Basée sur l'image de cytométrie en flux Technique pour évaluer les changements de granulocytes Fonction In Vitro

Summary

Cette méthode démontre une technique d’évaluation de la fonction des granulocytes en mesurant simultanément la phagocytose des bactéries et l’explosion oxydative. La cytométrie en flux basée sur l’image a permis d’identifier trois sous-ensembles distincts de granulocytes activés qui différaient tous dans leur capacité fonctionnelle relative.

Abstract

Les granulocytes jouent un rôle clé dans la réponse immunitaire innée de l’organisme aux infections bactériennes et virales. Bien qu’il existe des méthodes pour mesurer la fonction des granulocytes, celles-ci sont généralement limitées en termes d’informations qu’elles peuvent fournir. Par exemple, la plupart des tests existants ne fournissent qu’un pourcentage du nombre de granulocytes activés après une incubation unique de durée fixe. Pour compliquer les choses, la plupart des tests se concentrent sur un seul aspect de la fonction en raison des limites de la technologie de détection. Ce rapport fait la démonstration d’une technique de mesure simultanée de la phagocytose des granulocytes des bactéries et de l’explosion oxydative. En mesurant ces deux fonctions en même temps, trois phénotypes uniques de granulocytes activés ont été identifiés : 1) Activation faible (phagocytose minimale, pas de sursaut oxydatif), 2) Activation modérée (phagocytose modérée, un certain éclat oxydatif, mais pas de co-localisation des deux événements fonctionnels), et 3) Activation élevée (phagocytose élevée, éclatement oxydatif élevé, co-localisation de la phagocytose et éclat oxydatif). Une quatrième population composée de granulocytes inactivés a également été identifiée. À l’aide d’incubations de 10, 20 et 40 minutes, l’effet de la durée d’incubation sur la redistribution des phénotypes de granulocytes activés a été évalué. Une quatrième incubation a été réalisée sur glace à titre de témoin. En utilisant des incubations temporelles en série, le test peut être en mesure de détecter comment un traitement affecte spatialement la fonction des granulocytes. Tous les échantillons ont été mesurés à l’aide d’un cytomètre en flux basé sur l’image équipé d’une option d’imagerie quantitative (QI), d’un échantillonneur automatique et de plusieurs lasers (488, 642 et 785 nm).

Introduction

Granulocytes représentent une composante du système immunitaire innée de l'organisme, qui fournit la première ligne de défense contre les antigènes envahisseurs. Les procédés antérieurs pour évaluer la fonction des granulocytes ont porté sur la capacité de phagocytose ou oxydatif en utilisant des procédés différents, ce qui rend difficile de déterminer collectivement comment les granulocytes ont changé ^4.1. Les progrès dans le domaine de la cytométrie de flux ont abouti à la production d'instruments capables de paillasse haute résolution, l'imagerie multi-couleur de cellules d'une manière à haut débit ^5. La capacité de combiner l'imagerie avec un débit traditionnelle représente cytométrie un progrès qui fournit la plate-forme technologique nécessaire pour innover au sein de flux existants cytométrie méthodes et extraire de nouvelles informations sur le système immunitaire.

Au cours des dix dernières années, notre laboratoire, entre autres, a été vivement mis l'accent sur l'effet de divers patte nutritionnelle et les traitements d'exerciceIA sur la fonction immunitaire innée ^6-9. La méthode illustrée dans ce manuscrit a des implications pratiques dans le domaine de l'immunologie clinique. Le présent procédé exploite la puissance de la cytométrie de flux à base d'images pour mesurer simultanément la phagocytose de particules bactériennes et oxydatif. En utilisant cette approche, on est capable de séparer les granulocytes activés en utilisant des variables fournies par la partie basée sur l'image de l'analyse. Ces sous-ensembles étaient identifiables uniquement après avoir évalué les images cellulaires sur les granulocytes individuels. De plus le temps d'incubation de dosage affecté la transition entre les trois sous-ensembles ¹⁰ d'activation. Ainsi, il est vraisemblable que l'utilisation de plusieurs temps d'incubation peut permettre à un procédé pour tester le changement en fonction des granulocytes suite à un traitement expérimental spécifique. Le but de ce manuscrit était de démontrer une méthode d'évaluation de la fonction de granulocytes en utilisant la cytométrie en flux à base d'images pour mesurer simultanément la phagocytose avec oxidative éclater.

