Souris Pneumonectomie modèle de croissance compensatoire Lung

Résumé

La pneumonectomie chez la souris est un modèle couramment utilisé de croissance pulmonaire compensatoire. Cette procédure peut être utilisée en conjonction avec le traçage de la lignée ou des modèles de souris transgéniques pour élucider les mécanismes sous-jacents.

Résumé

Chez l’homme, la réparation et le remodelage perturbés des poumons lésés contribuent à une foule de troubles pulmonaires aigus et chroniques qui peuvent finalement conduire à l’invalidité ou à la mort. Les modèles animaux de réparation et de régénération pulmonaires basés sur les lésions sont limités par des réponses spécifiques aux blessures, ce qui rend difficile de différencier les changements liés à la réponse et à la résolution des lésions des changements liés à la réparation et à la régénération pulmonaires. Cependant, l’utilisation de modèles animaux pour identifier ces voies de signalisation de réparation et de régénération est essentielle au développement de nouvelles thérapies visant à améliorer la fonction pulmonaire après une lésion pulmonaire. Le modèle de pneumonectomie chez la souris utilise la croissance pulmonaire compensatoire pour isoler ces signaux de réparation et de régénération afin de définir plus clairement les mécanismes de re-septation alvéolaire. Ici, nous décrivons notre technique pour réaliser une pneumonectomie de souris et une pneumonectomie simulée. Cette technique peut être utilisée en conjonction avec le traçage de la lignée ou d’autres modèles de souris transgéniques pour définir le mécanisme moléculaire et cellulaire de la réparation et de la régénération pulmonaires.

Introduction

La fonction principale du poumon est de fournir de l'oxygène et du dioxyde de carbone échange entre un organisme et l'atmosphère. Chez l'homme, une multitude de conditions congénitales et acquises entraîner une diminution de la surface des poumons qui résulte de la fonction pulmonaire réduite. Bien que de nombreuses thérapies tels que les corticostéroïdes inhalés, les bronchodilatateurs, l'oxygène supplémentaire, et la ventilation mécanique chronique sont utilisés pour atténuer les conséquences de la fonction pulmonaire ^1-3, la thérapie idéale pour ces conditions serait favoriser la repousse du tissu pulmonaire fonctionnelle - ce est à dire, du poumon régénération.

La régénération de tissu de mammifère a été bien documentée. La tortue-souris africaine peut se régénérer de vastes zones de la peau sans la formation de cicatrices ^4. La phalange distale chez l'homme peut se régénérer après une lésion ou une amputation ^5-7. Suite pneumonectomies (PNX), la croissance du poumon compensatoire se produit chez des souris ^{8, 9} rats, doGS ^{10, 11} et les humains. Par définition, la croissance du poumon compensatoire implique non seulement l'expansion des espaces aériens existants, mais re-cloisonnement de ces espaces aériens élargis avec l'expansion de la microcirculation associée ^12. analyse de l'expression génique a montré que ce modèle récapitule plusieurs des événements de signalisation du développement pulmonaire ^13. Quatre semaines après PNX souris, la surface alvéolaire est équivalente à celle des animaux opérés factices ^14. Dans ce manuscrit, nous décrivons la PNX de la souris et les procédures PNX faux.

Protocole

utilisation déclaration animale:: NOTE Toutes les procédures dans cette étude ont été menées avec l'approbation et en suivant les lignes directrices du Comité des soins (IACUC) Institutionnel utilisation des animaux et à l'Hôpital pour enfants de Cincinnati. Huit semaines C57BL / 6J mâles ont été obtenus auprès de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) et on les laisse se acclimater pendant une semaine avant utilisation. Jusqu'à la chirurgie, les animaux ont été logés dans un établissement de barrière exempts d'agents pathogènes et à condition chow autoclave et filtré de l'eau ad libdium. Chaque cage de la souris a été fournie avec un air dédié et de l'eau, et les chambres ont été maintenus sur un cycle jour-nuit de 12 heures. Après récupération de la chirurgie, les souris ont été maintenues dans des cages avec des sommets filtrées, à condition autoclave chow ad libitum, et à condition que l'eau filtrée à partir d'une bouteille d'eau.

1. Préparation des Instruments

1. Faire six rétracteurs de peau en utilisant trombones et des broches. Twist redressa trombones sur les tiges des broches de papier, ll'avant-toit d'un fil d'acier droite 5 cm à une extrémité et faire un seul 0,5 cm "U" en forme de crochet à l'extrémité du fil.
2. Faire quelques 15 x 15 cm draps chirurgicaux carrés en utilisant une pellicule de plastique. Préparer une vinaigrette par souris. Mettez un tour de papier entre chaque wrap.
3. Stériliser tous les instruments chirurgicaux avec une pile de tuiles 12 x 12 pouces de liège, de la gaze et tampons de coton-tige.

