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Une procédure pour l'implantation d'une chambre pour la colonne vertébrale longitudinale In Vivo Imagerie du cordon spinal de souris

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DOI :

10.3791/52196

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3 décembre 2014

 , 
1Department of Neurobiology and Behavior, Cornell University, 2Department of Biomedical Engineering, Cornell University

Dans cet article

Résumé

Dans cette vidéo, nous décrivons une procédure pour l'implantation d'une chambre d'imagerie optique chronique sur la moelle épinière dorsale d'une souris vivante. La chambre, la procédure chirurgicale, et l'imagerie chronique sont examinées et démontrées.

Résumé

Des études dans le néocortex des mammifères ont permis une résolution sans précédent de la structure corticale, de l’activité et de la réponse aux agressions neurodégénératives par imagerie in vivo répétée et en accéléré chez des rongeurs vivants. Ces études ont été rendues possibles par des procédures chirurgicales simples, qui ont permis un accès optique pendant une période prolongée sans procédures chirurgicales répétées. En revanche, des études analogues de la moelle épinière se limitaient auparavant à quelques séances d’imagerie, chacune nécessitant une chirurgie invasive. Comme décrit précédemment, nous avons développé une chambre vertébrale qui permet un accès optique continu pendant plus de 8 semaines, préserve la stabilité mécanique de la colonne vertébrale, est facilement stabilisée à l’extérieur pendant l’imagerie et ne nécessite qu’une seule intervention chirurgicale. Ici, la conception de la chambre vertébrale avec ses outils chirurgicaux associés est examinée et la procédure chirurgicale est démontrée en détail. En bref, cette vidéo démontrera la préparation de la zone chirurgicale et de la souris pour la chirurgie, l’exposition de la vertèbre vertébrale et le débridement tissulaire approprié, l’administration de l’implant et le clampage vertébral, l’achèvement de la chambre, le retrait du système d’administration, le scellement de la peau et, enfin, les soins postopératoires. La procédure d’imagerie chronique in vivo à l’aide de la microscopie non linéaire sera également démontrée. Enfin, les résultats, les limites, la variabilité typique et un guide de dépannage sont abordés.

Introduction

Time-lapse en microscopie in vivo dans les organismes intacts permet la visualisation directe des processus biologiques complexes qui sont inaccessibles à l'analyse traditionnelle en un seul point à temps, comme l'immunohistochimie. Plus précisément, la microscopie multi-photons (MPM) permet une imagerie de diffusion dans les tissus, tels que le néocortex de rongeurs, où l'imagerie à 2,3 et supérieur à 4 mm 1 a été atteint. Lorsqu'il est combiné avec des préparations chirurgicales 5-7 dans lequel une procédure unique permet un accès optique au cerveau pendant des semaines ou des mois, ces approches de microscopie ont été utilisées pour étudier les processus dynamiques dans le cerveau dans les états sains et malades 8-11. En outre, des protocoles ont été élaborés qui prévoient 12,13 imagerie in vivo chez les animaux éveillés (ce est à dire, non anesthésiés), ce qui permet pour l'imagerie fonctionnelle cellulaire-résolution pendant tests comportementaux. Ces protocoles ont été utilisés pour Comparisons de l'activité neuronale corrélée 14, astrocyte signalisation calcique 15 chez des animaux anesthésiés et éveillés, l'identification des tâches spécifiques grappes neuronales 16, et la capacité des neurones à discriminer emplacement de l'objet lors de la stimulation des moustaches 17.