Protocol

NOTE: Toutes les procédures de collecte de sang décrites dans cette méthode ont été menées conformément à la Déclaration d'Helsinki et approuvés par l'examen UNT carte institutionnelle (IRB) pour les sujets humains. Tous les sujets ont donné leur consentement écrit pour la collecte de sang, qui a été utilisé dans le présent procédé pour se assurer qu'elles étaient apparemment en bonne santé, de poids normal, et les maladies.

1. Réactif Source & Préparation

1. Utilisation CD66b-APC (clone # G10F5; DF = 1: 50) et CD45-APCeFluor780 (clone # 2D1, DF = 1: 50) pour cet essai.
   REMARQUE: Avant l'étude, les anticorps CD45 et CD66b ont été titrés pour déterminer la dilution optimale qui granulocytes clairement résolus (CD45 + / 66b) de + d'autres leucocytes (CD45 + / 66b-) ^11. Lors de l'addition de l'anticorps dilué pour la coloration de la dilution finale dans le tube était de 875.
2. Achetez et dégeler stocks S. aureus bioparticules marqué avec pHrodo colorant rouge. Suspendre à une concentration de 1 mg de particules biologiques par ml dans du PBS stérile. Bioparticules aliquotes diluées et de magasin congelés à -20 ° C jusqu'à leur utilisation dans le dosage.
3. Dissoudre dihydroethidium (DHE), qui est converti en bromure d'éthidium fluorescent en présence de radicaux libres de l'oxygène (par exemple, le burst oxydatif), dans du DMSO à une concentration finale de 10 g / ml.
4. Mélanger le N-éthylmaléimide (utilisée pour prévenir la phagocytose supplémentaire après la durée d'incubation de dosage spécifié) avec du PBS stérile dans une dilution de l'étape 2 de 200 mg / ml et 17,5 mg / ml, respectivement. Dans l'essai, en utilisant une concentration finale de 15 mM. Lors de la décongélation N-éthylmaléimide, utiliser un bloc C de chaleur de 37 °, que le N-éthylmaléimide ne reste pas en solution.
5. Après l'étape de fixation finale, utiliser 7AAD pour colorer l'ADN nucléaire. Avant l'addition, diluer stocks 7AAD 01h10 avec du PBS stérile.

2. Prélèvement d'échantillons de sang

1. Demandez sujets pour arriver à la suite d'un laboratoire O / N rapide (> 8 h) et abstentisur l'activité physique (> 12 h).
2. Après le nettoyage de la peau avec un tampon de préparation de l'alcool, insérer une aiguille de collecte de sang stérile dans un bras veine périphérique.
3. Prélever le sang dans des tubes sous vide qui sont commercialement remplis d'héparine de sodium.
4. Après la collecte, appliquer un pansement adhésif pour le bras du sujet.
5. Inversez tubes de sang de mélanger 10 fois et ensuite placer sur une bascule jusqu'à l'analyse.

3. La phagocytose Assay Technique

1. Bioparticules dégel S.aureus (RT), DHE (RT), et de N-éthylmaléimide (37 ° C).
2. Ajouter 20 L de bioparticules S.aureus 4 individuels 1,2 ml tubes tout en travaillant dans la hotte stérile.
3. Ajouter 40 l de DHE pour chaque tube contenant les particules biologiques.
4. Tapoter doucement les tubes sur la surface du banc pour recueillir les réactifs dans le fond du tube.
5. Ajouter 100 L de sang entier mélangé pour que chaque tube a été rempli de particules biologiques et DHE.
6. Essuyer le bord intérieur des tubes avec un coton-tige pour enlever toute trace de sang contaminer.
7. Mélanger le sang et réactifs avec une pipette électronique doté de mélanger le sang et réactifs pour les trois cycles après l'addition de sang.
8. Placez les tubes à essai dans un seau à glace et couvrir pour protéger de la lumière.
9. Incuber les tubes à essai à 10, 20 et 40 min. Commencer par le tube de 40 min pour se assurer que tous les tubes à essai terminent en même temps.
10. Thaw N-éthylmaléimide dans 37 ° C bain de perles.
11. Pipeter 15 L de N-éthylmaléimide (décrit ci-dessus en 1.4) dans chaque tube à essai, incuber pendant 30 min.
12. Pipet 10 L de CD66b-APC et 10 L de CD45-APCeFluor780 des anticorps dilué (décrites ci-dessus en 1.1), incuber pendant 60 min.
13. Pipet 750 L de solution de lyse WBC fixe / RBC dans chaque tube à essai, incuber pendant 60 min.
14. Centrifugeuse (10 min à 400 x g) des tubes à essai pour recueillir le culot cellulaire.
15. Vide aspirer la solution lyse WBC / fix RBC, laissant un fl résiduellevolume de fluide (100 L) au-dessus du culot cellulaire.
16. Pipeter 10 L de solution diluée de 7AAD (décrit ci-dessus en 1.5) et 50 L de PBS dans chaque tube à essai.
17. Ajouter une goutte de billes de calibration (~ 25 L) à chaque tube à essai, placer des bouchons sur les tubes à essai, des tubes à envelopper dans du papier, et le placer dans un réfrigérateur.
18. Chargez le tube de l'échantillon dans le flux à base d'images cytomètre et de recueillir un minimum de 3000 événements de granulocytes en utilisant des paramètres prédéfinis: passeur d'échantillons, bleu (488 nm; 60 mW), rouge (640 nm; 100 NW), SSC (785 nm; 8,5 mW) lasers (figure 1).

