Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Détection de True IgE exprimant Souris B cellules de la lignée

10.7K vues

⸱

DOI :

10.3791/52264

⸱

1 décembre 2014

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Rheumatology, Immunology and Allergy, Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

L’analyse in vitro de la recombinaison de commutation de classe chez la souris est difficile en raison des molécules d’IgE cytophiles liées aux récepteurs Fc à la surface des lymphocytes B. Nous décrivons une méthode de détection des IgE utilisant le clivage médié par la trypsine des IgE liées à la surface avant la fixation et la perméabilisation pour la coloration par fluorescence cytoplasmique.

Résumé

B lymphocyte chaîne lourde d'immunoglobuline (IgH) recombinaison de commutation de classe (RSE) est un procédé dans lequel initialement exprimé IgM passe à d'autres isotypes IgH, comme IgA, IgE et d'IgG. Mesure de IgH RSE in vitro est une méthode clé pour l'étude d'un certain nombre de processus biologiques allant de recombinaison de l'ADN et de réparation à des aspects de l'immunologie moléculaire et cellulaire. Dosage in vitro RSE implique la cytométrie de flux surface de mesure expression Ig sur les cellules B activées. Bien que la mesure de sous-classes d'IgA et IgG est simple, la mesure des IgE par ce procédé est problématique en raison de la liaison des IgE à FceRII soluble / CD23 exprimé sur la surface de cellules B activées. Nous décrivons ici un procédé unique pour la mesure précise de cellules productrices d'IgE-B de souris qui ont subi RSE en culture. La méthode est basée sur le clivage de la trypsine à médiation de complexes IgE-CD23 sur la surface des cellules, ce qui permet la détection de l'IgE-production de cellules de la lignée B par cytoplasmic coloration. Cette procédure offre une solution pratique pour l'analyse par cytométrie en flux de la RSE à l'IgE.

Introduction

Au cours de chaîne lourde d'immunoglobuline (IgH) recombinaison de commutation de classe (RSE) chez les souris et les humains, l'IgH μ exons de région constante (Cp) sont supprimés et remplacés par un ou plusieurs ensembles de aval exons de région constante (C H s) (par exemple, Cy, Cε, et Ca), résultant en un passage de la production de IgM à la production d'autres classes d'Ig (par exemple IgG, IgE, IgA ou). RSE se produit au sein de commutateur (S), régions qui sont de 1 à 10 kb séquences situées en 5 'de chaque ensemble de C H 1 s. L'enzyme activation induite cytidine désaminase (AID) lance la RSE par l'activité cytidine désamination.

IgE est un médiateur clé de la maladie allergique 2 et une meilleure compréhension de la façon dont IgE est produit et réglementé peut ouvrir des portes à de nouvelles approches thérapeutiques pour la maladie atopique. Chez les souris et les humains, IgE est l'isotype Ig plus strictement réglementée. IgE est normalement détecté à des niveaux milliers de times moins que les autres IgH ISOTYPES 3, mais peut être très élevé dans quatre états pathologiques. Toutefois, la RSE à l'IgE ne est pas complètement comprise. In vitro l'activation des cellules B à l'aide d'IL-4 en combinaison avec l'anti-CD40 ou LPS, induit à la fois à la RSE IgG1 et IgE 5. Cellules B activées expriment le récepteur de faible affinité IgE FceRII / CD23 2,6, qui se lie IgE soluble sécrétée dans la culture après la RSE. Par conséquent, lorsque l'analyse de cytométrie en flux, les cellules B avec récepteur IgE liée tache similaire à B cellules exprimant de manière endogène IgE 7. Se il est connu que la souris B cellules expriment le récepteur de faible affinité IgG FcγRIIB1 (CD32) 8, dans notre expérience, il ne semble pas interférer avec la mesure de la commutation de classe d'IgG1. Cependant, lors de la mesure IgE commutation après l'activation des cellules B dans la culture, non spécifique lié à la surface IgE peut obscurcir l'analyse. Avec les méthodes de coloration communes, les cellules non-IgE exprimant colorent positivement pour les IgE.

