Haut Débit Fluorometric Technique pour l'évaluation de phagocytose des macrophages et l'actine polymérisation

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour quantifier la phagocytose des particules fluorescentes par la lignée cellulaire de macrophages adhérents à l’aide d’une méthode fluorométrique. Cette méthode facilite une quantification à haut débit de l’internalisation des particules ainsi que la polymérisation de l’actine qui en résulte.

Résumé

Le but de l'analyse fluorométrique est de servir en tant que, rentable, à haut débit méthode efficace d'analyse de la phagocytose et d'autres processus cellulaires. Cette technique peut être utilisée sur une variété de types cellulaires, aussi bien adhérentes et non adhérentes, pour examiner diverses propriétés cellulaires. Lorsque l'on étudie la phagocytose, la technique fluorométrique utilise des types de cellules phagocytaires telles que les macrophages et les particules marquées par fluorescence opsonisées dont la fluorescence peut être éteint en présence de bleu trypan. Après plaquage des macrophages adhérentes dans des plaques à 96 puits, particules fluorescentes (vert ou rouge) sont administrés et les cellules sont autorisés à phagocyter pour des montants variés de temps. À la suite de l'internalisation des particules fluorescentes, les cellules sont lavées avec du bleu trypan, ce qui facilite l'extinction de signal fluorescent à partir de bactéries qui ne sont pas internalisées, ou sont simplement adhérant à la surface des cellules. Après le lavage de trypan, les cellules sont lavées avec du PBS, fixés, une colorées avec DAPI (label bleu fluorescent nucléaire), qui sert à étiqueter les noyaux des cellules. Par une quantification fluorométrique simples grâce à la lecture de la plaque de l'énergie nucléaire (bleu) ou de particules (/ vert rouge) fluorescence nous pouvons examiner le rapport des unités de fluorescence relative de vert: bleu et de déterminer un indice phagocytaire indicatif de quantité de bactéries fluorescentes intériorisées par cellule. La durée de l'essai en utilisant un procédé et multicanaux à 96 puits pour le lavage des pipettes, de la fin de la phagocytose à la fin de l'acquisition de données, est inférieur à 45 min. La cytométrie en flux peut être utilisé d'une manière similaire, mais l'avantage de la fluorométrie est son débit élevé, méthode rapide d'évaluation avec un minimum de manipulation d'échantillons et la quantification rapide de l'intensité de fluorescence par cellule. Des stratégies similaires peuvent être appliqués à des cellules non adhérentes, des bactéries vivantes, marqués polymérisation de l'actine, et essentiellement tout procédé utilisant la fluorescence. Par conséquent, fluorométrie est une méthode prometteuse pour son faible coût, haute throughpcapacités ut dans l'étude des processus cellulaires.

Introduction

La quantification de signal fluorescent a été largement utilisé dans une multitude de méthodes scientifiques allant de PCR, cytométrie en flux, la microscopie confocale, et l'analyse FRET à multiplexer ELISA. imagerie de fluorescence et la quantification a une application large et peut être un excellent outil pour l'analyse quantitative de divers processus cellulaires. L'utilisation de marqueurs fluorescents et leur signal a été révolutionné dans la dernière décennie, et l'émergence des lecteurs de plaques à fluorescence a facilité la quantification à haut débit de la fluorescence émise lors de processus cellulaires.

Analy....

Protocole

NOTE: Ce protocole peut être utilisé pour de multiples applications telles que la quantification de la phagocytose et l'actine polymérisation utilisé dans notre travail déjà publié ^12. Le protocole se prête à une grande variété de modification, et les types et les particules cellulaires Le tableau 1 énumère utilisé avec succès dans des études antérieures. Utilisation standard de ce protocole pour la quantification de la phagocytose ou actine polymérisation est illustré dans le schéma 1.

Résultats

Deux grands moyens de quantifier la phagocytose et la polymérisation de l'actine ultérieure grâce à l'utilisation de ce protocole est d'observer la phagocytose continu ou synchronisé.

L'analyse microscopique (figure 1B) illustre images fluorescentes comparables à ce que le fluoromètre enregistre (voir aussi le diagramme 1). Dans la figure 1B sont fluorescence rouge de l'actine, vert 268 fluorescence du FITC étiquettes HKOP E. coli, .......

Discussion

Les principales limites de la technique fluorométrique sont variance expérimentale ainsi que la perte de cellules associé à un lavage extensif et l'utilisation de cellules non adhérentes.

La variance est observée principalement en raison de la variation de particules fluorescentes que la pesée et pipetage lors de la préparation de la solution mère ne est pas une manière exacte de maintenir numéros identiques de particules d'une expérience à. Pour résoudre le problème de la variance e.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1 &mu ; m Fluo-Sphères fluorescentes jaune-vert ;	Sondes moléculaires	F8852	combine 50&mu ; l avec 50&mu ; l réactif d’opsonisation pendant 30 min à 37oC avant utilisation
Tué par la chaleur E. coli BioParticules conjuguées à la fluorescéine	Les sondes moléculaires	E2861	se reconstituent (5 mg) en 50 &mu ; l de PBS et combiner avec 50 &mu ; l réactif d’opsonisation pendant 30 min à 37 ° ; C avant utilisation
Réactif d’opsonisation	Sondes moléculaires	E2870
Sondes moléculaires	rhodamine phalloïdine	R415
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Trypan blue	Gibco	15250-061
Les articles ci-dessous sont disponibles dans de nombreuses marques, mais les articles que nous avons utilisés dans cette étude proviennent des fabricants suivants :
Milieu de croissance cellulaire RPMI	Gibco		Supplémenté avec 10 % de FBS et 1 % de pennicilline/streptomycine ; chaud en 37 ° ; C avant utilisation
Lecteur de plaques fluorescentes - Fluostar Omega	BMG Labtech
Paraformaldéhyde (16 %)	Fischer Scientific	AA433689M	diluer à 4 % avant utilisation
Plaques 96 puits	Greiner	655097	clair ou noir ou fond transparent - plaques noires Pipette
multicanaux (8 - 12 canaux)
Réservoirs de réactifs
1x Tubes Microfuge PBS
(0,6 ml)
Conicles (10 ml)