique repose sur la détection de l'absorption de lumière à partir de pigments dans la tige du cheveu, il ne peut être utilisé pour détecter la croissance des cheveux chez les souris blanches ou des souris albinos.

Déclaration éthique: Toutes les études portant sur des animaux doivent être approuvés par le IACUC de l'institution (pour les données qui suivent, les protocoles ont été approuvés par le IACUC Montefiore, le protocole # 11-6-240 et 13-7-100 #). Les animaux sont fournis anesthésie légère comme indiqué dans le seul but de les garder encore pendant la photographie, il n'y a pas de procédures douloureuses requises pour ce protocole.

1. Acquisition de Photographies

1. Mise au point et le champ de vision pour imageur de gel en utilisant du papier avec du texte imprimé. Vérifiez uniformité de source de lumière à travers la région photographiée. Pour assurer l'uniformité, utiliser un imageur de gel avec un construit en source de lumière pour la photographie réfléchissante. Ne pas utiliser une source de lumière de transillumination, car cela créerait une silhouette de l'animal qui est impropre à une analyse plus approfondie en niveaux de gris.
   NOTE: Ceci placera la souris légèrement floue, qui fournit moyenne optique à travers la région d'intérêt (ROI) et la volontéaider à réduire les erreurs quantiques pour les très petites régions (c.-à-<10 pixels) d'intérêt. Grandes régions d'intérêt ne seront pas affectés par cette mineure réglage de la focalisation, ils ne seront pas affectées par les différences dans la taille de l'animal.
2. Anesthésier des animaux à l'aide de kétamine (100 mg / ml) / xylazine (20 mg / ml) (2: 1), cela fournit l'effet de l'anesthésie rapide et une récupération rapide et est optimal pour photographier plusieurs animaux.
   NOTE: L'anesthésie est confirmé lorsque l'animal est encore assez pour permettre la photographie. Comme les animaux récupèrent de cette lumière dans l'anesthésie 10-15 min, le vétérinaire n'a pas recommandé l'utilisation de pommades ophtalmiques.
3. Placer sur les animaux anesthésiés imageur gel en alignement vertical (aussi près que possible parallèle).
   1. Pour les photographies dorsales, placer les animaux en décubitus ventral avec des membres étendus.
   2. Pour les photographies ventrales, placer les animaux dans la position couchée, en prenant soin que les animaux ne sont pas pivoté latéralement.
   3. Placez norme niveaux de gris dans la région photographiée.
   4. Fermer la porte d'accès. Important: La lumière ambiante peut introduire des variations dans l'exposition.
   5. Réglez F-stop à une exposition qui place la région d'intérêt au sein de la gamme linéaire de l'acquisition (lecture F-stop).
      REMARQUE: La plupart des systèmes afficher où l'image est saturée.
   6. Prenez la photo.
   7. Changer F-stop à un autre réglage de l'exposition qui place la région d'intérêt au sein de la gamme linéaire en augmentant ou en diminuant le F-stop par une, de sorte que tant la norme et la région d'intérêt restent dans une plage linéaire d'acquisition (référence F arrêtez).
   8. Prenez la photo.
   9. Une fois que la photographie est terminé, placer les animaux sur une table de réchauffement et de suivre jusqu'à ce qu'ils puissent maintenir décubitus sternal. Retour animaux dans leurs cages. Remettre le groupe d'animaux le vivarium fois tous les animaux sont complètement rétablis.

   2. Quantification de l'absorption de lumière </ P>

   1. Marquer les régions d'intérêt sur les images des animaux avec le logiciel fourni pour le gel imageur.
      1. Pour toute vue dorsale de l'animal, utiliser une image rectangulaire ou ovale se étendant à partir des membres supérieurs aux membres inférieurs, se étendant latéralement autant que possible de telle sorte qu'aucune partie de la boîte se étend au-delà du dos de l'animal, comme illustré sur la figure 1A.
         NOTE: On peut aussi marquer la zone d'intérêt en utilisant un outil de dessin à main levée.
      2. Pour animal entier vue ventrale, utiliser deux rectangles: l'un couvrant la région pelvienne et une couvrant la région de la poitrine comme le montre la figure 1B.
      3. Pour une plus petite région d'intérêt, ce est à dire, l'emplacement de l'administration du médicament, marque le cas échéant.
   2. Mark région (s) d'intérêt sur la norme d'absorption en niveaux de gris.
   3. l'absorption d'enregistrement de chacune des régions marquées d'intérêt.

   3. Analyse

   les niveaux d'absorption obtained pour les régions d'intérêt peut avoir besoin d'être normalisée à la norme de référence pour la comparaison entre les photographies. La relation entre l'exposition à l'absorption est logarithmique (ce est à dire, la relation est linéaire entre log (exposition) et log (absorption)). En utilisant cette relation, l'absorption de la région d'intérêt peut être normalisée à une valeur de référence standard, ce qui permettra absorptions à être comparées directement entre les différentes photographies, y compris celles qui sont prises à des moments différents (par exemple, des mesures en série au sein d'un protocole de l'étude). La procédure pour effectuer ces corrections est détaillé dans des étapes facultatives 3.1 et 3.2.

