Article de méthode

Haut Débit Fluorometric Technique pour l'évaluation de phagocytose des macrophages et l'actine polymérisation

DOI :

10.3791/52195

⸱

27 novembre 2014

 , 
1Department of Pharmacology, University of Minnesota, 2Department of Surgery, University of Minnesota, 33M Corporate Research Laboratory

Dans cet article

Résumé

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Nous présentons ici un protocole pour quantifier la phagocytose des particules fluorescentes par la lignée cellulaire de macrophages adhérents à l’aide d’une méthode fluorométrique. Cette méthode facilite une quantification à haut débit de l’internalisation des particules ainsi que la polymérisation de l’actine qui en résulte.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le but de l'analyse fluorométrique est de servir en tant que, rentable, à haut débit méthode efficace d'analyse de la phagocytose et d'autres processus cellulaires. Cette technique peut être utilisée sur une variété de types cellulaires, aussi bien adhérentes et non adhérentes, pour examiner diverses propriétés cellulaires. Lorsque l'on étudie la phagocytose, la technique fluorométrique utilise des types de cellules phagocytaires telles que les macrophages et les particules marquées par fluorescence opsonisées dont la fluorescence peut être éteint en présence de bleu trypan. Après plaquage des macrophages adhérentes dans des plaques à 96 puits, particules fluorescentes (vert ou rouge) sont administrés et les cellules sont autorisés à phagocyter pour des montants variés de temps. À la suite de l'internalisation des particules fluorescentes, les cellules sont lavées avec du bleu trypan, ce qui facilite l'extinction de signal fluorescent à partir de bactéries qui ne sont pas internalisées, ou sont simplement adhérant à la surface des cellules. Après le lavage de trypan, les cellules sont lavées avec du PBS, fixés, une colorées avec DAPI (label bleu fluorescent nucléaire), qui sert à étiqueter les noyaux des cellules. Par une quantification fluorométrique simples grâce à la lecture de la plaque de l'énergie nucléaire (bleu) ou de particules (/ vert rouge) fluorescence nous pouvons examiner le rapport des unités de fluorescence relative de vert: bleu et de déterminer un indice phagocytaire indicatif de quantité de bactéries fluorescentes intériorisées par cellule. La durée de l'essai en utilisant un procédé et multicanaux à 96 puits pour le lavage des pipettes, de la fin de la phagocytose à la fin de l'acquisition de données, est inférieur à 45 min. La cytométrie en flux peut être utilisé d'une manière similaire, mais l'avantage de la fluorométrie est son débit élevé, méthode rapide d'évaluation avec un minimum de manipulation d'échantillons et la quantification rapide de l'intensité de fluorescence par cellule. Des stratégies similaires peuvent être appliqués à des cellules non adhérentes, des bactéries vivantes, marqués polymérisation de l'actine, et essentiellement tout procédé utilisant la fluorescence. Par conséquent, fluorométrie est une méthode prometteuse pour son faible coût, haute throughpcapacités ut dans l'étude des processus cellulaires.

Introduction

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La quantification de signal fluorescent a été largement utilisé dans une multitude de méthodes scientifiques allant de PCR, cytométrie en flux, la microscopie confocale, et l'analyse FRET à multiplexer ELISA. imagerie de fluorescence et la quantification a une application large et peut être un excellent outil pour l'analyse quantitative de divers processus cellulaires. L'utilisation de marqueurs fluorescents et leur signal a été révolutionné dans la dernière décennie, et l'émergence des lecteurs de plaques à fluorescence a facilité la quantification à haut débit de la fluorescence émise lors de processus cellulaires.

Analyse fluorométrique peut servir comme un excellent outil pour la quantification de la phagocytose. Phagocytose a été étudié depuis la découverte des phagocytes par Metchnikoff en 1800 1. Au fil des ans, une variété de méthodes ont été utilisées pour examiner cet important processus essentiel pour la défense immunitaire innée contre l'invasion bactérienne, virale, fongique et les agents pathogènes parasitaires 2-5. Les méthodes antérieures de quantification utilisé la microscopie et techniques stéréologiques afin de visualiser les cellules qui sont phagocytose, qui ont ensuite été quantifiés par comptage des particules internalisées (manuellement ou avec l'utilisation de logiciels) 6-8. Certains inconvénients à utiliser la microscopie seule pour l'analyse quantitative sont que le comptage manuel des bactéries est beaucoup de travail et plus enclins à biais de l'observateur. Une autre méthode utilisée dans la quantification de la phagocytose est la technique de placage microbiologique des bactéries à partir de lysats cellulaires (ci-après phagocytose) sur des plaques de culture bactérienne, mais cette méthode peut ne pas tenir compte des mécanismes bactéricides et la présence de bactéries internalisées partiellement. Cette méthode est encore plus de main-d'œuvre par rapport à la microscopie et prend plusieurs jours à analyser. Débit semble cytométrie être le moyen le plus rapide, le plus efficace pour quantifier la phagocytose et a été utilisé par de nombreux groupes de 9 à 11, mais le coût élevé généralement associé avec le auinstrument nécessaire pour l'analyse rend le procédé plus coûteux, par rapport aux tests mentionnés précédemment.

