Évaluation de la sélective ARNm traduction dans les cellules de mammifères par polysome profilage

Régulation de la synthèse protéique (traduction) est un processus cellulaire clé qui est intimement liée à la survie cellulaire. Étant donné que la traduction consomme plus de 50% de l'énergie de la cellule, il est peu surprenant que la traduction est strictement réglementée et que les perturbations dans la traduction ne sont pas bien toléré. En revanche, de nombreux processus cellulaires aberrantes exiger que la machinerie de traduction et de sortie de traduction (par exemple du protéome) doivent être modifiés. Cela est souvent le cas dans divers états d'intervention et de stress, les maladies et est probablement le meilleur exemple dans le cancer. Un avantage clé de contrôle de la traduction est la capacité des cellules à reprogrammer rapidement la production de la protéine en réponse à différents déclencheurs externes et internes, le mécanisme de réglage fin ainsi que pencher la balance entre la survie et la mort cellulaire ^1.

Deux aspects de contrôle de la traduction sont particulièrement intéressants; la compréhension de la nature de la régulation mechanism (s) et de contrôle des éléments qui permettent de traduction spécifique, et l'identification des ARNm spécifiques et de leurs produits de protéines qui participent à la réponse cellulaire à la gâchette particulier qui a suscité traduction sélective en premier lieu. Polysomes profilage est une technique qui permet d'étudier efficace des deux processus.

L'objectif global de la technique polysome de profilage est d'étudier et de quantifier l'état de la traduction des ARNm spécifiques dans des conditions cellulaires. Le principe de la technique est de capturer traduction de l'ARNm par '' geler '' ribosomes traduisant activement sur différents transcrits et séparer les polyribosomes résultant par ultracentrifugation sur un gradient de saccharose, ce qui permet d'établir une distinction entre les transcriptions très traduits (liée par plusieurs ribosomes) et les mal traduit (lié par un ou deux ribosomes). Dans ce protocole particulier, le cycloheximide antibiotique qui se lie à la60S de la sous-unité ribosomique et bloque la libération de déacétylé ARNt du site E ribosome ^2, est utilisée pour inhiber la translocation du ribosome et caler ribosomes sur les ARNm de traduction. Cependant, d'autres agents de blocage, tels que l'émétine cette traduction aussi des blocs allongement ^3, peut être utilisé.

Contrairement à la Western blot et ³⁵ S-méthionine techniques de marquage qui mesurent le résultat final du processus de traduction, polysome profilage a l'avantage de mesurer les ribosomes association avec des ARNm activement traduits, ce qui permet une étude plus détaillée des mécanismes de traduction dans différentes conditions. Par conséquent, la technique peut être facilement adapté pour étudier spécifiquement les différents modes de traduction ^4-6, facteurs de protéines impliquées dans la régulation de la traduction ^7-9, les conditions de stress affectant la synthèse des protéines ^1,10,11 ou les effets des structures d'ARNm tels que IRES ou en amont cadres de lecture ouverts sur la protéine synthéSIAE ^12-14. Aujourd'hui, polysome Profilage des applications sont encore plus large avec l'utilisation de puces à ADN ¹⁵ ou séquençage de nouvelle génération ^16,17 à analyser polysomes associés ARNm.

NOTE: Une note sur le travail avec ARN: Prendre les précautions habituelles contre la dégradation de l'ARN par RNases. Utiliser des gants, des conseils barrière de pipettes, vaisselle en plastique sans RNase et les produits chimiques dans toutes les étapes du protocole. Utilisation ultra pure ou de l'eau traitée au DEPC pour toutes les solutions. Décontaminer les surfaces présumés avec une solution d'inactivation RNase suivant le protocole du fabricant.