Décrite ici est une stratégie qui a été utilisée pour mener des essais en matière de RSE et de détecter les véritables cellules IgE exprimant B de souris 9-11. Le traitement des cellules B activées avec de la trypsine, un réactif de laboratoire commun pour digérer les protéines, supprime surface à la fois lié à la membrane cytophylic et IgE. Après perméabilisation et une coloration cytoplasmique pour IgE révèle ainsi les véritables cellules productrices d'IgE.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

NOTE: Toutes les expériences décrites ici étaient en accord avec le Comité soin et l'utilisation des animaux institutionnel (IACUC) directives et approuvé par l'Hôpital pour enfants Animal Research (ARCH), Boston, Mass.

1. Préparation des réactifs

  1. 1,000x IL-4 Image: Diluer cytokine IL-4 à 20 pg / ml dans H 2 O ou 0,1% d'albumine de sérum bovin (BSA). Répartir en aliquotes de 200 ul de 1,5 ml microtubes et conserver à -20 ° C.
  2. 1,000x anti-CD40: Obtenir du fabricant à 1,0 mg / ml, conserver à 4 ° C.
  3. B médias de stimulation cellulaire: Pour 425 ml de milieu RPMI-1640, ajouter 75 ml de sérum de veau foetal fraîchement décongelé (FCS), 10 ml de 1,0 M de tampon HEPES, 5 ml de L-glutamine actions, 5 ml Pénicilline: stocks streptomycine, 5 ml milieu essentiel non-acides aminés essentiels ul (MEM-NEAA), et 3,5 minimum de 2-mercaptoéthanol. Rangez les supports à 4 ° C pendant une semaine. Ajouter IL-4 (20 ng / ml) et anti-CD40 (1,0 pg / ml) immédiatement avant l'emploiseulement au volume de support requis.
  4. 2% FCS-tampon FACS: Ajouter 10 ml de FCS à 490 ml de PBS 1x. Conserver à 4 ° C.
  5. 2x solution de trypsine-EDTA: Diluer 5 ml de 10x trypsine-EDTA solution stock (5,0 g trypsine, 2,0 g par litre EDTA) dans 20 ml de PBS 1x. Magasin de trypsine-EDTA à 2x aliquotes de travail à 4 ° C. On laisse réchauffer à température ambiante avant utilisation.
  6. Sérum de veau foetal: Gardez FCS décongelés à 4 ° C pendant jusqu'à deux semaines. Placez sur la glace 15 minutes avant la procédure de coloration cytoplasmique.
  7. Neutre-formol tamponné: Préparer une solution de formaline à 10% (3,7% de paraformaldehyde). Le formol est toxique et donc le manipuler sous une hotte de laboratoire, tout en portant des EPI appropriés. formol de magasin à la température ambiante dans une armoire de stockage de produits chimiques.
  8. Méthanol: Magasin methanol absolu (100%) à -20 ° C jusqu'à ce que les cellules sont prêtes à être perméabilisées. Notez que le méthanol est inflammable et doit être stocké dans un congélateur approprié.

2.La purification et l'activation des cellules B

  1. A partir d'une rate de souris fraîchement récoltées, préparer une suspension de cellules isolées par pressage de l'organe doucement à travers un tamis cellulaire de 70 pm avec le plongeur d'une seringue de 3 ml. Dans un tube à centrifuger conique de 15 ml, de recueillir les cellules dans 10 ml de 1 x PBS et centrifuger à 300 g pendant 5 min à 4 ° C.
  2. Décanter le surnageant et remettre le culot dans 1 ml de Red Blood Cell tampon de lyse pendant 5 min. Neutraliser avec 13,5 ml de PBS 1x et centrifuger à 300 g pendant 5 min.
  3. (Facultatif) séparer magnétiquement les cellules B en utilisant anti-CD45R (B220) marqué à billes, suivant le protocole de purification MACS selon les instructions du fabricant.
  4. Stimuler les cellules B purifiées à 1,0 x 10 6 cellules / ml dans réchauffé médias de stimulation des cellules B contenant de l'IL-4 (20 ng / ml) et anti-CD40 (1,0 ug / ml) pendant 5 jours à 37 ° C. Commencer avec 8 ml de culture divisé en deux puits d'une plaque de culture à 6 puits (4 ml chacune).
  5. Vérifiez culture quotidiennement pour maintenir à 1,0 x 10 6 cellules / ml. Ajuster la concentration en fractionnant dans d'autres puits et la dilution de la culture avec un milieu de stimulation de cellules B contenant des frais d'IL-4 et anti-CD40.