   1. (Facultatif) courbe de Terrain de log (exposition) en fonction de log (absorption) en utilisant les valeurs obtenues à partir de la norme d'absorption en niveaux de gris.
   2. (Facultatif) Réglez les variations dans le niveau de chaque photographie comme suit:
      1. Sélectionnez F-stop pour la lecture (tel que déterminé dans l'étape 1.6) et F-stop pour référence (tel que déterminé à sTep 1,8).
      2. Calculer absorption moyenne de la norme dans toutes les photographies à la lecture F-stop. Cette moyenne est la Valeur de référence standard (RSV).
      3. Calculer différence d'absorption entre la lecture et de référence réglages F-stop dans chaque photographie pour la norme (delta-S) et pour chaque ROI définie (delta-ROI-1, delta-ROI-2 ... ..delta-ROI-X)
      4. Calculer l'absorption corrigé pour chaque ROI comme suit: absorption corrigé (ROI-X) = Absorption (ROI-X) pour lire les F-stop + (RSV - absorption de la norme à lecture F-stop) * (delta-ROI-X / delta-S)
   3. Compiler les données expérimentales et effectuer des analyses de données en utilisant des techniques statistiques standard pour les variables continues (c.-à-ANOVA, T-test).

Cette technique a été validée à l'aide souris C3H / HeJ greffées, le modèle murin de la pelade 16. Ces animaux développent la perte de cheveux mondiale qui progresse graduellement avec le temps. Cependant, la perte de cheveux survient chez des correctifs, et peut varier d'une souris pour la prochaine, en introduisant une variabilité considérable et entrave les évaluations qualitatives. Ce modèle a permis de tester les corrélations entre les mesures de la densité optique à différents endroits sur la souris comme une appréciation de validité.

La première question a été si des mesures utilise différentes expositions, les variations de ROI démarcation et ROI des zones non-chevauchement sur la même souris ont été corrélés. Il y avait une corrélation significative (p <0,0001) vu comparant ROI définie par les normes ovales rectangulaires par rapport à la surface dorsale de la souris (figure 4A). De même fortes corrélations ont été observées à différents sites sur l'animal et à diffélouer niveaux d'exposition (non représenté). Cela indique un degré élevé de précision dans ces mesures. Il y avait aussi une corrélation significative entre l'absorption au F-stop 2,0 contre 1,2 à la surface dorsale de l'arrière à l'aide ROI rectangulaires (p <0,0001, figure 4B). Une corrélation significative a été observée même lorsque l'on compare des mesures d'absorption entre la surface dorsale et ventrale de la même souris (p <0,0001, Figure 4C). Ces données fournissent des preuves que des mesures d'absorption prises de différents sites sur le même animal sont corrélées, comme prévu dans le C3H / HeJ greffé modèle de souris, et ces corrélations reste linéaire sur une large gamme de perte de cheveux. Ceci aide à établir la validité des mesures en niveaux de gris et établit également la robustesse de cette technique à des variations dans l'acquisition de l'image et de la technique d'analyse.

La deuxième question était de savoir si il ya une cohérence entre les mesures prises à partir de sériele même animal à différents points dans le temps. Pour l'évaluer, images ont été obtenues de C3H / HeJ greffé souris sur une base hebdomadaire pendant 3 semaines. On se attendrait Le C3H / HeJ souris greffées pour afficher la perte de cheveux progressive durant cette période. L'analyse des niveaux de gris sur la face ventrale (région de la poitrine, ROI en forme de boîte) a montré que cette perte de cheveux attendu, avec la tendance constante à la baisse d'un point de temps à l'autre (figure 5). Fait à noter, seulement 80% des souris greffées C3H / HeJ montrer la perte de cheveux, et ceux avec les plus hautes valeurs de gris ne montrent pas cette baisse, plutôt présentent des résultats cohérents dans la période expérimentale. Cette uniformité de la mesure chez les animaux sans perte des cheveux a été également vérifiée dans la souris C57BL / 6 19. La même analyse effectuée sur la région de la cuisse de la surface ventrale et sur la surface dorsale a montré des résultats similaires dans le temps (non représenté).