Figure 1. Méthode d'acquisition et gabarit. Les échantillons ont été acquis sur un flux à base d'images cytomètre (A). Lors de l'acquisition, tracés de points de Bright Champ Aspect Ratio vs CD66b-APC ont été générés aux granulocytes séparés de billes de calibration dopés USINlogiciel g INSPIRE v. 100.2.292.0 (B). Un minimum de 5000 granulocytes ont été acquis pour chaque échantillon en utilisant un passeur d'échantillons, bleu (488 nm; 60 mW), rouge (640 nm; 100 NW), SSC (785 nm; 8,5 mW) lasers. Se il vous plaît noter qu'un certain nombre d'histogrammes sont présents lors de l'acquisition de surveiller les paramètres de laser et d'autres aspects des données recueillir. Tous ces histogrammes sont facultatifs et seulement nécessaire si les procédures d'exploitation normalisées de laboratoire nécessite comme contrôle de la qualité. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Acquisition et analyse 4. échantillon

1. Utilisez l'assistant de compensation de logiciel automatisé du logiciel IDEAS d'appliquer une matrice de compensation à des fichiers d'images brutes (FRR) et de créer des fichiers de compenser imagées (CIF).
2. Charger des fichiers CAF individuels dans le logiciel des idées et générer les parcelles suivantes pour identifier les sous-ensembles de granulocytes:
Établir portes initiales pour identifier les cellules qui ont été considérés comme la mise au point en utilisant un histogramme de vives RMS de gradient de champ (figure 2A). Faire de cette détermination pour chaque échantillon de patient en utilisant le contrôle non stimulées comme norme de référence.
3. Utilisez intrigues secondaires à cellules singlet distinctes de débris et doublets utilisant une dot plot lumineux de rapport d'aspect de champ (rapport entre la hauteur de la cellule par rapport à la largeur) vs. lumineuse zone de champ (figure 2B). Faire de cette détermination pour chaque échantillon de patient en utilisant le contrôle non stimulées comme norme de référence.
4. Une fois une population de cellules propres avait été identifié, établir une dot plot de CD45 contre CD66b (figure 2C) pour identifier positivement granulocytes (CD45 + / 66b +). Créez un nuage de fille (figure 3) de l'intensité lumineuse de détail pour S. aureus (x de l'axe) vs. lumineuse intensité de détail pour oxydatif (DHE, axe y) pour identifier des sous-ensembles de granulocytes activés. Recueillir brimages de terrain ight dans le canal 1 et 9, bioparticules dans le canal 2, DHE à Channel 4, Channel 5 au 7AAD, CD66b dans le canal 11, et CD45 dans le canal 12.

Figure 2. Modèle d'analyse. Ce chiffre de la série d'emplacements qui ont été générés pour identifier des cellules qui ont été mis au point (A), des cellules individuelles (B), les granulocytes (C). Parcelles supplémentaires ont été utilisés pour identifier les trois sous-ensembles de granulocytes activés contre granulocytes inactifs. Toutes les analyses de fichiers d'images acquises a été achevée en utilisant un logiciel IDEAS v.6. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Results

Utilisation de la cytométrie de flux à base d'images nous a permis de séparer une population homogène de granulocytes activés en trois sous-ensembles d'activation différents (figure 3). Dans cette méthode, la manière la plus efficace pour résoudre les trois sous-ensembles d'activation est en traçant l'intensité lumineuse de détail pour la phagocytose (S. aureus) vs. oxydatif (DHE) (Figure 3; Figure 4). En outre, l'utilisation de l'assistant co-localisation dans les logiciels IDEAS permettra pour la quantification de la présence de la phagocytose simultanée et oxydatif, qui est un signe caractéristique de granulocytes hautement activés.