2. Préparation de la souris

1. Induire une anesthésie avec 2% d'isoflurane. Peser animal.
2. Dans une zone de préparation chirurgicale dédiée raser thorax gauche et le cou avec le rasoir électrique.
3. Appliquez une goutte de la déchirure pommade artificielle aux yeux de la souris.
4. Décontaminer cou et du thorax gauche avec de la chlorhexidine et d'alcool isopropylique. Répéter deux fois plus.

3. Souris Oro-intubation trachéale et la ventilation mécanique

1. Avoir une place de technicien chirurgicale non stérile décubitus dorsal de la souris dans la zone chirurgicale préchauffé.
2. Confirmez profondeur de l'anesthésie en documentant l'absence d'une réponse à la patte pincée.
3. Après le lavage des mains et enfiler vêtements chirurgicaux, masque et chapeau, enfiler des gants chirurgicaux stériles.
4. Après le drapage et utilisant une technique aseptique, faire une incision verticale de 1 cm sur la mi-partie antérieure du cou pour exposer le larynx. Rétracter légèrement les muscles de la sangle avec courbes dentelée, 10 cm pince et exposer le larynx et la trachée en écartant les muscles de la sangle avec la pointe d'une paire de ciseaux droites.
5. Insérez oralement un 22 G émoussée pointe angiocathéter dans la mi-trachée (figure 1A) et de confirmer visuellement placement (figure 1B). Maintenir l'anesthésie et ventiler en utilisant 1-3% d'isoflurane travers rongeurs ventilateur (225 pi par course; 200 Stokes par min). Employer une limite de pression de 15 cm H ₂ O.

4. Souris Pneumonectomie

1. Placez la souris dans la position latérale droite de décubitus avec le dos de la souris facel'opérateur (à gauche vers le haut). Utilisez un emballage de plastique auto-obturant comme un champ stérile. Coupe à travers le drap, utiliser contondants ciseaux courbes pressenti pour faire un 2 cm de long coupe parallèle aux côtes lors de la 4 ^ème et 5 ^ème espace intercostal. Insérez l'extrémité incurvée ciseaux émoussés et disséquer la peau loin des côtes sous-jacents et muscles intercostaux.
2. Rentrer la peau avec quatre écarteurs pour exposer un carré 1,5 x 1,5 cm de la fenêtre chirurgicale (figure 2A). Fixez les écarteurs au conseil de liège.
3. Disséquer vers les côtes en utilisant des pinces courbes, et d'utiliser une pointe de la pince courbes d'entrer dans la cavité thoracique.
4. Avec la pointe émoussée micro-ciseaux, utiliser la lame inférieure pour entrer dans la cavité thoracique. Faire une incision de 0,5 cm entre les côtes et la répétition dans la direction opposée.
5. En utilisant les deux écarteurs restants, ouvrir le thorax dans l'axe antéro-postérieur et sécurisé les rétracteurs à le panneau de liège (figure 2B).
6. En utilisant des pinces atraumatiques de courbes dans la main gauche, saisir le poumon gauche et de déplacer la partie supérieure du poumon gauche et en bas latéralement à travers la thoracotomie jusqu'à l'artère pulmonaire gauche et des bronches sont exposés (figure 3A, B).
7. Tenir le titane vasculaire microclip applicateur chargé dans la main droite avec le corps de l'applicateur dans la paume et pointe recourbée pointant loin de la paume (figure 3C), faites glisser le bout de l'applicateur dans le thorax le long de la courbure de la face postérieure de la gauche poumon et clip la bronche gauche et l'artère pulmonaire (Figure 3D).
8. Retirez l'applicateur mais garder le poumon gauche rétractée. Saisir la pointe micro-ciseaux émoussés avec la main droite et couper la bronche et distale de l'artère pulmonaire au clip et retirer poumon gauche (figure 3E).
9. Retirez les rétracteurs de côtes.
10. Utilisez la pince contondants courbes pour pincer la peau de 1 cm inférieurs au incisisur mais au-dessus du niveau de la membrane et insérer un angiocathéter G 24 à travers la peau et dans la cavité thoracique gauche (figure 4A, B).
11. Utilisez 5-0 prolène suture de placer deux points séparés dans le 4 ^ème et 5 ^ème nervures pour fermer la cavité thoracique.
12. Retirez les rétracteurs de la peau. Utiliser deux ensembles de pince pour rapprocher la peau le long de la longueur de l'incision et de la colle la peau fermée.
13. Connectez un 3 ml luer-lock seringue à la angiocathéter et retirer l'air résiduel en appliquant une aspiration douce et le retrait de la angiocathéter.
14. Coller l'incision du cou fermée à l'aide de deux ensembles de pinces comme avant.

