Whole-monter imagerie de l'embryon de souris projections sensorielles Axon

Résumé

Nous présentons ici un protocole optimisé pour génotypager, colorer et préparer des souris fœtales pour l’imagerie des projections axonales du nocicepteur périphérique chez l’animal entier, comme méthode efficace pour évaluer les phénotypes de croissance des axones sensoriels chez les souris génétiquement modifiées en développement.

Résumé

La visualisation de pleine longueur projections neuronales dans les embryons est essentiel d'acquérir une compréhension de la façon dont les mammifères réseaux neuronaux se développent. Nous décrivons ici un procédé pour marquer in situ un sous-ensemble de ganglion de la racine dorsale (DRG) de projections axonales à évaluer leurs caractéristiques phénotypiques utilisant plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées. Les neurones TrkA-positif sont des neurones nocicepteurs, dédiées à la transmission des signaux de douleur. Nous utilisons une lignée de souris TrkA ^taulacZ d'étiqueter les trajectoires de tous les axones périphériques TrkA-positif dans l'embryon de souris intactes. Nous élevons en outre la ligne TrkA ^taulacZ sur un fond nul Bax, qui abolit essentiellement apoptose neuronale, afin d'évaluer les questions indépendamment de possibles effets de manipulations génétiques sur la survie neuronale liés à la croissance. Par la suite, les souris génétiquement modifiées d'intérêt sont élevés avec le TrkA ^TaullacZ / Bax ligne nulle et sont alors prêts pour l'étude en utilisant les techniques décrites ici. Cette présentation contient des informations détaillées sur les plans d'élevage de souris, le génotypage au moment de la dissection, la préparation des tissus, la coloration et la compensation pour permettre la visualisation de pleine longueur trajectoires axonales dans l'ensemble du montage préparation.

Introduction

Mise en place des réseaux neuronaux précis est un processus complexe du développement essentiel pour le fonctionnement du système nerveux. La perturbation de ce processus conduit à un dysfonctionnement neuronal qui a été impliquée dans des maladies neurologiques humaines ^3.1. Pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents de la croissance axonale et la cible innervation chez les mammifères, nous avons développé un protocole de visualiser les trajectoires axonales de TrkA exprimant neurones sensoriels utilisant une combinaison de deux lignées de souris génétiquement modifiées.

TrkA est un récepteur pour le facteur NGF de ....

Protocole

NOTE: Toutes les procédures sont conformes à la NIH Guide pour l'entretien et utilisation des animaux de laboratoire. Le protocole d'animal a été approuvé par le IACUC au Weill Cornell Medical College.

1. Préparation des tissus

1. Euthanasier femelles chronométré-grossesse par dislocation cervicale ^15. Disséquer embryonnaires E16 - E18 embryons de femelles chronométré-grossesse et placer des embryons individuellement dans les puits d'une plaque à 6 puits, remplis de solution saline tamponnée phosphate froide (PBS).
2. Rincer embryons dans du PBS froid.
3. Retirer une petite partie de la membran....

Résultats

Les génotypes de TrkA ^{WT / taulacZ:} Bax ^{- / -} TrkA et ^{taulacZ / taulacZ:} Bax ^{- / -} embryons peuvent être déterminées sans ambiguïté par génotypage PCR standard (figure 1). Coloration X-Gal affiche des informations détaillées tonnelles axonales périphériques sous-cutanée chez les embryons classiquement colorées (figures 2, 3a), et dans tout l'embryon après compensation de tissu (figures 3b, 4).

Nous.......

Discussion

Le X-gal procédure de souris embryonnaires TrkA ^taulacZ coloration décrite ci-dessus permet la visualisation rapide et détaillée des projections axonales longue distance dans l'embryon fixe intacte. En raison de la Bax fond nul ces souris permettent de sonder des mécanismes qui peuvent contribuer à la croissance de l'axone et la survie neuronale de signalisation. Accouplement avec transgéniques ou knock-out souris d'intérêt permet une évaluation globale des phénotypes axonales et.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
PFA	Sigma-Aldrich	P6418
PBS	Life Tech	10010-023
Solution de rinçage des tissus A	Millipore	BG-6-B
Solution de rinçage des tissus B	Millipore	BG-7-B
Solution de base de teinture des tissus	Millipore	BG-8-C
X-gal	Sigma-Aldrich	B4252
Flacon à scintiallation en verre	Kimble Chase	74500-20
Incubateur	Labline	Modèle 120
Épingles à insectes	FST	26000-30
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Plat 6 puits	USA Scientific	CC7672-7506
Amorces	IDT	amorces d’ADN
Takara dNTP mélange	Takara	4030
Takara LA tampon	Takara	RR002A
Takara LA Taq	Takara	RR002A
machine PCR	Bio-Rad	DNA Engine Dyad
Alcool benzylique	Sigma-Aldrich	B-1042
Benzyl benzoate	Sigma-Aldrich	B-6630
Microscope de dissection	Leica	M205A
Appareil photo	Leica	DFC310FX
Lampe annulaire	Leica  ;	MEB110
Photoshop	Adobe	Photoshop 4.0

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