Figure 3. Identification des sous-ensembles de granulocytes activés. Après l'identification des granulocytes avec des marqueurs de surface cellulaire (CD45 + / 66b +), un terrain de fille a été généré avec des détails brillants intensité pour la phagocytose vs lumineuse intensité de détail pour oxydatif. En utilisant cette approche, part des inactifs (violet), faible activité (rouge, A), modérée actif (bleu, B) et (C, jaune) granulocytes élevés actif a été déterminée. Cette technique de déclenchement a également été utilisé pour évaluer l'effet du temps d'incubation de dosage de l'abondance relative des différents sous-ensembles de granulocytes activés. Le pourcentage le plus élevé des granulocytes "High-actif" était présente suite à la 40 minutes d'incubation. Toutes les analyses de fichiers d'images acquises a été achevée en utilisant un logiciel IDEAS v.6. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

En plus de démontrer la présence de trois sous-ensembles distincts de granulocytes activés, il a été démontré que le temps d'incubation dosage dépend de l'abondance relative de chaque sous-ensemble des granulocytes activés. Plus précisément, le 40 min incubation entraîné le plus grand pourcentage de granulocytes "High-actif". En incluant au moins trois durées d'incubation dosage, il peut être possible de déterminer la façon dont un traitement clinique donné modifie l'état d'activation des granulocytes temporel. Ce est la première méthode publiée en utilisant la cytométrie de flux à base d'images pour identifier les différents sous-ensembles de granulocytes activés en fonction de mesures simultanées de la phagocytose et la poussée oxydative.

Figure 4. Images représentatifs de marqueurs cellulaires. Une galerie d'image de cellules classées comme de haute activité (A), modérée active (B), et de faible activité (C) est présenté dans ce chiffre. Bioparticules S.aureus sont en CH03 , oxydatif est en Ch04, 7AAD pour le noyau est en CH05, la dispersion latérale est en CH06, CD66b est enCh11, et CD45 est en C12. En outre, une image de co-fusion localisée de la phagocytose (CH03) vs. oxydatif (Ch04) est affiché. Zones de jaune dans l'image de fusion indiquent que la phagocytose et oxydatif se produisent dans le même espace anatomique en même temps. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Le présent procédé représente un raffinement des méthodes existantes pour l'évaluation de la fonction des granulocytes en utilisant la cytométrie de flux ^1,3,4,12-14. Les étapes essentielles de ce dosage ont tendance à être liée à un bon mélange de l'échantillon de sang avec les particules biologiques et DHE. Un mélange incomplet entraînera des résultats inexacts. Bien que le mélange complet est critique, la méthode de mélange doit être doux dans la nature. Il est suggéré que le mélange est effectué en utilisant une pipette électronique avec une fonction de mélange plutôt que d'un mélangeur vortex. Une autre étape critique dans l'essai est de se assurer qu'il n'y a pas toujours de contaminer le sang moitié supérieure du tube de dosage. Ce sang résiduel peut être retiré à l'aide d'un coton-tige stérile. L'élimination complète est important parce que l'échec de le faire peuvent contaminer la préparation d'essai final avec les globules rouges non lysées.

Avant d'utiliser cette méthode de contrôle de compensation appropriées devraient être ajoutés à contrôler spchevauchement ectral parmi les réactifs utilisés pour identifier les différents aspects de la fonction de granulocytes. Pour cette méthode, les contrôles de compensation impliquent recueillir des échantillons de sang qui ont été proposées le 40 min dosage incubation puis marquage avec un marqueur unique (ce est à dire, E. coli, DHE, etc.). Après marquage, les événements positifs simples sont collectées et une matrice de compensation est généré à l'aide d'un assistant automatisé dans le logiciel d'analyse des idées. Il est essentiel que si ce test est utilisé, les contrôles de compensation appropriées pour se assurer de la bonne performance du dosage.