La méthode fluorométrique est une bonne alternative à la cytométrie en flux pour l'analyse de l'internalisation de particules, car il offre la quantification objective de l'équipement de fluorescence à l'aide qui ne est pas que le coût prohibitif. Autres avantages supplémentaires de fluorométrie sont à haute efficacité, et les capacités à haut débit permettant de quantifier la fluorescence émise par les particules internalisées étiquetés.

Avantages de fluorométrie peuvent être extrapolés à la quantification des processus autres que la phagocytose. Par exemple, l'analyse fluorométrique peut être appliqué à étudier tout processus conduisant à des changements dans l'expression des récepteurs intracellulaires ou membranaires, les changements dans la perméabilité cellulaire / viabilité, l'efficacité de transfection, et la modulation dans la polymérisation de l'actine. Un inconvénient de la technique fluorométrique est que, selon les étiquettes utilisées, il peut y avoir une forteune expérience à la variabilité qui peut habituellement être résolu en démontrant données par quantification relative, comme le changement de pli ou pour cent d'augmentation du contrôle.

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Protocole

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NOTE: Ce protocole peut être utilisé pour de multiples applications telles que la quantification de la phagocytose et l'actine polymérisation utilisé dans notre travail déjà publié 12. Le protocole se prête à une grande variété de modification, et les types et les particules cellulaires Le tableau 1 énumère utilisé avec succès dans des études antérieures. Utilisation standard de ce protocole pour la quantification de la phagocytose ou actine polymérisation est illustré dans le schéma 1.

figure-protocol-1

Schéma 1:. Schéma de dosage fluorométrique pour la quantification de la phagocytose et la polymérisation de l'actine Après que les cellules sont étalées, traitées et laissées à adhérer, les particules marquées avec la fluorescence verte (FITC) sont ajoutés aux cellules pour la phagocytose. La réaction est arrêtée par trypan ou Antibiotique lavage (pour éliminer les particules non intériorisé) et la fixation est réalisée avec 4% de paraformaldehyde. Les cellules sont ensuite colorées avec étiquette rouge fluorescent de l'actine (rhodamine phalloïdine) et marqueur fluorescent bleu (DAPI). Indices de la phagocytose et la polymérisation de l'actine sont quantifiés comme un rapport de unités de fluorescence relative de vert / bleu (FITC / DAPI), ou / bleu (rhodamine / DAPI) fluorescence rouge.

1. Placage et le traitement des cellules

REMARQUE: Avant de commencer, songez à exécuter les traitements avec au moins quatre répétitions techniques, et comprennent les commandes suivantes dans le plan de plaque: cellules seulement (sans tache, avec DAPI seul ou seule la rhodamine) et particules seulement.

  1. Mener toutes ajout de réactifs dans les étapes 1 à 4 dans une hotte de culture cellulaire stérile afin de protéger les échantillons de la contamination.
  2. macrophages des plaques (de lignée cellulaire J774 murine) dans une plaque à 96 puits à 1-5 x 10 4 cellules dans 50 ul (par puits) des médias complété préchauffé. Plaques Idéal pour cette méthode sont des plaques à 96 puits noires à fond transparent ou noir, selon les capacités de lecture.
    1. Pour des milieux complétés, utiliser 10% de FBS inactivé par la chaleur pour éviter toute interférence de cascade du complément, et 1% de pénicilline / streptomycine (si on ne utilise pour la phagocytose des bactéries vivantes). Si l'aide de cellules adhérentes permettent 1-2 heures pour l'adhésion, et pour les cellules non-adhérentes, centrifuger la plaque avec des cellules pendant 10 min à 500 x g.
  3. Ajouter agonistes / antagonistes désirés ou le contrôle du véhicule à une concentration 2x (remises en suspension dans du PBS ou de préférence, dans un milieu supplémenté) dans 50 ul pour un volume final de 100 ul (1 x) et incuber pendant une durée désirée. Pipette multicanaux et réservoirs pour réactifs seront faciliter le traitement rapide.

