Nous présentons une méthode qui décrit l’isolement et la culture d’explants cochléaires à partir d’oreilles internes embryonnaires de souris. Nous démontrons également une méthode de transfert de gènes dans des explants cochléaires par électroporation à ondes carrées. La culture d’explants in vitro couplée à la technique de transfert de gènes permet aux chercheurs d’étudier les effets de la modification de l’expression des gènes au cours du développement.
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Article de méthode
Culture de souris embryonnaires cochléaires explants et Gene Transfer par électroporation
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les cellules ciliées auditives situées dans l’organe de souris de Corti détectent et transmettent des informations sonores au système nerveux central. Les cellules ciliées mécanosensorielles sont alignées dans une rangée de cellules ciliées internes et trois rangées de cellules ciliées externes qui s’étendent le long de l’axe basal à apical de la cochlée. La technique de culture d’explants décrite ici fournit une méthode efficace pour isoler et maintenir les explants cochléaires de l’oreille interne embryonnaire de la souris. De plus, la morphologie et les caractéristiques moléculaires des cellules ciliées sensorielles et des cellules de soutien non sensorielles dans les cultures d’explants cochléaires ressemblent à celles observées in vivo et peuvent être étudiées dans son environnement cellulaire intrinsèque. Les explants cochléaires peuvent servir d’outils expérimentaux importants pour l’identification et la caractérisation des voies moléculaires et génétiques impliquées dans la spécification et la structuration cellulaires. Bien que les modèles de souris transgéniques constituent une approche efficace pour les études d’expression génique, un nombre considérable de mutants de souris meurent au cours du développement embryonnaire, ce qui entrave l’analyse et l’interprétation des phénotypes développementaux. L’organe de Corti de souris mutantes qui meurent avant la naissance peut être cultivé afin d’analyser leur développement in vitro et leurs réponses à différents facteurs. De plus, nous décrivons une technique d’électroporation ex vivo d’explants cochléaires embryonnaires qui peut être utilisée pour réguler à la baisse ou surexprimer un ou plusieurs gènes spécifiques et analyser leur fonction endogène potentielle et tester si le produit génique spécifique est nécessaire ou suffisant dans un contexte donné pour influencer le développement cochléaire des mammifères1-8.
Introduction
L’organe de mammifère de Corti est composé d’une mosaïque de types de cellules spécialisées, y compris deux types de cellules ciliées mécanosensorielles ainsi qu’au moins quatre types de cellules de soutien non sensorielles, ce qui en fait un système modèle idéal pour étudier les processus cellulaires normaux tels que la prolifération, la spécification du destin, la différenciation et la structuration. De plus, le développement normal de ces différents types de cellules est essentiel pour une fonction auditive normale. Par conséquent, il est crucial de comprendre les facteurs, à la fois moléculaires et cellulaires, qui régulent leur développement. Cependant, la petite taille de la cochlée de la souris ainsi que son inaccessibilité posent un défi particulier pour les études d’expression génique. De plus, la plupart des événements de spécification et de structuration du destin cellulaire se produisent pendant les périodes embryonnaires et sont généralement terminés avant la naissance. Par conséquent, l’identification et la caractérisation des événements de signalisation au cours des périodes embryonnaires sont essentielles pour mieux comprendre les bases moléculaires de la morphogenèse cochléaire.
Ici, nous démontrons une méthode pour cultiver in vitro une cochlée intacte à partir d’oreilles internes embryonnaires de souris. La raison d’être de cette technique est que les cochlées cultivées conservent leurs caractéristiques moléculaires et morphologiques, fournissant ainsi un modèle précieux pour l’étude de gènes candidats potentiels et l’exploration des mécanismes impliqués dans la morphogenèse cochléaire. Bien que les souris transgéniques puissent être utilisées pour des études d’expression génique, un système in vitro est souvent nécessaire pour surveiller des fonctions géniques spécifiques. De plus, des cultures cochléaires peuvent être établies à partir d’embryons de souris transgéniques afin d’étudier leur développement in vitro et leur réponse à divers facteurs solubles et antagonistes. Bien que les embryons au jour 13 (E13) soient utilisés dans ce protocole, les cultures de E12 ou E14 jusqu’aux oreilles internes postnatales précoces peuvent donner des résultats similaires.