Compte tenu du potentiel de cette approche pour élucider les mécanismes sains et pathologiques, time-lapse imagerie in vivo a été appliquée à la moelle épinière de souris (SC), permettant l'identification de la dégénérescence axonale aiguë (AAD) en tant que mécanisme de la maladie 18. Des études ultérieures effets des lésions périphériques sur les ganglions rachidiens (DRG) axone de régénération 19, le rôle des vaisseaux sanguins dans la régénération des axones 20, la chimiotaxie des cellules gliales en réponse à une lésion 21, la migration des cellules T dans l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) 22, l'activité d'une enquête de la microglie et les astrocytes 23,24 25 en réponse à amyotrophla sclérose latérale ic (SLA), le rôle de STAT-3 dans bourgeonnement axonal après une blessure SC (SCI) 26, et un mécanisme de perte axonale et la récupération dans l'EAE 27. Malgré le succès de ces approches, toutes ces études ont été limités soit à une seule session d'imagerie, ce qui limite les études à la dynamique à court terme, ou bien nécessaire répétée ouvertures chirurgicales de l'animal à chaque point de temps de l'imagerie, de limiter le nombre de points accessibles de temps et l'augmentation de la probabilité d'artefacts expérimentaux de confusion. Les protocoles de ces chirurgies ont déjà été publiés 28,29.

Récemment, nous avons publié une technique 30 pour l'implantation d'une chambre chronique moelle qui a permis time-lapse MPM imagerie dans la SC de la souris sur plusieurs semaines sans la nécessité pour les chirurgies répétées. En bref, cette préparation chirurgicale inclus effectuer laminectomie dans la colonne thoracique inférieure et l'implantation d'une chambre en quatre parties. La chambre inclustrois pièces en acier inoxydable sur mesure usinés serrées les vertèbres entourant la laminectomie et une lamelle de verre placée sur le SC et sécurisé avec un élastomère de silicone. Cette technique a permis pour l'imagerie de routine auprès de plus de cinq semaines après l'opération dans les Etats en bonne santé et de blessés, sans la nécessité pour les chirurgies répétées. Le nombre de points dans le temps de formation d'image est limitée uniquement par la fréquence à laquelle l'animal peut tolérer induction de l'anesthésie. Imagerie durée de vie est limitée par la croissance d'un tissu fibreux dense sur la surface de la SC. En outre, nous avons vérifié que l'implant chirurgical ne avait aucun effet à long terme sur la fonction motrice.

Depuis notre publication initiale, des approches alternatives permettant également l'imagerie à long terme dans la SC ont été décrits ailleurs 31-33. Ce protocole démontre notre procédure pour implanter la chambre moelle nous avons développé.

Protocole

NOTE: Le soin et la manipulation expérimentale de toutes les souris dans le présent document a été approuvé par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université Cornell.

1. Mise en place pour la chirurgie

  1. Stériliser tous les outils nécessaires en utilisant un autoclave ou procédures de stérilisation approuvés. Au minimum, inclure un scalpel, ciseaux, ciseaux Vanna, pinces, tournevis de bijoutier, des cotons-tiges, un ensemble de rétracteurs, l'implant (figure 1A) et de son système de livraison (figure 1D, E).
  2. Essuyez toutes les surfaces, y compris les boutons de stéréoscope, avec 70% d'éthanol et / ou des désinfectants appropriés.
  3. Créer un champ stérile en superposant la stereotax personnalisé (figure 1D) et entourant paillasse avec des draps stériles. Coussin chauffant (de préférence de contre-réaction contrôlée) doit être placé sur le dessus de la stereotax et dans les champs stériles.