1. Préparation des solutions.

1. Préparer 500 ml d'une solution de base (0,3 M ^NaCl;. 15 mM MgCl _2, 6H ₂ O, 15 mM Tris-HCl, pH 7,4). Mélanger à l'aide d'une barre d'agitation jusqu'à ce que la solution est limpide et passer à travers un filtre de 0,45 um. Entreposer à la température ambiante.
2. Préparer 10 et 50% et les solutions de saccharose à 60% Solution de Chase comme suit:
   1. Pour la solution de saccharose 10% (p / v), dans un tube de 50 ml Centrifugeuse ajouter 5 g de saccharose et de remplir à 50 ml avec la solution de base. Pour 50% de saccharose Solution (p / v), dans un tube de centrifugeuse de 50 ml annonced 25 g de saccharose et de remplir à 50 ml avec la solution de base.
   2. Pour 60% (p / v) de solution de Chase, dans un tube à centrifuger de 50 ml, ajouter 30 g de saccharose et de remplir à 50 ml avec la solution de base. Ajouter 100 ul de solution de bleu de bromophénol saturé (ajouter du bleu de bromophénol à l'eau jusqu'à ce qu'il ne se dissolve plus; centrifugeuse pour sédimenter la poudre non dissoute) à la solution de chasse de 60%. Mélanger à l'aide d'un vortex et vérifier une dissolution complète.
   3. solutions de conserver à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
3. Préparer du tampon de lyse d'ARN. Préparer ce tampon frais le jour de l'expérience. Préparer 500 ul de tampon de lyse d'ARN de chaque échantillon. A 1 ml de la solution de base ajouter 10 ul de Triton X-100 (1% [v / v] finale), 1 ul de 100 mg / ml dans du DMSO cycloheximide (CHX, 0,1 mg / ml final) et 3,5 ul de RNasin (140 U / ml). Mélanger à l'aide d'un vortex. Garder sur la glace.
   REMARQUE: cycloheximide est hautement toxique et peut causer des mutations. Eviter le contact de la peau et l'inhalation. Pour éviter de manipuler la forme de poudre trop souvent, préparationsont une plus grande quantité de 100 mg / stock ml dans le DMSO, aliquote et garder à -80 ° C pour le stockage à long terme. Gardez stock de travail à -20 ° C.
4. Le jour de l'expérience, la préparation des solutions de saccharose + CHX CHX par l'ajout (concentration finale de 0,1 mg / ml) au volume désiré de 10% et une solution de saccharose à 50% (~ 7 ml de chaque solution par gradient).

