Méthode simple pour l'ADN fluorescence In Situ Hybridation des chromosomes écrasé

Summary

Ici, nous présentons une méthode simple pour effectuer une hybridation in situ de l’ADN en fluorescence (DNA ISH) pour visualiser des séquences hétérochromatiques répétitives sur des chromosomes montés sur lame. La méthode nécessite un minimum de réactifs et elle est polyvalente pour une utilisation avec des sondes courtes ou longues, différents tissus et la détection avec des signaux basés sur la fluorescence ou non.

Abstract

ADN hybridation in situ (ISH ADN) en est une méthode couramment utilisée pour la cartographie des séquences à des régions spécifiques de chromosomes. Cette approche est particulièrement efficace pour la cartographie des séquences hautement répétitives à des régions hétérochromatiques, où les approches de calcul face à des défis prohibitifs. Ici, nous décrivons un protocole simplifié pour l'ADN ISH qui contourne lavages formamide qui sont des mesures standard dans d'autres protocoles ADN ISH. Notre protocole est optimisé pour l'hybridation avec de courtes sondes d'ADN simple brin qui transportent des colorants fluorescents, qui marquent efficacement des séquences d'ADN répétitives à l'intérieur des régions chromosomiques hétérochromatiques dans un certain nombre de types de tissus de différents insectes. Toutefois, les applications peuvent être étendues à utiliser avec des sondes et la visualisation de séquences d'ADN copie unique (non répétitive) grands. Nous démontrons cette méthode en cartographiant plusieurs différentes séquences répétitives à des chromosomes de Drosophila melanogaster écrasés cellules neurales et Nasoniavitripennis spermatocytes. Nous montrons schémas d'hybridation pour les deux petites sondes, synthétisées dans le commerce et pour une plus grande sonde pour comparaison. Cette procédure utilise des consommables et réactifs de laboratoire simples, et est idéal pour les enquêteurs qui ont peu d'expérience avec l'exécution de l'ADN ISH.

Introduction

ADN hybridation in situ (ISH ADN) en est une méthode couramment utilisée pour la cartographie des séquences à des régions spécifiques de chromosomes. Sondes aux régions à copie unique dans euchromatine peuvent être générés par une poignée d'approches, y compris translation de coupure ou la fin-étiquetage des produits de ^1,2 ADN longues et l'incorporation de deoxygenin (DIG) nucléotides -attached et leur reconnaissance à travers une grande variété de conjugué anticorps-groupe ^1-3. Visualisation des séquences euchromatiques dans peu ou seul numéro de copie nécessite l'utilisation soit simples, grandes sondes ayant une....

Protocol

1. Tissue Dissection et fixation (60 min)

1. Pour cerveaux drosophile, placer 3 ^ème stade larvaire dans une goutte de 1x PBS (tampon phosphate salin). Choisissez grand stade larvaire ^{3 ème} qui sont activement l'exploration à partir des flacons ou des bouteilles qui ne sont pas surpeuplées.
   1. Utilisez une pince à épiler ultrafine paire de se emparer de la bouche des crochets et une autre paire de pince pour saisir 2/3 sur la longueur du corps (figure 1A, B). Tirez doucement sur la bouche crochets pour exposer le cerveau, les ganglions ventrale, glandes salivaires et une partie du tube digestif des larves. Utili....

Results

Pour illustrer cette méthode, nous avons hybridé un ensemble de petits oligos synthétisés dans le commerce qui ont été modifiés chimiquement avec des conjugués fluorescents (figure 2) et une sonde plus biotinylé (fait par translation de coupure d'un produit PCR; Figure 2B), les chromosomes de plusieurs tissus différents types (voir le tableau 1). Les séquences cibles incluses répétitions satellites situés dans les régions péricentromériques (hétérochromatine) de chromos.......

Discussion

ADN ISH est fréquemment utilisé pour cartographier des séquences spécifiques à chromosomes. Nous avons décrit une méthode simple pour l'ADN ISH optimisé pour nombre élevé de copies, séquences hétérochromatiques. Plutôt que d'utiliser des lavages dans une solution de formamide, ce qui est une exigence dans d'autres protocoles ADN ISH existants, on place les lames de tissus montés directement sur un bloc de pré-chauffé pour dénaturer l'ADN. Ce procédé évite l'utilisation de grandes quantités de formami.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lames recouvertes de poly-L-lysine (des lames ordinaires peuvent également être utilisées)	Sigma Aldrich
(calibre 5)	Lames de recouvrement Dumont
22 x 22 mm Fisher			Sigmacote traitée par immersion pendant 15 secondes, en épongeant et en essuyant toute trace de Sigmacote de sorte que la feuille de couverture soit transparente
Papier filtre Sigmacote	Sigma
			75 - 150 mm
			ciré à la paraffine
Bloc chauffant avec thermomètre
Incubateur
Lames de
Chambre			vide boîte à pointes de pipette ou Tupperware, doublée d’essuie-tout humidifié ou
	Coplin		avec rainures à glissière
			d’aluminium
Pipettes
1,5 ml Tubes
Vernis			Micropipette P20 transparente ou colorée
et embouts
Trombones			20 à 25 trombones métalliques standard reliés pour former un chain
Réactifs
16 % paraformaldéhyde de qualité EM	Réactifs
Acide acétique	Sigma
Azote
100 % éthanol, qualité
Oligos synthétisés commercialement, marqués par fluorescence
Sonde longue biotinylée	Invitrogen ; Étapes alternatives 2.7.1-2.7.3		p. ex., Nick traduit et biotinylé avec BioNick d’Invitrogen
Rhodamine-Avidin	Roche ; Etapes alternatives 2.7.1-2.7.3		pour la détection d’une sonde biotinylée longue Tampon d’hybridation
	Recette au-dessus
4x SSCT	Recette au-dessus		citrate salin-sodium + Tween
0.1x SSC	Recette au-dessus		citrate salin-sodium
Solution bloquante	Recette au-dessus
SBT	Recette ci-dessus		SSC, albumine sérique bovine, Tween
1x PBT	Recette ci-dessus solution		saline tamponnée au phosphate + Tween
solution saline tamponnée au phosphate	PBS
Solution hypotonique			de citrate de sodium à 0,5 % dans H2O
Formamide	Sigma Aldrich
Vectashield milieu de montage avec DAPI	Vector Laboratoires