2. Préparationde la souris pour la chirurgie

  1. Anesthésier une souris de moins de 5% d'isoflurane / oxygène dans une chambre d'induction jusqu'à ce que le rythme respiratoire ralentit à environ 1 respiration / sec.
  2. Transfert souris pour une zone de transit hors du champ stérile, en utilisant un cône de nez de continuer l'exposition isoflurane. Réduire l'isoflurane à 2%. Appliquer un collyre pour prévenir le dessèchement de la cornée.
  3. Administrer le glycopyrrolate (un médicament anticholinergique) à 0,05 mg / 100 g souris par voie intramusculaire dans les pattes arrière à l'aide de 29 à 30 G 3/10 cc aiguilles et seringues, délivrant environ 50% du volume d'injection par branche.
    REMARQUE: Glycopyrrolate sert à empêcher l'accumulation de liquide dans les poumons alors que la souris est sous anesthésie.
  4. L'aide de tondeuses électriques, de se raser une partie de la face dorsale de la souris, environ 3 cm de long sur 2 cm de large et centrée sur l'arc thoracique. Nettoyez toute couper les cheveux à l'écart de la zone rasée.
  5. Administrer les injections suivantes voie sous-cutanée et distale à l'raséepatch à l'aide de 29 à 30 g d'aiguilles et 10.3 seringues cc: 1 ml / 100 g souris glucose à 5% dans une solution saline (pour l'hydratation), 5 mg / kétoprofène kg souris (un AINS pour l'analgésie), 0,2 mg / dexaméthasone kg souris ( un stéroïde anti-inflammatoire pour réduire l'inflammation).
  6. En utilisant des cotons-tiges, effectuez trois lavages alternés d'iode et de 70% d'éthanol, en attendant 1 min entre les lavages.
  7. Administrer 100 pi de bupivacaïne 0,125% (un bloc de nerf périphérique) en utilisant voie sous-cutanée 29 à 30 g d'aiguilles et 3/10 cc seringue au centre du patch rasé pour réduire la douleur au site d'incision.
  8. Transfert souris pour l'stereotax personnalisé (figure 1D), insérer thermomètre rectal, et attendre environ 10 minutes pour bupivicaïne prenne effet.

3. Exposer et nettoyer la Dorsale strates de 3 Adjacent Vertèbre thoracique

  1. Utilisation de la lame de scalpel, créer un petit (5 mm ou moins) incision au-dessus des vertèbres d'intérêt (figure 2A).
  2. En utilisant soit une pince ou en insérant la pointe de ciseaux chirurgicaux et diffuser les poignées, augmenter la taille de l'ouverture dans la peau par dissection.
  3. L'utilisation d'un scalpel ou des ciseaux chirurgicaux, dissocier doucement fascia conjonctif entre la peau et le muscle sous-jacent.
  4. Utilisez rétracteurs de retenir la peau, permettant un aussi grand espace de travail que possible (figure 2B). Prenez soin de ne pas augmenter la charge sur la poitrine et ainsi obstruer les voies respiratoires.
  5. En utilisant une paire de forceps, la poignée la plus rostrale vertèbre qui sera exposé à travers le muscle sus-jacente. Avec un scalpel, couper le tissu loin de chaque côté du processus de dorsale de toute 3 vertèbres (figure 2c).
  6. En utilisant ne importe quelle combinaison d'une lame de scalpel, des cotons-tiges, et / ou un grattoir d'os, retirez tous les tissus recouvrant de la dorsale lames (Figure 2D).
  7. Avec des ciseaux chirurgicaux, soigneusement couper les tendons attachés aux vertèbres sur les deux lateraL bords de la colonne vertébrale (figure 2E).
  8. Utilisation du scalpel, retirer doucement autant de tissu à partir des bords latéraux de la colonne vertébrale que possible afin de fournir une surface de serrage propre.
  9. Débrider délicatement les vertèbres d'un tissu mou restant en utilisant un grattoir osseuse et / ou un coton-tige. Coupez en utilisant ne importe quel tissu incongrue ailleurs ciseaux chirurgicaux (figure 2F).
    NOTE: Il est essentiel à la fois pour serrage et effectuer la laminectomie dorsale que les vertèbres sont proprement exposée. Un cauterizer peut être utile dans le contrôle de saignement ultérieur.
  10. Maj rétracteurs de retenir le tissu entourant la colonne vertébrale, en plus de la peau (figure 2F).
  11. Fixez les barres latérales implant pour les dents sur les postes de livraison et les charger dans des supports post-les (comme dans la figure 1E).
  12. Fixer le 3 vertèbres en utilisant les barres latérales, en appliquant juste assez de pression pour maintenir Securely (Figure 2G, H). Utilisez une pince pour aider à assurer un serrage au niveau de la 3 vertèbres. Notez que plusieurs tentatives peuvent être nécessaires. Veiller à ce que les barres latérales sont à la fois le niveau et parallèle avant d'effectuer la laminectomie.
  13. Nettoyer et sécher soigneusement la surface dorsale des vertèbres serrée en utilisant des cotons-tiges.