2. Préparation de gradient de saccharose utilisant une machine automatisée Gradient

1. Tournez le gradient fabricant '' ON '' et le niveau de la plaque qui tiendra les gradients (criticalstep!) Cliquez sur '' Terminé '' lorsque la plaque est nivelé.
2. Sélectionnez dans le menu le programme gradient à être exécuté:
   1. Appuyez sur '' menu 'GRAD' et sélectionnez '' LISTE ''.
   2. Sélectionnez "SW41".
   3. Faites défiler la liste et sélectionnez l'option ''10 - 50% de dénivelé - 11 étapes "programme" par la pressesur le bouton '' RUN ''.
3. Placez un tube conique d'ultracentrifugation (SW-41 tube 14 x 89 mm) dans le bloc Marker et utiliser le marqueur du tube amende prévue pour tracer une marque sur le tube le long de la marche supérieure de l'édifice du marqueur. Placer les tubes dans un rack de montage sur une surface stable.
   NOTE: Cette marque sera le guide de remplissage pour la superposition des solutions de saccharose 10 et 50%.
4. Fixez la canule deux fourni à deux seringues de 10 ml et laver par aspiration et refoulement d'eau chaude distillée contenant une solution d'inactivation RNase. Assurez-vous d'enlever toutes les traces de l'eau par la suite.
5. Remplir une des seringues avec 10% de saccharose + CHX et insérer la canule à l'extrémité inférieure du tube d'ultracentrifugation. Passer doucement solution à 10% de saccharose jusqu'à ce que il va juste passé la marque faite sur le tube.
   REMARQUE: Évitez de faire des bulles. Si des bulles se forment, tapotez doucement le tube pour les déplacer.
6. Remplir l'autre seringue avec 50% de saccharose + CHX, essuyez le liquide de congé supplémentaireavec une lingette doucement et insérer la canule à l'extrémité inférieure du tube d'ultracentrifugation. Passer doucement la solution de saccharose à 50% jusqu'à ce qu'il atteigne exactement la marque. Éliminer rapidement et en douceur la canule.
   NOTE: Les 10% de saccharose devrait augmenter dans le tube et former un ménisque au sommet. Dans le cas contraire, ajouter plus de solution de saccharose à 10% à la surface.
7. Insérez le capot de protection fourni par l'inclinaison du tube d'ultracentrifugation légèrement et déplacer toutes les bulles d'air. Retirer l'excès de liquide dans le réservoir de la casquette avec une micropipette.
8. Essuyez l'excès de liquide le long de la paroi du tube et le placer sur la plaque gradient de fabricant.
9. Appuyez sur le bouton '' RUN ''.
   REMARQUE: La plaque incliner l'angle spécifié, une pause de 5 secondes et les rotations pour former le gradient va commencer.
10. Lorsque la formation est terminée gradient (environ 2 min, la machine émet un signal sonore), retirez délicatement le ultracentrifugation (s), Placer sur une grille et retirer rapidement bouchon dans un mouvement vers le haut pour éviter de perturber le Gradient.
11. Gardez gradient (s) sur la glace. Ne pas déranger! Alternativement, les gradients garder une nuit à 4 ° C.
12. Sinon, utilisez un gradient fabricant de deux chambre pour faire des dégradés comme suit:
    1. Rincer les tubes et gradient fabricant avec une solution RNase d'inactivation et de l'eau sans RNase.
    2. Ajouter 5 ml de saccharose à 50% + CHX à la chambre proximale du fabricant gradient et veiller à ce que l'air entre les deux chambres est retiré.
    3. Ajouter 5 ml de saccharose à 10% + CHX à la chambre distale du fabricant gradient.
    4. Ajouter 0,5 ml de saccharose à 50% + CHX à fond d'un tube de centrifugeuse conique (SW-41 tube 14 x 89 mm) et mettre dans le porte tube.
    5. Mettez agitateur placé dans la chambre proximale, ouverts robinets d'arrêt et le gradient de dépôt à une vitesse réglée à "3" (environ 1 ml / min).
    6. Lieu gradient (s) sur la glace. Ne pas déranger.
       NOTE: Les dégradés peuvent être conservés une nuit à 4 ° C.

3. lyse cellulaire et ultracentrifugation.

Placez SW-41 rotor et seaux à 4 ° C et mis en centrifugeuse à 4 ° C.
NOTE: La procédure de lyse cellulaire est optimisée pour deux 150 mm subconfluente (~ 70-80% de confluence) plaques de cellules HEK293 par gradient et les volumes utilisés peut être nécessaire d'ajuster de différentes lignées cellulaires.
1. cellules de la plaque à la densité de cellules appropriée dans le milieu de croissance d'au moins 24 heures avant la lyse.
2. Préparer une partie aliquote (20 ml par plaque de 150 mm) de milieu de croissance contenant 0,1 mg / ml CHX.
3. Incuber les cellules dans CHX + médias (20 ml par plaque de 150 mm) pour 3 min à 37 ° C / 5% de CO ₂ d'arrêter et de stabiliser polysomes.
4. En travaillant rapidement, les médias aspirer de plaques, placer les plaques sur la glace et laver les cellules une fois avec 10 ml de glace froide phosphate salin (PBS: NaCl 137 mM, 2,7 mM de KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 1,8 mM KH ₂ PO ₄₎ complété avec CHX (concentration finale de 0,1 mg / ml) en faisant attention à la pipette lentement le side de la paroi de cuvette afin de minimiser le levage de la monocouche cellulaire.
5. Aspirer le PBS et ajouter un supplément de 10 ml de PBS + CHX pour chaque plaque, gratter les cellules avec un dispositif de levage de pile et transférer le volume total à partir de deux plaques d'un tube de centrifugeuse de 50 ml sur de la glace. Maintenir 1 ml de suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse sur de la glace pour l'analyse des protéines en aval.
6. Centrifuger le tube de 50 ml de cellules à 300 xg à 4 ° C pendant 10 min.
7. Retirez tous PBS et remettre le culot dans 500 pi de tampon de lyse glace d'ARN froid.
8. Transfert suspension de cellules dans un tube de 2 ml à centrifuger.
9. Introduire à la pipette de haut en bas afin de lyser les cellules et incuber sur de la glace pendant 10 minutes avec tourbillonnement occasionnel.
10. Centrifuger à 2000 x g à 4 ° C pendant 5 min pour sédimenter les noyaux.
11. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 2 ml à centrifuger.
12. Centrifuger à 17 000 xg à 4 ° C pendant 5 min pour sédimenter les débris cellulaires.
13. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 2 ml à centrifuger et utiliser 2 pi à mesurerdensité optique à 260 nm (l'utilisation de la mémoire tampon de lyse comme blanc).
14. Retirer 50 pi (10% du total) de chaque échantillon pour l'analyse de l'ARN total. REMARQUE lysat peut être stocké à -80 ° C jusqu'à utilisation.
15. Charger doucement unités de A260 égale sur chacun des gradients de saccharose (10 min, OD OD 25 optimales, à un volume maximal de 500 pl;. Lysat concentré dilué avec du tampon de lyse supplémentaire si nécessaire).
16. Veiller à gradients sont de 0,1 g de l'autre avant l'ultracentrifugation.
17. gradients de centrifugation à 39 000 rpm (260 343 xg) pendant 1,5 h à 4 ° C.
18. Pendant spindown garder frein de rotor et sur l'éteindre pendant la décélération quand il atteint 1000 rpm.
    REMARQUE: Cette étape minimise toute perturbation des gradients causés par des changements brusques d'accélération que les têtes de brosse en contact avec le rotor pendant le freinage.