2. L'opsonisation des particules fluorescentes

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Types cellulaires testés et les particules fluorescentes dans l'analyse fluorimétrique de la phagocytose et la polymérisation de l'actine Le tableau 1 illustre des combinaisons de types de cellules (lignées cellulaires et des cellules primaires) que notre groupe a utilisé par la méthode fluorométrique: Tableau 1.. En dehors de la recherche à la phagocytose et la polymérisation de l'actine de cellules de type sauvage, nous avons également utilisé une partie de ces particules à l'examen de la phagocytose par les cellules transfectées exprimant une GFP (protéine fluorescente verte). La fluorescence des cellules transfectées avec des plasmides contenant reporters fluorescents peut également être utilisé en tant que marqueur cellulaire en plus de DAPI légende du tableau:. A - polymérisation de l'actine; P - la phagocytose; PT - la phagocytose par les cellules transfectées GFP étiqueté; OPDex - opsonisé cordon dextran; HKOP - tués par la chaleur opsonisé.

  1. Veiller à ce que les particules et les marqueurs fluorescents sont protégés de la lumière en tout temps, during traitement, le lavage, ainsi que pendant l'incubation afin d'éviter photoblanchiment
    1. Pour les particules sèches, peser opsonisées (HKOP) bactéries de chaleur fluorescente tués (E2861: E. coli K-12 souche), en utilisant les spécifications du fabricant. Prenez soin de se assurer que les comptes de masse pour les 10: 1-20: 1 bactéries: ratio de cellule (ou au moins un ratio de 10: 1 - couramment utilisé dans la quantification de la phagocytose) 13,14. Nombre de particules peut être fournie par le fabricant ou déterminée par couting dilutions en série de 1 mg / ml de solution de stock.
    2. Remettre en suspension dans 50 pi de PBS et le vortex pendant 1 minute à réglage le plus élevé. Assurer vortex bon (ici et dans le protocole) que les particules ont tendance à se agréger ce qui peut affecter l'efficacité du opsonisation.
    3. Pour les particules en suspension telles perles de dextrane comme marquées par fluorescence (perles DEX), vortex la solution mère pendant 1 min, prendre 50 pi de suspension ou en fonction de la concentration de billes dans le volume déterminer montage de perles pour faciliter 10: 1 rapport bille: cellule.
  2. Ajouter un volume égal de réactif de l'opsonisation de particules et vortexer vigoureusement pendant une minute.
  3. Incuber opsonisation des particules avec le réactif à 37 ° C pendant 1 heure.
  4. Après l'incubation, centrifuger les particules pendant 5 min à 500 g, et retirez le supernant réactif contenant opsonisante excès. Laver les particules par addition de 100 ul de PBS, vortex pour remettre en suspension le culot, et centrifugée pendant 5 minutes à 500 x g.
    1. Répétez ces étapes deux fois pour assurer opsonisation et l'élimination des anticorps non lié bon.
  5. Préparer la solution de travail de particules opsonisées en les remettant en suspension dans 5 ml de milieu (suffisant pour une plaque de 96 puits) et à ranger de la lumière jusqu'à l'addition aux cellules.

3. La phagocytose

  1. Placer la solution de travail de particules dans un réservoir de réactif stérile. De là, ajouter 5056; l de particules opsonisées aux cellules préparée à l'étape 1 (pour une concentration finale de 50 ng / ml) et de permettre la phagocytose de se produire dans des conditions de culture cellulaire standard. Illustrés ci-dessous sont deux méthodes de phagocytose qui peuvent être évalués en utilisant cette méthode (schéma 2).

figure-protocol-2
Schéma 2:. Comparaison des continu ou synchroniser phagocytose phagocytose continu indique internalisation continu de particules dans le temps comme ils atteignent lentement les cellules sur le fond du puits. Une étape de synchronisation contrastées (de centrifugation) force les particules à se enfoncer vers le bas, améliorant le contact des particules avec la cellule, et conduit à l'internalisation par les cellules immédiat. Phagocytose synchronisée est un processus rapide qui intériorise plus rapidement partieicles dues à l'augmentation de la cellule: le contact de particules.