4. Effectuer une laminectomie Dorsale

  1. Insérez le bout des ciseaux Vannas dans l'espace péridural de la vertèbre serrée médial et serrer les poignées à la légère; si l'os est sec, il convient de se fissurer le long de la longueur de la feuille dorsale. Répétez cette procédure sur le côté opposé pour libérer la lame.
  2. Préhension doucement la lame lâche par le processus de dorsale avec une pince, retirez soigneusement tout tissu conjonctif aux extrémités rostrale et caudale de la lame et soulevez-le.
  3. Utilisation de 0,9% de solution saline et / ou artificielle liquide céphalo-rachidien (ACSF), se laver soigneusement éloigner toute overlyi de sangng de la moelle épinière. Utilisez des cotons-tiges pour absorber l'excès de liquide.
  4. Avec des ciseaux Vannas, couper avec précaution les bords latéraux de l'épine dorsale aux barres latérales de l'implant. Encore une fois, laver et contrôler les saignements en utilisant des cotons-tiges et de solution saline / ACSF.
  5. Dans le cas où une partie du périoste a détaché et recouvre la moelle épinière, retirez délicatement ce tissu en utilisant des cotons-tiges et / ou d'un 29 - aiguille 30 G. Prenez soin de ne pas blesser la moelle épinière dans cette partie de la procédure. Ne confondez pas le périoste lâche avec la dure-mère bien emballé.
  6. Avec précaution, sceller les bords exposés restants de l'os avec une ou les deux de l'acrylique dentaire et cyanoacrylate (Figure 2I). Faites attention de ne pas laisser les colles de circuler sur la moelle épinière exposée.

5. sceller la chambre

  1. Positionner la plaque supérieure avec soin afin que les quatre fentes se alignent avec les quatre trous sur les barres latérales et l'ouverture recouvre le spin exposéeal cordon (figure 1B et 2J).
  2. En utilisant le tournevis du joaillier, commencer attentivement la première vis, stabiliser l'arbre du tournevis avec une autre paire de pinces. Ne pas serrer la vis à ce stade, mais insérer de sorte que les premiers filets sont engagés. Répétez ce processus pour les trois autres vis.
    NOTE: Il est utile d'utiliser le titane ou autres pince non magnétisables pour aider à positionner les vis à ce stade.
  3. Avec tous les 4 vis en place, serrez chaque vis alternativement par le même montant en petits incréments jusqu'à vis sont fermement arrimés (Figure 2K). Notez qu'il ne est pas inhabituel pour la plaque supérieure de fléchir au cours de ce processus. Prenez soin de ne pas serrer les vis trop, que la tête de vis peut casser et pression à la baisse excessive de déloger la pince et / ou entraîner des blessures de la moelle épinière.
  4. Utilisation d'un élastomère de silicone pour remplir l'espace entre la moelle épinière et la fenêtre en verre. Parce qu'il bichene est pas de produire de l'acide acétique lors du durcissement, utiliser KwikSil marque élastomère et embouts mélangeurs. Appliquer une partie libérale de la silicone à la moelle épinière exposée. Prenez soin de se débarrasser de toute silicone contenant des bulles d'air de la pointe de mélange avant l'application de la moelle épinière.
  5. En travaillant rapidement, appuyez doucement à 5 mm # 0 lamelle dans l'encart dans la plaque supérieure. Appliquer suffisamment de pression pour serrer progressivement l'élastomère liquide pour entourer la moelle épinière, mais ne entraînera pas la compression de la moelle épinière (Figure 2L). Réglage de l'heure pour l'élastomère est d'environ 90 secondes, alors assurez-vous que la lamelle est appliquée rapidement.
  6. Dans le cas d'une étanchéité échoué, attendre jusqu'à ce que l'élastomère est fixé, retirez-le délicatement de l'implant avec une pince, et répéter 05.04 à 05.05.
  7. Couvrir les bords d'élastomère exsudée avec dentaire acrylique / cyanoacrylate et d'adhérer à l'os environnant, autant que possible pour empêcher l'élastomère de se déplacer sur la surface de la moelle épinière.
  8. Retirer écarteurs et tirez la peau autour de la bordure de l'implant. Utilisation de cyanoacrylate, d'adhérer à la peau des bords de l'implant (figure 2 M, N).
  9. Insérez # 0-80 - 1/4 "set vis dans les ailes de la plaque supérieure (figure 1C et 2 O).
  10. Utilisant l'acrylique dentaire, sceller les lacunes dans les fentes de vis de la plaque supérieure (Figure 2P).

