Phénotypage Souris fonction pulmonaire In Vivo Avec le Capacité diffusion pulmonaire

Résumé

Nous décrivons un moyen de mesurer rapidement et simplement la capacité de diffusion pulmonaire chez la souris et montrons qu’elle est suffisamment sensible aux changements de phénotype dans plusieurs pathologies pulmonaires courantes. Cette métrique apporte donc une pertinence translationnelle directe aux modèles murins, puisque la capacité de diffusion est également facilement mesurable chez l’homme.

Résumé

La souris est maintenant l'animal primaire utilisé pour modéliser une variété de maladies pulmonaires. Pour étudier les mécanismes qui sous-tendent ces pathologies, les méthodes phénotypiques sont nécessaires qui peuvent quantifier les changements pathologiques. En outre, de fournir la pertinence de translation les modèles de souris, de telles mesures devraient être des tests qui peuvent facilement être faites chez les humains et les souris. Malheureusement, dans la littérature actuelle quelques mesures phénotypiques de la fonction pulmonaire ont une application directe pour l'homme. Une exception est la capacité de diffusion du monoxyde de carbone, qui est une mesure qui se fait couramment chez l'homme. Dans le présent rapport, nous décrivons un moyen de mesurer rapidement et simplement cette capacité de diffusion chez les souris. La procédure implique une brève inflation des poumons avec un gaz témoin dans une souris anesthésiée, suivie d'un temps d'analyse des gaz 1 min. Nous avons testé la capacité de cette méthode pour détecter plusieurs pathologies pulmonaires, y compris l'emphysème, la fibrose, une lésion pulmonaire aiguë et de la grippe etinfections pulmonaires fongiques, ainsi que la surveillance maturation pulmonaire chez les jeunes chiots. Les résultats montrent une diminution significative dans toutes les pathologies du poumon, ainsi que l'augmentation de la capacité de diffusion de la maturation pulmonaire. Cette mesure de la capacité de diffusion du poumon fournit donc un test de la fonction pulmonaire qui a une large application avec sa capacité à détecter des changements structurels phénotypiques avec la plupart des modèles pulmonaires pathologiques existants.

Introduction

La souris est maintenant l'animal primaire utilisé pour modéliser une variété de maladies pulmonaires. Pour étudier les mécanismes qui sous-tendent ces pathologies, les méthodes phénotypiques sont nécessaires qui peuvent quantifier les changements pathologiques il. Bien qu'il existe de nombreuses études sur les souris où la mécanique de ventilation sont mesurés, ces mesures sont généralement sans rapport avec les évaluations standard de la fonction pulmonaire chez l'homme fait normalement. Ce est malheureux, car la capacité d'effectuer des mesures équivalentes dans les souris et les sujets humains peut faciliter la traduction des résultats dans des modèles murins de maladies humaines.

Une des mesures les plus communs et facilement faites sur des sujets humains est la capacité de diffusion du monoxyde de carbone (DLCO) ^1,2, mais cette mesure n'a que rarement été fait dans les modèles de souris. Dans les études où il a été rapporté ^3-7, il ya eu aucune étude de suivi, en partie parce que les procédures sont souvent lourds ou peuvent REQUIRE équipements complexes. Une autre approche consiste à utiliser une méthode de CO réinspiration dans un système de l'état d'équilibre, qui a l'avantage d'être capable de mesurer la diffusion de CO chez des souris conscientes. Cependant cette méthode est très lourd, et les résultats peuvent varier avec le niveau de la ventilation de la souris ainsi que O ₂ et CO ₂ concentrations ^8,9. Ces difficultés semblent avoir empêché l'utilisation systématique de la capacité de diffusion pour détecter des pathologies pulmonaires chez la souris, en dépit de ses nombreux avantages.