L'analyse est réalisée en utilisant la fonction finder et co-localisation des assistants pour identifier cette lumineuse intensité de détail est la meilleure variable pour séparer les populations et identifier aussi combien il existe un chevauchement entre burst oxydatif et les signaux de phagocytose. Plus précisément, l'utilisation de la cytométrie à base d'image à condition que la capacité de séparer les granulocytes activés en trois sous-ensembles. Tsa dépression de sous-ensemble a été déterminée en utilisant l'intensité lumineuse de détail de la phagocytose vs oxydatif. En plus de l'examen de ces fonctions cellulaires singulières, les cellules qui présentaient ces deux événements dans le même temps dans le même emplacement anatomique (co-localisation) ont été identifiés. Granulocytes qui sont tombées dans le sous-ensemble "de haute activité" étaient le seul phénotype qui a démontré la co-localisation cohérente entre oxydatif phagocytose et. Cette identification de sous-ensembles de granulocytes activés est la plus grande zone où dépannage est nécessaire. Il est très important pour un nouvel utilisateur de prendre le temps de comprendre le workflow du processus de l'échantillon dans les idées et de comprendre les mécanismes de séparer les populations de cellules en utilisant le composant d'imagerie. D'autres modifications que l'utilisateur peut chercher à faire comprennent la sélection de fois dosage incubation alternatives ou supplémentaires. La méthode actuelle suggère l'utilisation de durées de 10 à 40 min; Toutefois, selon le modèle expérimental où cette méthode estdoit être utilisé, il peut être nécessaire de choisir des durées plus dosage. Une telle modification devrait être évalué sur une base individuelle.

En outre, il a été déterminé que la durée de l'incubation de dosage a un effet significatif sur l'apparition des trois sous-ensembles activés. L'approche décrite dans le présent rapport représente une extension de ce que l'information pourrait être obtenue précédemment en ce qui concerne la fonction des granulocytes ^3,4,13,15. D'autres laboratoires ont démontré l'importance de l'évaluation des changements en fonction des granulocytes dans le cadre d'une évaluation globale de l'immunité et de la maladie ^15-17. En dépit du potentiel de cet essai ne est pas sans limitations. Une des limitations majeures est la demande de coût et de temps associée à une forte traitement des échantillons de débit. Quand un modèle d'étude nécessite un grand nombre d'échantillons dans un jour donné, elles peuvent être difficiles à traiter. Le traitement est simplifié par l'utilisation de pipettes électroniques et distributeurs,mais ceux-ci ont tendance à être coûteux et ne sont pas nécessairement disponibles dans tous les laboratoires.

Notre domaine de recherche se concentre sur une étude de la façon dont l'exercice et les habitudes alimentaires influent sur ​​la santé du système immunitaire et la fonction ^{6,8-10,18-20.} Ces objectifs ont des implications pratiques importantes pour une variété de domaines de la santé humaine. Au-delà de l'étude des effets de l'exercice et de la nutrition de la méthode de la phagocytose démontré dans ce manuscrit pourrait être utile dans d'autres domaines de l'immunologie clinique où la surveillance de la fonction de phagocytose est essentielle pour les résultats du traitement. Le présent essai est le premier de beaucoup que les dosages immunologiques avec le potentiel d'être réinventées en prenant avantages de l'information d'imagerie unique qui peut être possible à partir d'un flux à base d'images cytomètre.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vacutainers	BD Life Sciences		utilisé pour le prélèvement sanguin
WBC Fixateur / RBC Solution de lyse	eBioscience	00-5333-57
CD66b-APC	Clone eBioscience	G10F5
CD45-APCeFluor780	Clone eBioscience	2D1
S. aureus bioparticules	Technologies	A10010
dihydroéthidium	Sigma-Aldrich	D7008
N-éthylmalémide	Sigma-Aldrich	4259
7AAD	EMD Analyseur
	Mindray	BC-3200
Pipette à 96 canaux	Integra Biosciences	ViaFlo
Incubateur à bain de billes	LabArmour	BeadBath
Imaging Cytomètre en flux	EMD Millipore	Amnis FlowSight
Logiciel INSPIRE Logiciel	EMD Millipore	Amnis INSPIRE
IDEAS	Logiciel EMD Millipore	Amnis IDEAS
X-Pierce Scelleuse de plaques perforables	Excel Scientific, Inc.	Dell Precision X-Pierce
Ordinateurs	Dell	Divers	utilisés pour l’analyse IDEAS