6. Soins postopératoires

  1. Retirer l'animal de l'anesthésie et le lieu dans une grande cage propre. Se assurer que la cage est suffisamment grand pour que la chambre ne sera pas se accrocher sur tout (tel que le plongeur en forme de V pour une bouteille d'eau et / ou de la nourriture) au cours de la locomotion normale tout au long de la cage.
    NOTE: Une cage de rat norme est idéal.
  2. Placer la cage sur une surface chauffée tandis que l'animal se rétablit. Ne pas retourner la souris vers la compagnie d'autres animaux jusqu'à ce qu'il ait totalement récupéré.
  3. Vérifiez Beha animaleVior dans les 1-2 heures après l'opération pour des signes de douleur ou de détresse et de l'intégrité des implants.
    NOTE: Dans des conditions normales, l'animal doit être capable de déambuler avec des perturbations modestes à la circulation.
  4. Continuez à vérifier tous les animaux 8-12 h pour les 72 premières heures, mesurer le poids et le comportement de surveillance. Vérifiez que les animaux sont actifs et mobiles pendant la nuit. Nourriture humide sous la forme de terrain Chow mélangé avec de l'eau ou des gels nutritionnels, des pastilles de chow, et l'eau potable devrait être fournie au niveau du sol. Hydratation supplémentaire par des injections sous-cutanées ou intraperiotoneal devrait être fourni si nécessaire.
  5. Administrer 5 mg / kg souris kétoprofène et 0,2 mg / kg de dexaméthasone de la souris sous-cutanée à 24 et 48 points de temps h, après l'opération. En outre, 0,005 à 0,010 mg / 100 g souris doit être administré toutes les 8 h par injection sous-cutanée pendant 72 heures.

7. In Vivo Imaging

  1. Anesthésier une souris sous5% d'isoflurane / oxygène dans une chambre d'induction jusqu'à ce que le rythme respiratoire ralentit à environ 1 respiration / sec.
  2. Transfert souris pour l'stereotax personnalisé (figure 1D) avec retour contrôlé coussin chauffant et insérez thermomètre rectal. Réduire l'isoflurane à 2%.
  3. Administrer glycopyrrolate 0,05 mg / 100 g par voie intramusculaire de la souris dans les membres postérieurs en utilisant de 29 à 30 G 3/10 cc aiguilles et seringues, délivrant environ 50% du volume d'injection par branche.
  4. Administrer 1 ml / 100 g souris 5% de glucose (par voie sous-cutanée) hydratation dans une solution saline une fois par heure.
  5. Insérez les détenteurs de chambre filetées dans les supports post utilisés pour la chirurgie (figure 1F). Réglez la hauteur et tordre les messages sur les vis de réglage dans la plaque supérieure.
  6. Avec les deux supports fixés, élever les titulaires dans des supports post-les jusqu'à ce que la poitrine peut se dilater librement sur l'inspiration.
    REMARQUE: Tant le ferme attachement des titulaires et la libre expansion de la poitrine significantly réduire les artefacts de mouvement due à la respiration.
  7. Effectuer imagerie comme souhaité.
  8. Lorsque imagerie est terminée, les messages inférieurs, enlevez détenteurs de chambre, supprimer thermomètre rectal, et le lieu souris sur une surface chauffée pour récupérer. Ne pas retourner la souris vers la compagnie d'autres animaux jusqu'à ce qu'il ait totalement récupéré.