    1. Pour la méthode de la phagocytose continu (schéma 2) qui permettent aux cellules à phagocyter continu bactéries opsonisées comme elles se enfoncent lentement vers le bas et viennent en contact avec les cellules, utilisent des délais plus longs pour permettre aux bactéries d'atteindre le fond du puits et d'obtenir en toucher avec les cellules. Si la réalisation d'une expérience timecourse, ajouter des bactéries à différents intervalles de temps et d'arrêter la totalité de la plaque de réactions à la fois d'améliorer la vitesse de traitement.
    2. Pour la méthode synchronisée de phagocytose (schéma 2) qui améliore particules: contact cellulaire par centrifugation, centrifuger la plaque entière contenant des cellules et des particules (5 min à 500 g) dès que les particules sont ajoutés, pour faciliter la synchronisation de tous les points de temps et d'accélérer la particule: l'interaction cellulaire.
      1. Mesurer le cours du temps à partir juste après l'achèvement de la centriétape de fugation. Si la réalisation d'une expérience de cours de temps, arrêtez chaque point dans le temps indépendamment à différents intervalles de temps, comme décrit ci-dessous.

REMARQUE: La méthode de la phagocytose synchronisée est un peu plus laborieux de la précédente, mais fournit indice phagocytaire élevée dans un temps plus court.

4. Arrêt phagocytose

  1. Pour les cellules adhérentes, éliminer le surnageant et ajouter 50 ul de bleu trypan dilué avec PBS (dilution 1: 2), afin d'éteindre la fluorescence des bactéries non-intériorisé.
  2. Pour les cellules non-adhérentes, tourner sur la plaque et retirez surnageant. Ajouter 50 ul de bleu trypan dilué. Assurez-vous de centrifuger la plaque au (5-10 min à 500 g) entre chaque lavage afin de minimiser la perte de cellules et permettre un lavage adéquat.
  3. Après incubation trypan, laver les cellules deux fois avec du PBS pour éliminer toute trypan résiduelle (jusqu'à ce que le PBS retiré du puits se avère clair). Trypan a été montré pour étancher 15,16 fluorescence de particules bactériennes tuées à la chaleur non internalisés marqué par fluorescence, mais pas pour les bactéries vivantes ou des billes OPDex. Pour des bactéries vivantes, y compris un lavage avec des antibiotiques tels que la pénicilline, la streptomycine, la gentamicine ou le lavage au lieu de trypan pour éviter les effets de confusion de fluorescence à partir de particules non-internalisé.
  4. Fixer les cellules avec 100 pi de paraformaldehyde à 4%, et incuber pendant 15 min à température ambiante, puis laver avec du PBS (à 100 pi par puits pour chaque lavage). À cette étape, enregistrer les cellules à 4 ° C pendant jusqu'à une semaine, ou passer directement aux taches et à la quantification.
    NOTE: Toutes les étapes ultérieures forment ce point préface peut être fait à l'extérieur de la hotte de culture cellulaire.
  5. Retirer tout le liquide et ajouter 50 ul de DAPI à 5 ng / ml reconstituées dans du PBS. Autoriser 5 min pour la coloration, puis laver deux fois avec PBS. Après l'étape de lavage, ajouter 50 pi de PBS à chaque phagocytose bien et enregistrement.

    6. 5. Actin Staining

    NOTE: En plus de la phagocytose, la méthode fluorométrique permettra la quantification de polymérisation de l'actine par l'intensité de l'actine, qui est réduite au cours de l'inhibition de lamellipodes, pseudopodiae de mesure, et la membrane de fronçage à la suite d'un traitement avec un inhibiteur (figure 1A). Ce est une étape facultative Si vous êtes intéressé dans la quantification de polymérisation de l'actine en plus à la phagocytose. Si polymérisation de l'actine est le but final, en utilisant des particules fluorescentes pour la phagocytose est facultative.

    1. Après la fixation de paraformaldéhyde (étape 4.3), laver la plaque deux fois avec PBS à 100 pi par puits pour chaque lavage. Ajouter 50 ul de 0,1% de Triton X-100 dans du PBS pendant perméabilisation et incuber pendant -5 min à température ambiante.
    2. Laver 0,1% de Triton X-100 2 fois avec du PBS (voir plus haut), et bloquer avec 1% d'albumine de sérum bovin (BSA) pendant 20 minutes pour éviter la liaison non spécifique de l'Elbel.
    3. Après blocage, retirez la solution BSA et ajouter immédiatement rhodamine phalloïdine. Pour préparer la solution de travail de la rhodamine tache, utiliser 100 pi de solution méthanoïque (fourni par le fabricant) dans 5 ml de PBS (suffisant pour une plaque). De la solution de travail ajouter 50 ul par puits et incuber pendant 20 min à température ambiante.
      NOTE: Après les étapes de lavage et coloration DAPI comme dans l'étape 4.4 cellules sera prêt pour la quantification.