Avec ces résultats encourageants de l'application de cette technique dans C3H / HeJ greffé animaux,d'autres enquêtes ont été menées dans un modèle animal différent, de l'alopécie induite par la chimiothérapie. C57BL / 6 qui reçoivent trois cours hebdomadaires de cyclophosphamide sera variable développer l'amincissement des cheveux mondiale et la dépigmentation. La technique d'analyse en niveaux de gris décrit ici a été utilisé pour quantifier ces changements, et d'évaluer la réponse aux interventions thérapeutiques 17. Dans ce modèle, l'analyse en niveaux de gris se est avéré être un outil puissant pour fournir des évaluations quantitatives des changements induits par la chimiothérapie à poil, et autorisé la vérification des effets du traitement par l'analyse statistique. Dans un autre modèle de la chimiothérapie alopécie, il y avait des difficultés particulières dans l'utilisation de cette analyse en niveaux de gris. Dans ce modèle, les animaux sont cirés sur la surface dorsale de synchroniser les follicules pileux, puis traités avec une dose unique de cyclophosphamide 9 jours plus tard, lorsque les follicules pileux sont entrés phase anagène VI au maximum et sont sensibles aux médicaments chimiothérapeutiques 18. Le cirérégion est la région d'intérêt pour l'étude, mais la zone de l'épilation pourrait être de taille variable. Restreindre le retour sur investissement à moins de la région ciré permet la quantification de la perte à la fois et la repousse des cheveux après l'administration de cyclophosphamide 19. En outre, la technique permet une évaluation précise des différences de dose-dépendantes de la réponse au traitement d'une thérapie expérimentale. Cette application illustre les avantages d'avoir la souplesse dans la définition de la ROI dans cette technique.

Pour illustrer davantage l'application de cette technique, à condition sont une analyse provisoire des données d'une étude en cours dans C57BL / 6 en utilisant le protocole d'administration de cyclophosphamide hebdomadaire indiqué ci-dessus. Souris âgées de 8 semaines ont été traités de véhicule ou avec 50 mg / kg / semaine pendant 3 semaines cyclophosphamide. souris traités par chimiothérapie a montré la perte de cheveux visuellement apparente après deux mois, tandis que les animaux traités avec le véhicule avaient un pelage normal (figure 6A). L'analyse des niveaux de gris est parformé comme indiqué ci-dessus, montrant différence significative (p <0,05) entre les souris de chimiothérapie et des commandes du véhicule (figure 6B).

Figure 1: Vue brut des changements de cheveux sur la surface dorsale et ventrale du C3H / HeJ greffé souris, le modèle de la souris de l'alopécie areata Notez les animaux développent la perte de cheveux mondiale qui progresse peu à peu au fil du temps vue (A) dorsale, la démarcation représentant.. des régions d'intérêt (ROI) pour l'analyse en niveaux de gris, ovale ou rectangulaire comme indiqué. (B) Vue ventrale avec différentes régions d'intérêt pour l'analyse en niveaux de gris dans la poitrine, correspondant à une zone non damées, ou de la cuisse, ce qui correspond à une zone damée.

Figure 2:.. Niveau de Pixel sur l'analyse niveaux de gris plutôt la norme numérique de Tiffen le dossier de Une norme Tiffen a été photographié sur un imageur de gel à des F-étapes renseignées (A) Graphique de niveau de Pixel vs le nombre de Tiffen, montrant prévu relation logarithmique (B. ) la transformation logarithmique, dans cette gamme continue de suivre une relation non linéaire.

Figure 3:. Niveau de Pixel sur l'analyse niveaux de gris plutôt F-stop le dossier du Tiffen Une norme a été photographié sur un imageur de gel à des F-étapes renseignées. Tracées sont les variations du niveau de pixel vus depuis plusieurs normes de Tiffen différents vs F-stop. Notez que les lignes ne sont pas parallèles, indiquant que les corrections pour aligner les normes entre photographiquesphs doivent être calculés individuellement pour chaque région d'intérêt.

Figure 4:. Corrélation entre les différentes techniques et les régions d'intérêt photographiques dans l'analyse des niveaux de gris Montré existe des corrélations entre les techniques de mesure indiquées prises de la même C3H / HeJ greffée la souris au même point de temps (A) Corrélation de rectangle vs région ovale. intérêts sur la vue dorsale. (B) Corrélation de F arrêter 2,0 contre 1,2 en utilisant région rectangulaire d'intérêt. (C) Corrélation des valeurs de gris de dorsales et ventrales vues, région rectangulaire d'intérêt. Toutes les corrélations sont statistiquement significatives déterminées par analyse de régression linéaire (p <0,0001).

Figure 5: évolution temporelle de changement d'absorption en utilisant une analyse en niveaux de gris dans C3H / HeJ greffé souris Les couleurs indiquent les mesures en série de souris individuelles.. Remarque la cohérence pour chaque souris d'un point de temps à l'autre.

Figure 6:.. L'analyse des niveaux de gris dans l'alopécie induite par la chimiothérapie de 6 semaines vieilles souris C57BL6 / J ont été traités avec le véhicule (N = 6) ou trois doses hebdomadaires de cyclophosphamide (50 mg / kg) (N = 6) (A) groupe représentatif de 3 souris de chacun des groupes de traitement, photographié deux mois après le début de la chimiothérapie. (B) Les données compilées à partir de l'analyse en niveaux de gris de chaque groupe, montrant diminution de l'absorption de l'administration de cyclophosphamide (p <0,05). Remarque la corrélation entre les cheveux visiblesla perte dans le panneau A et des réductions statistiquement significatives de l'absorption dans la partie B.

Tableau 1:. Exemple de calcul pour corriger les différences d'exposition entre les photographies Le tableau montre un exemple de la façon de compenser les différences mineures dans l'absorption des normes entre les photos (étape optionnelle 3.2).

Les auteurs n’ont rien à divulguer.