Développement d'un In vitro Système modèle pour l'étude de l'interaction de Equus Caballus IgE avec son récepteur de haute affinité FcsRI

Summary

La présente étude décrit le développement et les applications d’un système de dosage génétiquement modifié basé sur la transfection de cellules de leucémie basophile de rat avec le gène équin FcεRIα. Les cellules transfectées expriment un récepteur fonctionnel où la libération de médiateurs de la réponse allergique peut être activée par les IgE et l’antigène.

Abstract

L’interaction des IgE avec son récepteur Fc de haute affinité (FcεRI) suivie d’un défi antigénique est la principale voie dans les réactions allergiques médiées par les IgE. En raison de la liaison de haute affinité entre les IgE et les FcεRI, ainsi que de la production continue d’IgE par les lymphocytes B, les allergies persistent généralement tout au long de la vie, sans qu’aucun remède permanent ne soit actuellement disponible. Les chevaux, en particulier les chevaux de course, qui sont généralement consanguins, sont une espèce de mammifères très sujette au développement de réponses d’hypersensibilité, ce qui peut sérieusement affecter leurs performances. Les réponses physiologiques à la sensibilisation allergique chez les chevaux reflètent celles observées chez l’homme et le chien. Dans cet article, nous décrivons le développement d’un système de test in situ pour l’évaluation quantitative de la libération de médiateurs de la réponse allergique appartenant au système équin. À cette fin, le gène codant pour l’équidé FcεRIα a été transfecté et exprimé à la surface des cellules parentales de leucémie basophile du rat (RBL-2H3.1). Le produit génique de la chaîne α équine transfectée a formé un complexe récepteur fonctionnel avec les chaînes endogènes β et γ ^{rat 1}. Le système de dosage résultant a facilité l’évaluation de la quantité de médiateur sécrétée par les cellules RBL-2H3.1 transfectées de FcεRIα équine après sensibilisation aux IgE équines et à la provocation antigénique en utilisant la libération de β-hexosaminidase comme lecture ^{2, 3}. La libération du médiateur a culminé à 36,68 % ± 4,88 % à 100 ng ^ml-1 d’antigène. Ce test a été modifié par rapport aux tests précédents utilisés pour étudier les réponses allergiques humaines et canines ^{4, 5}. Nous avons également montré que ce type de système de test a de multiples applications pour le développement d’outils de diagnostic et l’évaluation de l’innocuité de stratégies d’intervention thérapeutique potentielles dans les maladies allergiques ^{6, 2, 3}.

Introduction

Allergie est connue depuis des millénaires. Un traitement de l'asthme a été décrit dans le texte médical égyptien antique connu sous le papyrus Ebers (~ 1550 avant notre ère) et discuté remèdes pour traiter ^7.

allergie est aujourd'hui considéré comme une réponse d'hypersensibilité de type I, où le type T cellulaire auxiliaire 2 (TH ₂₎ du bras du système immunitaire dirige la production d'immunoglobulines E (IgE), des anticorps en réponse à des antigènes environnementaux appelés allergènes. Ce sont diverses substances qui interagissent couramment avec les cellules du système immunitaire et stimuler la ....

Protocol

1) Préparation de la lignée cellulaire:

1. Le développement de la lignée de cellules RBL-de 2H3.1 exprimer équins α FceRI:
   1. En utilisant des techniques de base de culture de tissus de lignées de cellules en monocouche, transfecter des cellules RBL-2H3.1 parentales en utilisant le plasmide pEE6, portant le gène équine FcεRIα (GenBank: Y18204.1) ^28. Ajouter 2 ul ^-1 pg de l'ADN plasmidique de 0,8 ml de cellules à une densité de 1,2 x 10 ⁷ cellules ml ^-1. L'électroporation des cellules à 250 V 960 pF en utilisant un 0,4 cm electrocuvette puis incuber immédiatement sur la glace pendant 10 min.
   2. ....

Results

Les cellules RBL-2H3.1 parentales et celles transfectées avec le gène du récepteur de FcεRIα équine ont d'abord été sensibilisées avec des IgE de souris anti- DNP-HSA et la provocation avec l'antigène DNP-HSA. IgE de souris se lie au récepteur de rat endogène dans les deux lignées cellulaires et agit comme un contrôle pour tester la viabilité de la libération de deux lignées cellulaires pour libérer des médiateurs (figure 1 A) ainsi. Ceci est un test important et doit être effectuée régulièrement depuis.......

Discussion

En résumé, les résultats de cette enquête ont montré que lorsque les cellules RBL-2H3.1 exprimant FcεRIα équins sont sensibilisées avec équine IgE et remis en cause par un antigène, ils donnent un pic de libération de médiateur de 36,68% ± 4,88% du montant total de médiateur à l'intérieur du cellules, par rapport à la RBL-2H3.1 cellules parentales non exprimant équine FcεRIα.

Ainsi, ce test fournit un outil utile pour étudier et étudier les réponses allergiques équins in vitro. .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RBL-2H3.1 Expression de Fc&epsilon équin ; RI&alpha ;	-	-	Produit en laboratoire
IgE équine anti NIP-HSA	-	-	Produit en laboratoire
96 Well Plate	Sigma		CLS3595-Pipette
multicanal	Anachem	-	-
Incubateur	Galaxy R	-	-
4Hydroxy-5-iodo-3-nitrophénylacétique Acide	Cambridge Research Biochemicals	N-1070-1	Le NIP-OH a été conjugué à l’albumine sérique humaine pour fabriquer le NIP-HSA en laboratoire
Dinitrophényle conjugué à l’albumine sérique humaine	Sigma	A6661	Spectrophotomètre à plaques abrégé DNP-HSA
	Anthos Labtec HT2	-	-
Pipes	Sigma	P1851-Chlorure
sodium	Sigma	S7653-Chlorure
potassium	Sigma	P9333-Chlorure
magnésium	Sigma	M2670-Chlorure
calcium	Sigma	C1016-Triton
x100	Sigma
N-acétyl-&bêta ;-D-glucosaminide	Sigma	N9376	solution mère appelée substrat de &beta ;-hexosaminidase était de 50 mM préparée dans du DMSO
Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D2650-Acide
citrique	Sigma
251275-Acétate de sodium	Sigma	S7670-Tris
	Sigma	T5941	-