Résultats

En suivant la procédure ci-dessus, chaque étape de la chirurgie devrait imiter les résultats pour chaque étape de la chirurgie décrit dans la figure 2. Une attention particulière doit être prise lors de l'application de l'élastomère de silicone pour éliminer les bulles d'air sous le verre ou tout au moins se assurer qu'ils sont située à la périphérie de la zone d'intérêt (figure 2L). Pour un chirurgien expérimenté, les complications chirurgicales nécessitant une euthanasie soit pendant la chirurgie ou après la chirurgie dans le premier 24 heures se produisent dans environ 20% des opérations. Ces complications surviennent le plus souvent d'une hémorragie des tissus mous excessive ou incapacité à fixer solidement la chambre à la colonne vertébrale.

Dans les chambres implantés avec succès, la fenêtre reste généralement optiquement transparent pour plusieurs semaines (figure 3). Malgré les meilleurs efforts, une croissance néoplasique opaque, fibreuse forme souvent en quelques jours, entraînant obscuri partielleng de la fenêtre (figure 3C - F, noir pointillés). Structures fluorescentes sont difficiles à voir en utilisant la microscopie 2PEF dessous de ce tissu fibreux. Nous trouvons une distribution bimodale des résultats, avec environ 50% des fenêtres implantés avec succès en restant clair pour plus de cinq semaines après l'opération, et environ 50% de plus en brouillées dans les 1-3 semaines. Pour les fenêtres qui restent claires, la plupart des endroits dans l'expérience de la fenêtre de visionnement seulement un degré modeste de néovascularisation au dessus ou dans la dure-mère (Figure 3D - F, astérisques vert), ce qui ne empêche pas l'imagerie 2PEF. Notre étude antérieure a montré 30 une augmentation de la densité des microglies, mais pas des astrocytes sous la fenêtre et des vertèbres adjacentes, ce qui indique une légère inflammation analogue à celle observée dans la fenêtre crânienne 5 préparations.

Chez les souris transgéniques exprimant la protéine fluorescente jaune (YFP) dans un sous-ensemble de la racine dorsale Ganglia (DRG) neurones (ligne de YFPH; Jackson Labs), les axones se distinguent clairement des semaines post-opératoire (figure 4A et b) et aussi longtemps que quatre mois dans un animal (données non présentées). Les vaisseaux sanguins (Figure 4A et B) ont été rendues visibles par fluorescence rétro-orbitale par injection de dextrane marqué Texas Red dans le plasma sanguin. Microglie ont également été visualisées dans des souris exprimant la GFP dans un CX3CR1 souris knock-in (CX3CR1-GFP; Jackson Labs) ont franchi la ligne de YFPH (figure 4C). Contraste et la résolution détériorées légèrement au fil du temps (figure 4C) en raison de la formation d'une prolifération fibreuse décrit précédemment 30. Nous imagé régulièrement pendant 3 heures en une seule session sans mortalité et aussi souvent que toutes les 12 heures. Durée de session et la fréquence est limitée par la tolérance de l'animal pour l'induction anesthésique, concomitante avec les considérations éthiques qui accompagnent la douleur et la détresse des animaux de laboratoire.