3. trypsine, Fixation et perméabilisation

  1. Trypsinisation
    1. Recueillir jusqu'à 1,0 x 10 7 cellules cultivées de dans un tube conique de 15 ml, centrifuger à 300 g pendant 5 min et décanter le surnageant.
    2. Laver avec 10 ml de PBS pour éliminer la protéine résiduelle dans le milieu de collecte de cellules. Répétez l'étape de centrifugation et décanter le surnageant.
    3. Remettre en suspension le culot cellulaire dans le volume résiduel après décantation (environ 100 pi).
    4. Ajouter avec précaution 800 ul de la température ambiante de 0,1% (2x) de trypsine-EDTA pour les cellules. Verser lentement à un angle sur le côté du tube conique de 45 °.
    5. Fermer le tube et mélanger doucement en inclinant le tube de sorte que le liquide se écoule le long de la longueur du temps le tube 5-6s. Un précipité blanc filandreux peut se former dans la solution. Limiter le temps de traitement à la trypsine en vertu d'une min.
    6. Stopper la réaction de traitement à la trypsine avec 1 ml de FCS froid. Diluer le FCS immédiatement en ajoutant 10 ml de PBS froid.
    7. Centrifugeuse à 300 g pendant 5 min à 4 ° C, puis décanter le surnageant et retrouver les tubes à la glace.
  2. Fixation
    1. Resuspendre les cellules dans le volume résiduel après décantation. Si nécessaire, porter le volume à 100 pi avec du PBS froid.
    2. Dans une hotte, ajouter 800 ul de solution neutre à 10% de formaline tamponnée à pipeter les cellules et de haut en bas. Le tube se réchauffe lors de l'addition de formol. Incuber à 37 ° C pendant 10 min.
  3. Perméabilisation
    1. Mettre en place un mélangeur de paillasse de vortex à une vitesse d'agitation douce.
    2. Dessin 9 ml de froid (-20 ° C) de methanol dans une pipette sérologique de 10 ml.
    3. Tenir le tube contenant les cellules sur le vortex et commencer doucement shaking les cellules.
    4. Ajouter methanol froid pour le tube de sorte qu'il tombe goutte à goutte sur les cellules tandis que le tube tremble encore de sorte que le méthanol est continuellement mélange. Après les 2 premiers ml de methanol la vitesse de distribution peut être augmentée à un lent courant.
    5. Laissez reposer le tube sur la glace pendant 30 min pour achever la perméabilisation. En variante, les cellules peuvent être stockées à -20 ° C pendant jusqu'à un mois.

4. fluorescence Coloration pour IgG1 et IgE commutation Classe

  1. échantillon de Centrifugeuse à 300 g pendant 5 min et décanter la solution de méthanol. Un précipité blanc peut se sédimenter les cellules.
  2. Ajouter 10 ml de la température ambiante 1x PBS et centrifuger à 300 g pendant 5 min pour laver les cellules. Répéter une fois. Remarque: Se laver le culot avec la température ambiante PBS dissout précipité supplémentaire qui peut se former après l'étape 4.1.
  3. Effectuer un lavage supplémentaire avec 10 ml de tampon FACS FCS-2%.
  4. Distribuer des échantillons à un 96 puits ronde plaque de fondet centrifuger à 300 g pendant 5 min. Décanter le surnageant et mettre la plaque sur la glace.
  5. Colorer dans 60 pi de tampon FCS-FACS 2% par puits avec les dilutions d'anticorps suivantes: Anti-IgM RPE / Cy7, 1: 200, anti-IgG1 PE, 1: 600, anti-IgE FITC, 1: 100, anti- CD45R (B220) PerCP-Cy5.5, 1: 200
  6. Après 5 min de la coloration, laver la plaque avec 150 ul de 2% de tampon FCS-FACS et centrifuger pendant 5 min à 300 x g.
  7. Remettre en suspension dans 400 ul de tampon 2% de FCS et FACS pipette à travers un filtre cellulaire en nylon de 40 pm en une 5 ml FACS tube.