Nous présentons également une technique de transfert de gènes dans des explants cochléaires embryonnaires en culture en utilisant l’électroporation à ondes carrées. Suite à l’isolement des explants cochléaires, l’électroporation peut être utilisée pour exprimer des plasmides d’ADN de gènes d’intérêt dans des cellules individuelles du canal cochléaire. Cette technique sert d’approche complémentaire aux études utilisant des souris transgéniques pour mieux comprendre les voies moléculaires sous-jacentes au phénotype cellulaire. En utilisant cette méthode de transfert de gènes, une variété de types de cellules épithéliales dans la cochlée embryonnaire sont transfectés, permettant ainsi des analyses de perte et de gain de fonction au niveau de la cellule unique. De plus, des études électrophysiologiques peuvent également être réalisées dans des cultures d’explants cochléaires8. Cette méthode d’électroporation in vitro est relativement simple et directe, combinée à des dommages minimes aux tissus, a entraîné une expansion rapide de cette technique.
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Protocole
REMARQUE: Tous les protocoles utilisant des animaux vivants doit être examiné et approuvé par un comité de protection des animaux et l'utilisation institutionnelle (IACUC) et doit suivre officiellement méthodes pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire approuvé. Tous les dissections doivent être effectuées en utilisant une technique stérile sur un banc à flux laminaire propre. Gants et un masque, si vous le souhaitez, doivent être portés pendant cette procédure.
1. Dissection de l'oreille de la souris embryonnaires intérieure
- Mise en place pour orgue des cultures d'explants Corti:
- Stériliser la hotte à flux laminaire de culture de tissus en activant la lumière UV pendant environ 30 min et désinfecter la surface avec 70% d'éthanol avant utilisation. En outre, stériliser tous les instruments de dissection y compris les outils de dissection fine et plats Sylgard revêtus pour la dissection embryon par autoclave ou par trempage dans 70% d'éthanol pendant au moins 20 min avant utilisation. Verser 70% d'éthanol et permettre aux plats et instruments à l'air dans un flux laminaire propre CLEAn banc avant utilisation.
- Préparer une solution saline équilibrée de Hank stérile (HBSS) / (4- (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic) mélange (HEPES) en ajoutant 10% de HBSS 10x et 0,5% de HEPES et ajuster le pH à environ 7,2 et stériliser le filtre solution finale et conserver à 4 ° C. Effectuer toutes les dissections en réfrigérés solution HBSS / HEPES pour mieux préserver le tissu pendant toute la procédure.
- plats à fond de verre-manteau avec matrice de membrane basale par addition de 5 ml de milieu Eagle modifié de froid (4 ° C) stérile Dulbecco (DMEM) à une portion aliquote de 300 ul de matrice de membrane basale dans un tube de 15 ml en polypropylene stérile. Mélanger au vortex le contenu et ajouter 150 ul de la membrane basale mélange DMEM-matrice au centre de chaque boîte de culture de sorte qu'il couvre l'ensemble du puits de culture présent dans le centre du plat. Couvrez les plats et les conserver dans un incubateur à 37 ° pendant au moins 45 min avant utilisation.
- Verser 4-5 ml réfrigérés HBSS en eree plats polystyrène de Pétri stérile et le laisser fermé dans la hotte.
- Préparer un milieu de culture dans un tube de 15 ml en polypropylene stérile en ajoutant 9 ml de DMEM, 100 ul de suppléments N2, 10 g / ml Cipro et 1 ml de FBS.
- Isolement des embryons:
NOTE: Dans cette procédure pour la culture des explants de souris embryonnaires cochléaires, oreille interne récolte du jour embryonnaire (E) 13 os temporaux avec le jour après la fécondation étant considérés comme E1 9. Le protocole peut également être utilisé avec l'oreille interne de souris embryonnaire débutant à partir de E12 à E18.- Euthanasier une souris chronométré-enceinte de CO 2 et de sacrifier des animaux par dislocation cervicale ou protocoles approuvés appropriées. Effectuer l'euthanasie loin de la hotte à flux laminaire de culture de tissus pour maintenir la stérilité dans la chambre de culture de tissu.
