Culture de souris embryonnaires cochléaires explants et Gene Transfer par électroporation

Résumé

Nous présentons une méthode qui décrit l’isolement et la culture d’explants cochléaires à partir d’oreilles internes embryonnaires de souris. Nous démontrons également une méthode de transfert de gènes dans des explants cochléaires par électroporation à ondes carrées. La culture d’explants in vitro couplée à la technique de transfert de gènes permet aux chercheurs d’étudier les effets de la modification de l’expression des gènes au cours du développement.

Résumé

Les cellules ciliées auditives situées dans l’organe de souris de Corti détectent et transmettent des informations sonores au système nerveux central. Les cellules ciliées mécanosensorielles sont alignées dans une rangée de cellules ciliées internes et trois rangées de cellules ciliées externes qui s’étendent le long de l’axe basal à apical de la cochlée. La technique de culture d’explants décrite ici fournit une méthode efficace pour isoler et maintenir les explants cochléaires de l’oreille interne embryonnaire de la souris. De plus, la morphologie et les caractéristiques moléculaires des cellules ciliées sensorielles et des cellules de soutien non sensorielles dans les cultures d’explants cochléaires ressemblent à celles observées in vivo et peuvent être étudiées dans son environnement cellulaire intrinsèque. Les explants cochléaires peuvent servir d’outils expérimentaux importants pour l’identification et la caractérisation des voies moléculaires et génétiques impliquées dans la spécification et la structuration cellulaires. Bien que les modèles de souris transgéniques constituent une approche efficace pour les études d’expression génique, un nombre considérable de mutants de souris meurent au cours du développement embryonnaire, ce qui entrave l’analyse et l’interprétation des phénotypes développementaux. L’organe de Corti de souris mutantes qui meurent avant la naissance peut être cultivé afin d’analyser leur développement in vitro et leurs réponses à différents facteurs. De plus, nous décrivons une technique d’électroporation ex vivo d’explants cochléaires embryonnaires qui peut être utilisée pour réguler à la baisse ou surexprimer un ou plusieurs gènes spécifiques et analyser leur fonction endogène potentielle et tester si le produit génique spécifique est nécessaire ou suffisant dans un contexte donné pour influencer le développement cochléaire des mammifères^1-8.

Introduction

L’organe de mammifère de Corti est composé d’une mosaïque de types de cellules spécialisées, y compris deux types de cellules ciliées mécanosensorielles ainsi qu’au moins quatre types de cellules de soutien non sensorielles, ce qui en fait un système modèle idéal pour étudier les processus cellulaires normaux tels que la prolifération, la spécification du destin, la différenciation et la structuration. De plus, le développement normal de ces différents types de cellules est essentiel pour une fonction auditive normale. Par conséquent, il est crucial de comprendre les facteurs, à la fois moléculaires et cellulaires, qui régulent leur développement. Cependant, la petite....

Protocole

REMARQUE: Tous les protocoles utilisant des animaux vivants doit être examiné et approuvé par un comité de protection des animaux et l'utilisation institutionnelle (IACUC) et doit suivre officiellement méthodes pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire approuvé. Tous les dissections doivent être effectuées en utilisant une technique stérile sur un banc à flux laminaire propre. Gants et un masque, si vous le souhaitez, doivent être portés pendant cette procédure.

1. Dissection de l'oreille de la souris embryonnaires intérieure

1. Mise en place pour orgue des cultures d'explants Corti:
   1. Stérili....

Résultats

Nous décrivons une méthode pour isoler la cochlée des oreilles internes embryonnaires et micro-disséquer pour exposer l’épithélium sensoriel. Une fois disséqué, il peut être plaqué et cultivé sous forme de canal cochléaire intact (Figure 3) et analysé par immunohistochimie. Les explants cochléaires cultivés constituent un test utile pour examiner l’effet de divers facteurs solubles et médicaments pharmacologiques sur le développement cochléaire. Après la dissection d’explants cochléaires, la technique d’.......

Discussion

Toutes les cellules à l'intérieur du labyrinthe membraneux de l'oreille interne de souris comprenant sensorielle, non sensorielle et les neurones du ganglion spiral sont toutes dérivées du dérivé placodally otocyste situé à côté du cerveau postérieur de l'ectoderme, autour de ^10-14 E8. A E11, la région ventrale du otocyste se étend pour former le conduit cochléaire et que le développement se poursuit, un groupe de cellules épithéliales dans la cochlée, ainsi que dans d'autres régions du otocys.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
HBSS	Gibco	14065-056
HEPES	Gibco	15630-080
Dulbecco' s Medium modifié	Gibco	12430-054
Sérum fœtal bovin	Gibco	10082
N-2 Supplément (100x)	Gibco	17502-048
Chlorhydrate de ciprofloxacine	Cellgro	61-277-RF
Plat en verre 60 mm	Kimble Chase	23062-6015/23064-6015
Plat en verre 100 mm	Kimble Chase	23064-10015/23062-10015
Broches minutien	Outils pour les sciences fines	26002-15
Pince Dumont #5	Outils pour les sciences fines	11251-10
Générateur d’impulsions	Protech International Inc	CUY21Vivo-SQ
Boîtes de culture à fond en verre	MatTek	P35G-0-10-C
Matrice matrigel	BD Biosciences	356237
Boîte de culture, 60 x 15 mm	Becton Dickinson	353037
Boîtes de culture tissulaire	Greiner Bio-one	639160
Solution saline tamponnée au phosphate	Gibco	10010-023
OS-30	Dow Corning	4021768
Fluoromount	Southern Biotech	0100-01
Tubes coniques, 15 ml	Greiner Bio-one	188261
Myosine 6	Proteus Biosciences Inc	25-6791
Myosine 7a	Proteus Biosciences Inc	25-6790
TuJ1	Sigma	T2200