Pour contourner les problèmes de mesure de la capacité de diffusion chez les souris, les détails d'un moyen simple de mesurer dans des souris ont été récemment rapporté ^10. La procédure élimine le difficile problème de prélèvement des gaz alvéolaire non contaminée par échantillonnage rapidement un volume égal à l'ensemble du gaz inspiré. Ce procédé aboutit à une mesure très reproductible, appelée coefficient de diffusion pour le monoxyde de carbone (DFCO), qui est sensible à un hôte de pathologic changements dans le phénotype du poumon. Le DFCO est donc calculé comme 1 - (CO ₉ / CO _c) / (Ne ₉ / Ne _c), où le c et 9 indices se rapportent aux concentrations des gaz d'étalonnage injectés et les gaz retirés après un temps d'apnée 9 sec, respectivement. DFCO est une variable sans dimension, qui varie entre 0 et 1, avec une réflexion absorption complète de tous CO, 0 et reflétant pas l'absorption de CO.

Dans cette présentation, nous montrons comment faire cette mesure de la capacité de diffusion, et comment il peut être utilisé pour documenter les changements dans presque tous les modèles de maladies pulmonaires de la souris existants, y compris l'emphysème, la fibrose, une lésion pulmonaire aiguë et les infections virales et fongiques.

Protocole

REMARQUE: Tous les protocoles d'animaux ont été approuvés par le Comité Université soin et l'utilisation des animaux Johns Hopkins.

1. Préparation des animaux

1. Préparer 6 souris C57BL / 6 de contrôle pour la mesure DFCO, en les anesthésier avec la kétamine et de la xylazine tel que décrit à l'étape 2.3 ci-dessous.
2. Préparer tous les autres souris avec les différentes pathologies pulmonaires indiqués dans le tableau 1 en utilisant le même mode opératoire que pour les témoins. Les détails spécifiques nécessaires pour établir chacun de ces modèles se trouvent dans les références pertinentes. Les souris témoins et ceux dans les autres cohortes pathologiques sont tous les 6 à 12 semaines d'âge.

2. Mesure de Diffusion Facteur pour le monoxyde de carbone (DFCO)

1. Mettre en place le module de chromatographie en phase gazeuse fourni avec la machine à mesurer les pics de l'azote, de l'oxygène, le néon, et le monoxyde de carbone. Pour cette utilisation de l'application uniquement les données de néon et de CO.
   NOTE: Cet instrument utilise un s moléculairesIEVE colonne avec de l'hélium comme gaz porteur, avec un 12,00 um film 320,00 ID um et 10 m de longueur. La colonne de Chromatographie a un volume de 0,8 ml, mais on utilise 2 ml d'assurer la compensation adéquate de la tubulure de liaison avec l'échantillon.
2. Au début de chaque journée expérimentale, avant de prendre les mesures des échantillons provenant des souris, prendre un échantillon de 2 ml directement d'un sac de mélange gazeux contenant environ 0,5% Ne, 0,5% de CO, et d'équilibrer l'air, et utiliser cet exemple pour calibrer le chromatographe en phase gazeuse.
3. Anesthésier les souris avec de la kétamine (90 mg / kg) et de xylazine (15 mg / kg), et de confirmer l'anesthésie par l'absence de mouvement réflexe. Appliquer une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse. Tracheostomize les souris avec une canule d'aiguille de stub (18 G chez les adultes ou 20 G chez les très jeunes souris).
   NOTE: Le DFCO est terminée en moins de 10 min après l'anesthésie et avant toute ventilation mécanique ou d'autres procédures.
4. Chez les souris de plus de 6 semaines d'âge, utiliser une seringue de 3 ml to retirer 0,8 ml de gaz dans le sac de mélange de gaz. Connectez la seringue à la canule trachéale et gonfler rapidement le poumon. Utiliser un métronome, comptez 9 sec, puis rapidement retirer les 0,8 ml (air expiré).
5. Diluer cette retirés 0,8 ml air expiré à 2 ml avec l'air ambiant, laisser reposer pendant au moins 15 secondes. Puis injecter la totalité de l'échantillon dans le chromatographe en phase gazeuse pour analyse.
6. Bien que l'analyse de ce premier échantillon DFCO, gonfler le poumon de souris avec une seconde 0,8 ml dans le sac de mélange de gaz, puis traiter cet échantillon identique au premier échantillon. La moyenne des deux mesures DFCO.
   NOTE: Pour les mesures dans des souris aussi jeunes que 2 semaines d'âge, utiliser un volume de 0,4 ml, 0,8 ml est depuis un volume trop important de faire des mesures dans les poumons de souris très jeunes. Il est préférable d'utiliser le volume de 0,8 ml pour les souris âgées de 6 semaines, et que si le volume de 0,4 ml est nécessaire pour certaines souris, il devrait être utilisé systématiquement pour toutes les souris de la cohorte à l'étude.
7. Calculer DFCOcomme une - (CO ₉ / CO _c) / (Ne ₉ / Ne _c), où c et 9 indices se rapportent aux concentrations de gaz d'étalonnage et les gaz injectés retirées après un temps de maintien 9 souffle sec, respectivement.
8. Analyser et comparer les différences avec une analyse de variance à une voie et d'évaluer le niveau avec la correction de Tukey pour les comparaisons multiples dans toutes les souris de la cohorte de signification. Considérez p <0,05 de valeur aussi importante.
   NOTE: Toutes les souris utilisées ici ont fait partie des études expérimentales impliquant plusieurs mesures ultérieures de la ventilation pulmonaire, la mécanique, le lavage du poumon, ou l'histologie, qui ne sont pas signalés ici. En outre, puisque le procédé est le même dans tous les modèles expérimentaux comme l'a fait ci-dessus dans les souris témoins, seuls les résultats des différents modèles pathologiques sont présentés. De plus amples informations sur ces modèles est présentée dans le tableau supplémentaire.
9. Euthanasier les animaux par anesthe profondesurdosage tic suivie par dislocation cervicale ou décapitation. Le cas échéant, éliminer les cellules et / ou tissus pulmonaires des souris mortes pour la poursuite ou de la transformation biologique et l'analyse histologique.