5. Utilisez la Stratégie Gating la suite:

  1. Isoler CD45R (B220) cellules positives de la population de lymphocytes dynamitage situé sur la / lot SSC FSC (Figure 1).
  2. A partir des cellules positives B220, utiliser l'intrigue IgE et IgG1 de révéler les populations correspondantes.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Cette procédure a été mise en œuvre avec succès pour étudier la RSE à l'IgE dans les cellules B de souris. Pour démontrer l'efficacité de la mesure de RSE, nous avons stimulé les lymphocytes B spléniques de souris avec des anticorps anti-CD40 et IL-4 comme décrit précédemment 11. Après cinq jours de stimulation, les cellules ont été recueillies et traitées en utilisant le protocole décrit ci-dessus et colorées avec marqué par fluorescence IgM, IgG1, IgE, des anticorps et B220 (CD45R). Fermé sur les ly...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

La stimulation de la rate de souris les cellules B dans la culture avec anti-CD40 et IL-4 simule T auxiliaires de type 2 (T H 2) les interactions, la commutation de classe IgG1 et encourageant de 5 IgE. cellules B peuvent être activés pour la RSE dans le contexte de splénocytes un total de 12 ou de cellules B spléniques purifiées comme 11. Comme indiqué dans le protocole (étape 2.3), l'enrichissement des cellules B est facultative, et est à la discrétion de l'expérimen...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucune divulgation.

Remerciements

DRW est financé par des subventions du NIH AI089972 et AI113217, et par les études Immunologie équipe muqueuses, et titulaire d'une bourse de carrière pour les scientifiques médicaux du Burroughs Wellcome Fund.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Anti-souris IgE FITCBD Pharmingen553415clone R35-72
Rat Anti-souris IgG1 PEBD Pharmingen550083clone A85-1
MethanolBDHBDH1135-4LPMaintenir à -20 ° ; C
Falcon Cell Strainer 40 & micro ; m NylonCorning352340
Falcon Cell Strainer 70 µ ; m NylonCorning352350
Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5eBioscience45-4052-82clone RA3-6B2
anti-Souris/Rat CD40eBioscience16-0402-85clone HM40-3
RPMI Medium 1640Gibco11875-093
HEPES (1M)Gibco15630-080
MEM-NEAA (100x)Gibco11140-050
Solution saline tamponnée au phosphate (10x)Lifetechnologies (Corning)46-013-CM
MACS CD45R (B220) microbilles  ;Miltenyi Biotec130-049-501
Colonne de purification MACSMiltenyi Biotec130-042-401
IL-4PeproTech214-14Reconstituer dans l’eau ou à 0,1 % BSA
Solution de formol, tamponnée neutre, 10 %Sigma AldrichHT501128-4L
Solution trypsine-EDTA (10x)Sigma AldrichT4174-100 ml5,0 g de trypsine, 2,0 g d’EDTA• ; 4 Na par litre de 0,9 % de NaCl
Pénicilline-StreptomycineSigma AldrichP0781-100 ml10 000 U Pénicilline ; 10 mg/ml Streptomycine (100x)
L-Glutamine 200 mMSigma AldrichG7513
2-mercaptoéthanol (99 %)Sigma AldrichM6250-100 ml
Tampon de lyse des globules rougesSigma AldrichR7757
Anti-souris IgM RPE/Cy7SouthernBiotech1140-17clone 1B4B1
HyClone Sérum de veau fœtalThermoSH30910.03
Milieucellules B Le milieu de stimulation des cellules B se compose d’un RPMI avec sérum de veau fœtal (15 %), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2,0 mM L-glutamine,  ; 1x Pénicilline-Streptomycine (Pénicilline : 100 U/ml, Streptomycine : 100 & micro ; g/ml), bêta-mercaptoéthanol (7 & micro ; L/L), IL-4 (20 ng/ml) et anti-CD40 (1 & micro ; g/ml)
de stimulation des