4. Gradient système fractionnement Instrument Set-up.

1. Mise en place de l'instrument et les vierges spectrophotometer avec de l'eau comme suit:
   1. Allumez les composants et laisser la lampe à chauffer pendant au moins 15 min.
   2. Assurez-collecteur de fractions est réglé sur la méthode «polysome» (Dossier de presse de l'icône deux fois; retour flèche à deux reprises pour revenir à l'écran d'accueil).
   3. Assurer la vanne sur le collecteur de fraction est fixée à perdre (flèche pointant vers poubelle icône). Placer dans un ballon Erlenmeyer de 250 ml contenant de l'eau distillée sous le tube de collecte des déchets.
   4. Sélectionnez les paramètres suivants sur l'enregistreur graphique: régler la sensibilité à composer «LAMP et Optique SET»; mettre filtre commutateur de bruit pour '1.5'; réglez la molette de séparation de pointe sur "OFF"; réglez la molette de la vitesse de défilement '30 cm / h "(5 cm / 10 min); Définir la référence Régler ligne (sur le dessus de l'unité de spectrophotomètre) à «MAX OUVERT».
      NOTE: En option: Un logiciel d'enregistrement numérique peut être utilisé à la place de l'enregistreur. Sur l'ordinateur, cliquez sur «Démarrer». Une fenêtre d'acquisition ouvrir: sous eMenu e Options, décochez graphiques de pause. Sous Échelle, définir les limites du graphique à -10 et 100 (peut être changé sur la volée pendant l'exécution). Cliquez sur le bouton Enregistrer pour créer un nouveau fichier et enregistrer la course.
   5. Placez la seringue et le canon dans la pompe et serrer en place (utilisation des vis fournies et la clé Allen).
      REMARQUE: Ne serrez pas trop.
   6. Remplir la seringue avec Chase Solution en utilisant le '' REV '' commande à vitesse RAPID. Placez la pompe en position verticale et chasser l'air à travers le tuyau à l'aide 'Forward' 'commande'. Seulement une utilisation rapide pour cette fonction et lavages.
   7. Installez un tube d'ultracentrifugation rempli d'eau sans RNase.
   8. Pierce tube d'ultracentrifugation avec la canule jusqu'à ce que les deux marques noires sont visibles (le trou distribution se trouve entre ces deux marques) et démarrer la pompe à seringue sur '' Manuel '' à 6,0 ml / min.
   9. Lorsque l'eau passe à travers la cellule d'écoulement (lorsque csolution hase remplit 1/3 du tube), la vitesse de commutation de variable et fixé à 1,0 ml / min.
   10. À un taux de 1,0 ml / min, régler la base Réglez ensuite sur le spectrophotomètre jusqu'à ce que la tension sur la carte est à zéro (+/- 0,5 unité).
       Remarque: Respecter la sortie de l'eau du tuyau d'évacuation dans l'erlenmeyer.
   11. Réglez la sensibilité à la '0.5' ou '1.0' UA.
       REMARQUE: 1.0 UA fonctionne le mieux pour 10 unités de DO dans une pente de 10 ml. Si OD est inférieure à 10 ", 0,5" sensibilité peut être utilisée pour renforcer le signal.
   12. Appuyez sur le bouton Auto de base et ajuster le réglage de la barre des 10% sur l'enregistreur graphique de base en tournant la molette de l'enregistreur de décalage (en option si vous utilisez un enregistreur numérique).
   13. Une fois une ligne de base stable est atteint, mettre l'interrupteur de la pompe sur "OFF" et le sélecteur de vitesse de défilement de 60 cm / h si vous utilisez enregistreur graphique analogique ou "OFF" si vous utilisez un enregistreur numérique.
   14. Récupérer la solution Chase en passant pompe à 'REPosition V '(si nécessaire on peut augmenter le taux de reflux à 6,0 ml / min ... NE PAS UTILISER RAPID) jusqu'à ce qu'il atteigne la première marque sur la canule de perçage.
   15. Retirer le tube de la centrifugeuse et chasser les bulles d'air au sein de la canule en exécutant un peu de la solution Chase à travers elle. Essuyez le propre de l'étage de perçage.
       NOTE: Certains eau résiduelle pourrait fuir de la cellule d'écoulement.