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Figure 1. Une suite chirurgicale personnalisée facilite la livraison de la chambre lors de l'implantation et stabilise la chambre pendant les séances d'imagerie suivantes. Deux barres latérales et une plaque supérieure (A) sont assemblés (B) à l'aide de petites vis dans la chambre de la moelle (C). Une table d'opération avec des poteaux extensibles (D) permet pour la livraison et le serrage des barres latérales aux vertèbres utilisant des broches de maintien (E). Séances d'imagerie ultérieures utilisent à la place les messages taraudés à joindre à la chambre via les vis de réglage sur les ailes de l'implant (F). Groupe B de cette figure a été modifié depuis Farrar et al., Nature Methods, 2012 30 avec la permission de Nature Publishing Group.96 / 52196fig1large.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 2. Une laminectomie dorsale est effectuée et une chambre d'imagerie chronique est implanté pour fournir un accès optique à la moelle épinière. La procédure est décrite dans le montage. Tout d'abord, la peau (panneaux A, B, sections de protocole 3.1 à 3.4) et les muscles (C; 3,5) sont rétractée pour exposer les trois vertèbres sous-jacentes. Le tissu recouvrant ces trois vertèbres est enlevée (D, E, F; 03.06 à 03.10) et les processus propre latérales sont raclées avant d'être serrées sur les deux faces (G, H; 3,12). Avec précaution, la feuille dorsale de la vertèbre central est éliminé et les bords de l'os scellé (I (J; 5,1) et les vis fixé en position (K; 5,3) pour fixer la chambre avant de sceller la chambre d'élastomère de silicone et le verre de couverture (L; 5,5). Une fois que les broches sont retirées de livraison (M; 5,8), la peau est collée sur les côtés de la chambre (M, N; 5,8) et les vis de blocage sont insérés dans les ailes (S; 5,9). Enfin, les fentes de vis sont scellées avec de l'acrylique dentaire (P; 5,10). Et la souris est placé dans une cage propre pour récupérer Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 3. Une chambre moelle chronique demeure ov optiquement transparenter plusieurs semaines. Images lumière blanche de la moelle épinière, allant de quelques minutes (A) à trois semaines après l'opération (F). Repères vasculaires sont identifiables à tous les points de temps (flèches jaunes). Peu de changement est vu à une postopératoire de jour (B). Prolifération dense fibreuse (C - F, délimité par la ligne pointillée en bas à droite) est présent aussi tôt que trois jours et les résultats dans l'obscurcissement partielle de la zone d'imagerie. Néovascularisation légère (D, E, F, astérisques verts) est également présent, mais ne masque pas la vascularisation d'origine dans la lumière blanche ou imagerie 2PEF. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 4. Une chambre moelle chronique permet pour l'imagerie répétée multi-photons sans la nécessité pour les chirurgies répétées. imagerie répétée de souris transgéniques exprimant YFP dans un sous-ensemble d'axones DRG (vert) dans les funicules dorsales de la moelle cordon et le système vasculaire (rouge) étiquetée par une injection intravasculaire de colorant (A, B). L'activité de la microglie (mauve) peut également être suivi dans le temps en Thy1-YFP / CX3CR1-GFP souris transgéniques doubles (C). Alors que les axones et les microglies restent visibles, le contraste et la résolution baisse légèrement au fil du temps (C). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

La technique démontrée ici permet répétée, time-lapse, l'imagerie in vivo du SC dorsale de la souris sur de nombreuses semaines après l'opération, sans la nécessité d'interventions chirurgicales ultérieures. Cette procédure représente une amélioration substantielle par rapport aux études d'imagerie répétez-chirurgie ou par rapport aux approches histologiques portmortem, où l'information sur la dynamique cellulaire est perdue. Nous avons précédemment 30 démontré la valeur de cette technique pour étudier SCI pathologie in vivo.