Résultats

La figure 1 montre les mesures DFCO des souris adultes dans les groupes A, B, C, D, E et F. Il y avait une diminution significative avec les deux infections à Aspergillus et à la grippe, ainsi que des diminutions significatives de la fibrose, emphysème, et aiguë modèles de lésion pulmonaire. La figure 2 montre les changements dans le développement du Groupe G en DFCO au fil du temps que l'âge de la souris 2-6 semaines. Il y avait une augmentation légère mais significative avec le dévelo...

Discussion

Dans le présent travail, nous avons défini une nouvelle mesure pour quantifier la capacité des poumons de souris de gaz échanger. Cette métrique est analogue à la capacité de diffusion, une mesure clinique courant qui mesure la fonction primaire du poumon, ce est-à sa capacité à échanger des gaz. La capacité de diffusion est la seule mesure fonctionnelle du poumon qui peut être fait facilement et rapidement chez les souris et les humains. Pour la détection de la maladie du poumon chez la souris, un objectif majeur est d...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Chromatographe en phase gazeuse	Inficon	Micro GC Modèle 3000A	Agilent fabrique un modèle comparable
Aiguille Luer 18 G	Becton Dickenson		Plusieurs autres fournisseurs possibles Seringue
en plastique de 3 ml	Becton Dickenson		Plusieurs autres fournisseurs possibles
Sacs d’échantillons de gaz en polypropylène	La capacité SKC	de 1 ou 2 L fonctionne bien	D’autres sacs étanches aux gaz fonctionneront bien
Réservoir de gaz, 0,3 % Ne, 0,3 % CO, équilibre de l’air ; (taille ME)	Airgas, Inc	Z04 NI785ME3012	Il s’agit du mélange standard utilisé pour le DLCO chez l’homme
25 TCID50/souris du virus de la grippe A/PR8 dilué dans une solution saline tamponnée au phosphate.
Élastase pancréatique porcine	Elastin Products, Owensville, MO		5.4 U
Bleomycin	APP Pharmaceuticals, Schaumburg, IL		0.25 U
Escherichia coli LPS	Sigma L2880		3 &mu ; g/g de poids corporel ; Les conidies O55 :B5
Aspergillus fumigatus (isolat Af293) ont été prélevées dans des colonies matures cultivées sur gélose au dextrose de pomme de terre.