    6. Quantification

    1. Pour quantifier la phagocytose utilisant un lecteur de plaque fluorescente, fiche fluorescence verte en utilisant un filtre d'excitation à λ = 488 nm et un filtre d'émission à fluorescence λ = 518 nm, et bleu en utilisant un filtre d'excitation à λ = 355 nm et un filtre d'émission à λ = 460 nm.
    2. Pour quantifier la polymérisation de l'actine en utilisant un lecteur de plaque fluorescente, fluorescence bleue enregistrement via λ = 355 nm et λ = 460 nm (comme ci-dessus), et rouge grippeorescence via le filtre d'excitation à λ = 584 nm et un filtre d'émission λ = 620 nm.
      REMARQUE: Orbital ou la détection centrale est acceptable pour l'enregistrement. Certains types de cellules se rassemblent plus au bord du puits que le centre, dans ce cas, l'enregistrement orbital peut être avantageux. En particulier, la moyenne de trois points autour de l'orbite peut aussi être utilisée pour obtenir des résultats plus précis.
    3. Divisez la RFU total de fluorescence verte ou rouge par fluorescence lecture bleu (de DAPI), en fonction de l'étiquette de particules ou phagocytaire vs actine quantification (schéma 1). Grâce à une forte variance plaque à la plaque, utiliser les index relatifs (tels que par rapport à t = 0 commande), pour illustrer mieux les tendances observées et de faciliter l'analyse statistique plus fiable.

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Résultats

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Deux grands moyens de quantifier la phagocytose et la polymérisation de l'actine ultérieure grâce à l'utilisation de ce protocole est d'observer la phagocytose continu ou synchronisé.

L'analyse microscopique (figure 1B) illustre images fluorescentes comparables à ce que le fluoromètre enregistre (voir aussi le diagramme 1). Dans la figure 1B sont fluorescence rouge de l'actine, vert 268 fluorescence du FITC étiquettes HKOP E. coli, ...

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Discussion

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Les principales limites de la technique fluorométrique sont variance expérimentale ainsi que la perte de cellules associé à un lavage extensif et l'utilisation de cellules non adhérentes.

La variance est observée principalement en raison de la variation de particules fluorescentes que la pesée et pipetage lors de la préparation de la solution mère ne est pas une manière exacte de maintenir numéros identiques de particules d'une expérience à. Pour résoudre le problème de la variance e...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs tiennent à remercier les sources de financement suivantes : RO1 DA 12104, RO1 DA 022935, RO1 DA031202, K05DA033881, P50 DA 011806, 1R01DA034582 (à S.R) et F31 DA026264-01A1, T32 DA07097 (à J.N.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1 &mu ; m Fluo-Sphères fluorescentes jaune-vert ;Sondes moléculairesF8852combine 50&mu ; l avec 50&mu ; l réactif d’opsonisation pendant 30 min à 37oC avant utilisation
Tué par la chaleur E. coli BioParticules conjuguées à la fluorescéineLes sondes moléculairesE2861se reconstituent (5 mg) en 50 &mu ; l de PBS et combiner avec 50 &mu ; l réactif d’opsonisation pendant 30 min à 37 ° ; C avant utilisation
Réactif d’opsonisationSondes moléculairesE2870
Sondes moléculairesrhodamine phalloïdineR415
DAPISigma-AldrichD9542
Trypan blueGibco15250-061
Les articles ci-dessous sont disponibles dans de nombreuses marques, mais les articles que nous avons utilisés dans cette étude proviennent des fabricants suivants :
Milieu de croissance cellulaire RPMIGibcoSupplémenté avec 10 % de FBS et 1 % de pennicilline/streptomycine ; chaud en 37 ° ; C avant utilisation
Lecteur de plaques fluorescentes - Fluostar OmegaBMG Labtech
Paraformaldéhyde (16 %)Fischer ScientificAA433689Mdiluer à 4 % avant utilisation
Plaques 96 puitsGreiner655097clair ou noir ou fond transparent - plaques noires Pipette
multicanaux (8 - 12 canaux)
Réservoirs de réactifs
1x Tubes Microfuge PBS
(0,6 ml)
Conicles (10 ml)
de

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

Particules fluorescentesbleu trypancytom trie en fluxlecteur de plaquesmarquage au DAPITriton X 100

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