L'étendue longitudinale maximale de formation d'image a été déterminée par la croissance d'un tissu fibreux dense sur la surface dorsale de la SC. Au fil du temps, cette croissance a entraîné la perte de contraste de l'image et de la résolution. Cette croissance a également été vu dans les préparations chirurgicales alternatives 31. Pour l'anecdote, nous avons observé que cette croissance peut être minimisé en lavant soigneusement la surface dorsale de SC pour éliminer les produits sanguins, l'étanchéité de la surface del'os de la coupe avec le cyanoacrylate, les bords de la chambre d'étanchéité et d'élastomère de silicone, et en minimisant l'espace interstitiel entre le SC dorsale et le verre de protection.

Récemment, une autre approche similaire à notre propre en utilisant une chambre de polycarbonate a été démontrée 32. L'utilisation de polycarbonate est avantageuse car elle est compatible avec les rayons X et les modalités d'imagerie acoustique, qui ne est pas le cas pour les pièces en acier inoxydable. Toutefois, avec la technologie maintenant omniprésent des imprimantes 3D, parties de chambre peuvent être fabriqués à partir d'une grande variété de matériaux pour répondre aux besoins spécifiques. Nous avons récemment imprimé toutes nos pièces dans un photopolymère claire.

Un inconvénient clé d'une chambre fermée est l'incapacité à administrer des doses répétées de médicaments ou de colorants exogènes appropriés pour SC imagerie 34. Cependant, en capitalisant sur la stabilité mécanique de notre système actuel, nous avons déjà utilisé notre chambre présente à succèsLy ancrer un cathéter intrathécale connecté à un port d'injection de implantation sous-cutanée, ce qui a permis pour la livraison de médicaments à de multiples points dans le temps même dans un système de chambre fermée (de travail non publié). En outre, en raison de la nature modulaire de la plaque supérieure, les futures versions de cette préparation comprennent une chambre refermable pour permettre l'application répétée de deux agents thérapeutiques et des marqueurs fluorescents. Il est également possible d'envisager plaques supérieures avec pochettes pour les électrodes d'enregistrement, inserts optiques, et les ports pour la livraison de drogue. Ces ajouts seraient probablement plus difficile à mettre en œuvre en utilisant le système plus minimaliste de Fenrich et al., 31. En conclusion, notre chambre offre une plate-forme de passerelle sur laquelle diverses expériences peuvent être fondées.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer, et n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Nous remercions le Dr Joseph R. Fetcho pour sa contribution tout au long du développement de la procédure. Nous tenons à souligner le soutien financier des National Institutes of Health des États-Unis (R01 EB002019 à CBS et DP OD006411 à Joseph R. Fetcho) et du Conseil national des sciences et de recherches du Canada (à M.J.F.) pour leur soutien financier.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Ciseaux VannasFine Science Tools15000-04
pinces, ciseaux, scalpel, etc.Outils de sciences finesmultiples  ;
kit d’enrouleur -fixateur magnétiqueFine Science Tools18200-02
kit d’enrouleur -enrouleur FineScience Tools18200-09d’autres écarteurs peuvent également être utilisés kit d’écarteur
-élastomèreFine Science Tools18200-07
couverture chauffante contrôlée par rétroactionCWE Inc.Modèle : TC-1000 Mouse  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; Réf. 08-13000
stéréotaxevoir Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplément (en ligne)
chambrevoir Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplément (en ligne)
supportsvoir Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplément (en ligne)
Colle cyanoacrylateLoctiteLoctite 495multiple fournisseurs
Teets Cold Cure Coral Powder (poudre acrylique dentaire)TeetsMfg. Pièce : 8101plusieurs fournisseurs
Teets Cold Cure Liquid (liquide acrylique dentaire)TeetsMfg. Part : 8501plusieurs fournisseurs
GlycopyrrolateMWI Veterinary SupplyMWI SKU : 29706 (Baxter 1001901602)
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG5767
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vertébrale de chambre vertébrale

Références

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