- Placez la souris euthanasiés sur une serviette en papier avec de l'abdomen vers le haut et désinfecter abdomen avec 70% d'éthanol.
- Ouvrez la cavité abdominale en saisissant la peauavec une pince incurvés avec une main et de l'épiderme et le muscle coupées le long de la ligne médiane à l'aide de ciseaux avec une autre main. Faites deux coupes perpendiculaires des deux côtés et retirez soigneusement l'utérus en soulevant cornes utérines bilatérales avec une pince et le détacher de dessous des ciseaux de tissu conjonctif à l'aide.
- Placez la chaîne embryonnaire dans une boîte de Pétri contenant une solution glacée de dissection (mélange HBSS / HEPES) et transfert à l'banc propre à flux laminaire.
- Retirer soigneusement embryons à partir de placenta et les placer dans une des boîtes de Pétri stériles contenant une solution de dissection. Si la solution devient sanglante, les déplacer vers une nouvelle boîte de Pétri.
NOTE: A ce stade, les embryons peuvent être mis en scène à l'aide d'un guide de mise en scène Theiler. - Décapitez embryons par pincement à la région du cou avec une paire de pinces propres ou des ciseaux et placer les têtes dans un plat frais Petri contenant une solution de dissection froide.
- Dissection de l'oreille interne:
- Lieu otête de l'embryon ne dans un plat Sylgard stérile contenant dissection froide
- solution. Travailler sous un microscope de dissection à un grossissement de 1.6X ~, immobiliser la tête de l'embryon en plaçant épingles minuties autour ou près de la région de l'œil (figure 1A).
- L'utilisation de deux paires de pinces stériles retirer soigneusement la peau et ouvrir le crâne sur la face dorsale le long de la ligne médiane (figure 1B). Retirer le cerveau de la cavité crânienne et les oreilles intérieures situées dans os temporaux peuvent être identifiés à ce stade (figure 1C, D). La paroi de vaisseau sanguin, ce qui est habituellement présent dans l'oreille interne, peut être utilisé comme un point de repère pour l'identification de l'oreille interne à ce stade (figure 1D).
- Disséquer l'oreille interne des os temporaux en plaçant la pince sous le tissu et l'isolement de l'oreille interne de la base du crâne et le transfert à un nouveau plat contenant une solution de dissection froide (figure 1E, F).
2. Génération d'organes des cultures d'explants Corti
NOTE: A ce stade de développement, le tissu est cartilagineux et peut facilement être disséqué en utilisant une pince.
- Orientez le oreille interne afin que la face ventrale est orientée vers le haut (figure 2A) et de stabiliser l'oreille interne en insérant doucement l'extrémité pointue de broches minuties à travers la partie vestibulaire de l'oreille interne (figure 2B).
- Aide d'une pince ultrafines coupés ouvrir le cartilage sus-jacente en faisant une incision en utilisant une extrémité de forceps près de la fenêtre ovale et retirez soigneusement le cartilage de la cochlée (figure 2C).
NOTE: Il est important de se assurer que le forceps ne sont pas insérés trop profondément dans le cartilage que le cartilage recouvrant est parfois fusionné avec le canal cochléaire dans ce cas, il est utile d'utiliser des pinces fermées pour libérer le cartilage du conduit cochléaire sous-jacent par grattage en dessous de la surface du cartilage. A ce stade de développement, la spirale cochléaire est à seulement trois quarts de tour en longueur. - Ensuite, exposer l'épithélium sensoriel en plaçant les pinces à la région préférée du conduit cochléaire, la base ou au sommet très, et en tirant doucement sur le toit de la cochlée (figure 2D).
NOTE: Le toit de la cochlée doit être enlevée complètement, car elle peut masquer l'épithélium sensoriel entraver l'analyse.
NOTE: Cette procédure doit être fait doucement car il est facile à déchirer l'épithélium sensoriel. - Comme dernière étape, retirer délicatement le tissu conjonctif sous-jacent de l'épithélium sensoriel exposés, afin que la base de l'expiant cochléaire est uniformément plat.
- Isoler la cochlée disséqué de la partie vestibulaire de l'oreille interne en utilisant une pince. Ceci peut être réalisé avant ou après l'étape 2.4 (figure 2E).