5. fractionnement en gradient et la collecte des échantillons.

1. Installation et percer le tube de centrifugeuse contenant le gradient de saccharose.
2. Placez onze 2 ml microtubes dans la fraction collecteur positions de plateau 1-11 tels que les bouchons ne dépassent pas vers le haut. Remplacer '' le tube N ° 1 '' pour l'instant avec un '' tube de déchets '' pour recueillir tout liquide restant dans la tubulure de collecteur.
3. Réglez la molette de commande de la pompe à «Manuel» et le débit de la pompe à seringue à '6,0 ml / min' Appuyez sur l'icône «Play» sur le collecteur de fraction. Dès que le bras atteint le premier tube, appuyez sur le bouton '' pause '' (ce sera positionner le bras et ouvrir la vanne de fraction-distribution).
4. Démarrer la pompe en utilisant la commande '' 'de l'avant »et surveiller graphique stylo enregistreur. Quand il commence à dévier vers le haut (en indiquant que l'échantillon passe à travers la cellule d'écoulement du spectrophotomètre), remplacer rapidement '' tube de déchets '' à '' tube n ° 1 ''.
5. Lorsque la première goutte est recueillie, passer rapidement les commandes à 'Remote Start / Stop', '' variable (1,0 ml / min) '' et appuyez sur '' Play '' icône.
   NOTE: La pompe est maintenant contrôlé par l'interface fraction de collecteur et fractions de 1 ml seront recueillis tous min.
6. De ce point sur, lectures A260 apparaîtront sur l'interface de l'enregistreur numérique (ou la carte analogique Recorder). Assurez-vous que le '' Enregistrer '' bouton sur le logiciel est pressé!
7. Après que la solution Chase bleu pénètre dans le tube collecteur ou le dernier tube (généralement tube 11), appuyez sur l'icône "Stop".
   REMARQUE: La valve de distribution doit basculer sur la vanne de déchets.
8. Gardez fractions sur la glace jusqu'à ce que tous les gradients ont été fractionnés. A la fin des fractions de jour peut être stocké à -80 ° C avant l'isolement de la protéine ou de l'ARN. Si la protéine et ARN analyse est nécessaire, coupez chaque fraction de moitié (500 pi chacun pour les protéines et l'analyse de l'ARN).

6. Laver

NOTE: (cette étape est facultative doivent être effectuées que si plusieurs gradients doivent être collectés).

1. Plonger le tuyau d'évacuation dans l'erlenmeyer contenant environ 50 ml d'eau ultra-pure et inverser la pompe en utilisant un débit de 6 ml / min.
2. Arrêter la pompe lorsque la solution Chase atteint la première marque on la canule de perçage.
3. Retirer le tube de la centrifugeuse, chasser l'air de la canule et nettoyer la scène de piercing.
   NOTE: Certains eau résiduelle pourrait fuir de la cellule d'écoulement.
4. Répétez la procédure de fractionnement à partir de l'étape 5.1.