5. Souris Sham Pneumonectomie

1. Exposer le poumon gauche comme indiqué dans le protocole "Souris Pneumonectomie". Soulevez la cage thoracique avec le forceps émoussé courbes pour permettre à l'air dans la cavité de la poitrine gauche (figure 5A, B).
2. Placez un G angiocathéter 24 dans le tho gauchecavité Racic comme ci-dessus en faisant attention de ne pas blesser le poumon gauche.
3. Utilisation 5-0 prolène suture et en faisant attention à ne pas percer le poumon (Figure 5C), placez deux longueurs de matériau de suture dans le 3 ^e / 4 ^e et 5 ^e / 6 ^e interstices de nervure (Figure 5D). Placer les deux longueurs de matériau de suture avant de l'attacher à réduire les risques de hernie du poumon gauche. Attachez le matériel de suture pour faire deux points de suture interrompue (figure 5E).
4. Collez la peau sur l'incision thoracique, retirer l'air résiduel avec le angiocathéter, et collez l'incision du cou comme ci-dessus.

6. réanimation, analgésie, et récupération

1. Éteignez l'isoflurane, et administrer 0,1 mg / kg de buprénorphine et 0,5 ml de solution saline normale voie sous-cutanée.
2. Lorsque la respiration spontanée reprendre, retirer la sonde d'intubation.
3. Observez la souris jusqu'à ce qu'il soit à nouveau ambulatoire. Marcher RESUM généralementes plusieurs minutes après le retrait de la sonde endotrachéale.
4. Placez la souris dans un 27 ° C incubateur (humidifié, 25% d'oxygène) pour récupérer O / N.
   NOTE: Nous mettons plusieurs pastilles de chow mouillée avec de l'eau sur le sol de la cage pour les 24 premières heures après la chirurgie.
5. Administrer 0,1 mg / kg de buprénorphine par injection intraperitoneale deux fois par jour pendant trois jours après la chirurgie. Prenez soin de ne pas ouvrir le site chirurgical lors de la manipulation des animaux.

7. Suivi de la souris

1. Peser les souris à 1, 3, 5, et 7 jours après la chirurgie.

Résultats

. Une parcelle de PNX et le poids de souris subi une opération fictive est fourni à la figure 6 Dans nos mains, la survie est toujours de 95 à 100% pour les deux PNX et imposture pneumonectomie. Pour une description de la façon dont le poumon droit re-pousse dans ce modèle et l'évolution dans le temps prévu, nous renvoyons le lecteur aux manuscrits de Gibney et al. ¹⁵ et Wang et al. ¹⁴

Plusieurs écueils les plus courants doivent êt...

Discussion

Nous avons fourni la description la plus détaillée des procédures de PNX de PNX de la souris et de la souris faux rapportés à ce jour. Nous avons fait le lecteur au courant de plusieurs des écueils les plus courants que les enquêteurs de la procédure d'apprentissage rencontrent couramment, et nous avons présenté plusieurs techniques développées par notre laboratoire pour atténuer ces écueils. D'autres laboratoires qui utilisent ce modèle peuvent avoir développé d'autres modifications de technique ou d'ut...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Applicateur à clip vasculaire de 6 pouces	Teleflex Medical (WECK)	137062
Horizon petit clip rouge titane	Teleflex Medical (WECK)	1201
Pince incurvée à motif étroit 12 cm	Outils de science fine	11003-12
Pince Graefe dentelée incurvée 10 cm	Outils de science fine	11052-10
Porte-aiguille	CastroviejoFine Science Tools	12565-14
Ciseaux droits 9 cm Strabisme (pointe émoussée)	Fine Science Tools	14075-09
Ciseaux fins trempés droits 8,5 cm	Fine Science Tools	14090-09
Pointe droite et émoussée Ciseaux à ressort Cohan-Vannas	Fine Science Tools	15000-12
Colle pour peau	Gluture	32046
22 G Angiocathéter
24 G Angiocathéter
3 ml Seringue
4 Écarteurs
2 Écarteurs
5-0 Prolene sur aiguille coupante incurvée	Ethicon	8698G
0,5 ml Seringue sur aiguille
Saline
Buprénorphine
Press-n-Seal wrap	Glad Products Company
12 x 12 pouces Pile de panneaux de liège	Office Depot
70 % Ethanol
Bétadine
Ventilateur de souris	Hugo Sachs Elektronnik	Minivent Type 845
Vaporisateur d’isoflurane	OHMEDA	Excel 210 SE
Pommade pour larmes artificielles	Puralube	NDC : 17033-211-38

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