Références

  1. Chaudhuri, J., et al. Evolution of the immunoglobulin heavy chain class switch recombination mechanism. Advances in immunology. 94, 157-214 (2007).
  2. Gould, H. J., Sutton, B. J. IgE in allergy and asthma today. Nature reviews. Immunology. 8, 205-217 (2008).
  3. Winter, W. E., Hardt, N. S., Fuhrman, S. Immunoglobulin E. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 124 (9), 1382-1385 (2000).
  4. Ozcan, E., Notarangelo, L. D., Geha, R. S. Primary immune deficiencies with aberrant IgE production. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 122, 1054-1062 (2008).
  5. Bacharier, L. B., Geha, R. S. Molecular mechanisms of IgE regulation. The Journal of allergy and clinical immunology. 105, 547-558 (2000).
  6. Yokota, A., et al. Two species of human Fc epsilon receptor II (Fc epsilon RII/CD23): tissue-specific and IL-4-specific regulation of gene expression. Cell. 55 (4), 611-618 (1988).
  7. Boboila, C., et al. Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4. The Journal of experimental medicine. 207, 417-427 (2010).
  8. Nimmerjahn, F., Ravetch, J. Fcgamma receptors as regulators of immune responses. Nature reviews. Immunology. 8 (1), 34-47 (2008).
  9. Callen, E., et al. 53BP1 mediates productive and mutagenic DNA repair through distinct phosphoprotein interactions. Cell. 153 (6), 153-1280 (2013).
  10. Wesemann, D. R., et al. Reprogramming IgH isotype-switched B cells to functional-grade induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13745-13750 (2012).
  11. Wesemann, D., et al. Immature B cells preferentially switch to IgE with increased direct Sµ to Sε recombination. The Journal of experimental medicine. 208 (13), 2733-2746 (2011).
  12. Zarrin, A. A., et al. An evolutionarily conserved target motif for immunoglobulin class-switch recombination. Nature immunology. 5, 1275-1281 (2004).
  13. Fan, G., et al. Development of a class-specific polyclonal antibody-based indirect competitive ELISA for detecting fluoroquinolone residues in milk. Journal of Zhejiang University. Science. B. 13 (7), 545-554 (2012).
  14. Perez, O., Krutzik, P., Nolan, G. Flow cytometric analysis of kinase signaling cascades. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 263, Clifton, NJ. 67-94 (2004).
  15. Jamur, M., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 588, 55-61 (2010).
  16. Ishizaka, T., Ishizaka, K. Mechanisms of passive sensitization. IV. Dissociation of IgE molecules from basophil receptors at acid pH. Journal of immunology (Baltimore, MD. : 1950). 112 (3), 1078-1084 (1950).
  17. Erazo, A., et al. Unique Maturation Program of the IgE Response In Vivo. Immunity. 26, 191-203 (2007).
  18. Xiong, H., Dolpady, J., Wabl, M., Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. Sequential class switching is required for the generation of high affinity IgE antibodies. Journal of Experimental Medicine. 209, 353-364 (2012).
  19. Yang, Z., Sullivan, B., Allen, C. Fluorescent in vivo detection reveals that IgE(+) B cells are restrained by an intrinsic cell fate predisposition. Immunity. 36 (5), 857-872 (2012).
  20. Berkowska, M. A., et al. Human IgE(+) B cells are derived from T cell-dependent and T cell-independent pathways. The Journal of allergy and clinical immunology. , (2014).
  21. He, J. -S., et al. The distinctive germinal center phase of IgE+ B lymphocytes limits their contribution to the classical memory response. The Journal of experimental medicine. 210 (12), 2755-2771 (2013).
  22. Keegan, A., Fratazzi, C., Shopes, B., Baird, B., Conrad, D. Characterization of new rat anti-mouse IgE monoclonals and their use along with chimeric IgE to further define the site that interacts with Fc epsilon RII and Fc epsilon RI. Molecular immunology. 28 (10), 1149-1154 (1991).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Cellules B exprimant les IgErecombinaison par commutation de classecytom trie en fluxmarquage intracellulairelymphocytes B de souristraitement la trypsinelimination des IgE de surfaced tection des IgE cytoplasmiquesactivation des cellules Bcommutation d isotype des immunoglobulines
Détection de True IgE exprimant Souris B cellules de la lignée
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.