- Transférer l'épithélium sensoriel cochléaire disséqué dans un membra du sous-solne matrice revêtu puits de culture en utilisant un scooper stérile de 1,5 mm (figure 2F).
- Orientez le explant cochléaire avec la surface luminale de l'épithélium vers le haut et aspirer la solution de la membrane basale matrice DMEM pour aplatir soigneusement le tissu et le remplacer par 150 pi de milieu de culture frais en ajoutant doucement pour le plat. Des précautions doivent être prises pour se assurer que chaque explant adhère bien à la lamelle de verre revêtue et ne flotte pas dans le milieu de culture. Assurez-vous que la pointe de la pince est dirigé vers le haut tout en apposant sur le bien de verre pour éviter d'endommager l'expiant cochléaire.
- Transférer doucement la boîte de culture dans une boîte de culture de 150 mm stérile et placer dans un incubateur de culture de tissus à 37 ° C avec 5% de CO 2 pour la période de temps désirée, généralement 3-6 jours in vitro (DIV). Après une DIV, examiner les cultures sous un microscope à dissection pour se assurer que l'expiant cochléaire a ainsi adhéré à la boîte de culture.
- Après encubation in vitro pour les longueurs souhaitées de temps, les cultures sont traitées pour l'immunohistochimie.
NOTE: Les cultures d'explants sont généralement incubées pendant 6 DIV qui est équivalent au stade de développement, P0. Après une incubation in vitro, les cultures peuvent être traitées pour d'autres applications en aval tels que l'immunohistochimie (Figure 3B), RT-PCR, l'hybridation in situ, et / ou Western blot en.
3. L'électroporation Gene Transfer médiée
- Mise en place pour l'électroporation:
- Stériliser une boîte de 100 mm revêtu de verre SYLGARD par autoclavage ou par trempage dans 70% d'éthanol pendant environ 20 min et laisser sécher à l'air dans un banc propre avant de l'utiliser.
- Préparer l'ADN d'un vecteur d'expression de choix en utilisant des kits de maxi- ou Midi-prep appropriées. Les vecteurs d'expression utilisés dans ce protocole sont pIRES2-Atoh1.EGFP et pCLIG-NeuroD1.EGFP. La concentration finale de l'ADN devrait être d'au moins 1 ug / ul dans l'ADN stérile /RNase-free de l'eau.
- Électroporation de l'ADN dans des explants embryonnaires cochléaires:
- Ajouter 10 ul de solution d'ADN plasmidique à une cuvette revêtue Sylgard 100 mm frais et transférer un explant cochléaire entièrement disséqué (obtenu à l'étape 2.5) dans la solution d'ADN.
- Avec surface luminale de l'épithélium vers le haut, incliner légèrement la cochlée de sorte qu'il est perpendiculaire au plan du plat.
- Placer les palettes d'électrodes de chaque côté de la cochlée à palette négative (cathode) vers l'épithélium sensoriel et la palette positive (anode) située adjacente à la base de la cochlée.
NOTE: L'ADN est chargé négativement, il migre de négative à l'électrode positive et en plaçant l'extrémité de cathode de la sonde adjacent à l'épithélium sensoriel; l'ADN sera surtout passer par la surface de l'épithélium sensoriel. - Utilisation électroporateur, livrer 9-10 impulsions de 24 mV, 30 durée d'impulsion ms avec le commutateur de pédale sur til électroporateur, puis ajouter 100 ul de milieu de culture chaude à la cochlée électroporation.
- Répétez les étapes 3.2.1-4 pour tous les explants cochléaires et de l'ADN de tous les gènes d'intérêt et de transférer la cochlée électroporation dans le plat de la matrice revêtu membrane basale pour le placage (étape 2.7). Culture tout le électroporé dans une cochlée 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur humidifié pour des longueurs désirées de temps qui seront ensuite traités par immunocytochimie.
NOTE: La cochlée d'une portée entière de souris CD1 (environ 8 à 12 chiots) peut être isolé, microdissection, électroporation et plaqué dans <4 h.
4. Analyse des cultures d'explants Cochlear
REMARQUE: Les cultures sont incubées pendant 6 généralement DIV qui est équivalent au stade de développement, P0. Après une incubation in vitro, les cultures sont fixées et traitées pour immunocytochimie.
- Après longueur désirée de incubation, retirer le milieu de culture et rapidement rincer l'explant cochléaire dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et incuber à 4% de paraformaldehyde (préparé dans du PBS) pendant 15 min à température ambiante.
- Laver le fixateur en ajoutant du PBS et rincer trois fois dans du PBS pendant 15 min.
- Perméabiliser en utilisant du PBS-T (PBS + 0,5% de Tween) pendant 30 min avant le blocage avec du PBS-T contenant du sérum de chèvre à 10%.
- Incuber dans une solution d'anticorps primaire contenant l'anticorps primaire dans du PBS-T avec du sérum de chèvre à 1% pendant une nuit à 4 ° C.
- Laver trois fois la cochlée à la température ambiante en utilisant du PBS-T 15 min avant d'ajouter l'anticorps secondaire approprié conjugué Alexa.
- Depuis l'explant est cultivé cochléaire sur lamelle de verre, il peut être manipulé individuellement par l'isolement de la lamelle couvre-objet et de la boîte de montage sur une lame. Ceci peut être réalisé par trempage de la boîte de culture dans OS30 solvant pendant au moins 1 heure à température ambiante. Utilisation de la lame de rasoir stérile, détachez la lamelle de la dish et monter sur une lame et de visualiser au microscope à fluorescence.
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Résultats
Nous décrivons une méthode permettant d'isoler la cochlée à partir d'oreilles internes embryonnaires et de la microdisséquer afin de mettre au jour l'épithélium sensoriel. Une fois disséquée, celle-ci peut être mise en culture sous forme de canal cochléaire intact (Figure 3) et analysée par immunohistochimie. Les explants cochléaires en culture constituent un essai utile pour étudier l'effet de divers facteurs solubles et de médicaments pharmacologiques sur le développement cochléaire. Après la dissectio...
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Discussion
Toutes les cellules à l'intérieur du labyrinthe membraneux de l'oreille interne de souris comprenant sensorielle, non sensorielle et les neurones du ganglion spiral sont toutes dérivées du dérivé placodally otocyste situé à côté du cerveau postérieur de l'ectoderme, autour de 10-14 E8. A E11, la région ventrale du otocyste se étend pour former le conduit cochléaire et que le développement se poursuit, un groupe de cellules épithéliales dans la cochlée, ainsi que dans d'autres régions du otocys...
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.
Remerciements
Nous tenons à remercier le Dr Bradley Schulte pour ses commentaires sur ce protocole. Ce travail a été soutenu par la subvention R00 (5R00DC010220) des National Institutes of Health. Ce projet a été réalisé dans un espace de laboratoire rénové soutenu par Grant C06RR014516.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| HBSS | Gibco | 14065-056 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Dulbecco' s Medium modifié | Gibco | 12430-054 | |
| Sérum fœtal bovin | Gibco | 10082 | |
| N-2 Supplément (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Chlorhydrate de ciprofloxacine | Cellgro | 61-277-RF | |
| Plat en verre 60 mm | Kimble Chase | 23062-6015/23064-6015 | |
| Plat en verre 100 mm | Kimble Chase | 23064-10015/23062-10015 | |
| Broches minutien | Outils pour les sciences fines | 26002-15 | |
| Pince Dumont #5 | Outils pour les sciences fines | 11251-10 | |
| Générateur d’impulsions | Protech International Inc | CUY21Vivo-SQ | |
| Boîtes de culture à fond en verre | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Matrice matrigel | BD Biosciences | 356237 | |
| Boîte de culture, 60 x 15 mm | Becton Dickinson | 353037 | |
| Boîtes de culture tissulaire | Greiner Bio-one | 639160 | |
| Solution saline tamponnée au phosphate | Gibco | 10010-023 | |
| OS-30 | Dow Corning | 4021768 | |
| Fluoromount | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Tubes coniques, 15 ml | Greiner Bio-one | 188261 | |
| Myosine 6 | Proteus Biosciences Inc | 25-6791 | |
| Myosine 7a | Proteus Biosciences Inc | 25-6790 | |
| TuJ1 | Sigma | T2200 |
Références
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Réimpressions et autorisations