7. nettoyage final.

1. Déconnecter le tuyau de pompe à partir de la partie inférieure de l'organe de perçage et de pomper la solution de Chase dans un tube à centrifuger de 50 ml en utilisant le réglage de l'écoulement rapide. Conserver la solution Chase à 4 ° C comme il peut être réutilisé.
2. Relier le tuyau de la pompe à un système de tuyauterie à 3 voies et fermer la soupape conduisant à la seringue. Se connecter un tuyau à une seringue de 50 ml rempli d'eau distillée et l'autre tube à la base de l'organe de perçage.
3. Installez le tube d'ultracentrifugation utilisé pour l'étape de découpage et de passer au moins 50 ml d'eau distillée à travers le spectrophotomètre et le tube collecteur (commutateur au menu de collection sur l'interface en cliquant sur le '' Start / Pause '' icône).
4. Retirer le tube, seringue (utilisation clé Allen pour retirer les vis) et tous les autres composants amovibles et laver abondamment à l'eau chaude du robinet, puis rincer avec de l'eau ultra-pure.
   REMARQUE: Faites attention lors du lavage du piston, cylindre, tube et percer canule.
   REMARQUE: Manipulez le corps de la seringue en verre avec précaution! Conservez tous les composants de la poussière.
5. Essuyez fond de la cellule d'écoulement avec un tissu doux imbibé d'eau distillée. Essuyez le plateau fraction de collecteur et d'autres zones où le saccharose peut avoir été renversé.

8. Isolation d'ARN à partir de fractions de saccharose.

1. Préparer 50 ul de solution à la protéinase K pour 1 ml de la fraction de saccharose (37,5 ul de 10% de SDS, 7,5 pi d'EDTA 0,5 M, 1 ul Glycoblue, 4 pl de 20 mg / ml de protéinase K).
2. Dans 2 ml de tube à fond plat, incuber une fraction ml de saccharose à 50 ul de solution proteinase K à 55 ° Cpendant 1 heure (si vous utilisez fractions de 500 pi régler le volume de solution protéinase K en conséquence).
3. Ajouter un volume égal de phénol: chloroforme: alcool isoamylique (125: 24: 1, de préférence d'acide (pH 4,5) afin de minimiser la contamination de l'ADN) pour les fractions de saccharose.
   NOTE: Ajouter un supplément de 200 pi de chloroforme à des fractions 7-10, car ils sont plus lourds et phases pourraient se inversé.
   REMARQUE: phénol / chloroforme peut provoquer des brûlures en cas de contact et l'inhalation. Porter une blouse de laboratoire, lunettes de sécurité, et utiliser une hotte.
4. Vortex ~ 30 sec et centrifuger à la vitesse maximale pendant 5 minutes à température ambiante.
5. Retirez ~ 80-90% de phase aqueuse (ne pas toucher interphase qui pourrait contenir de l'ADN génomique) et à New tube.
6. Ajouter un volume égal de chloroforme et répétez l'étape 8.4.
7. Retirer phase aqueuse en prenant soin d'éviter interphase.
8. Ajouter 01:10 volume de 3 M d'acétate de sodium, pH 5,2 (en variante, 5 M d'acétate d'ammonium peut être utilisé).
9. Ajouter 1,5 volumes de frais, absolute éthanol et vortex pendant 15 secondes.
10. Précipiter la nuit à -20 ° C (ou 1 heure à -80 ° C si pressé).
    REMARQUE: Les échantillons peuvent être laissés à -20 ° C pendant plus longtemps si nécessaire.
11. Centrifuger à vitesse maximale pendant 30 minutes à 4 ° C.
12. Laver le culot avec 1 ml d'éthanol glacé à 70% sans RNase.
13. Air sécher le culot et remettre en suspension dans 20 pi d'eau sans RNase.
14. Quantification de l'ARN total par spectrophotométrie afin d'assurer le rendement et la pureté (sur la base A260 / rapport 280) adéquate et procéder à une analyse par RT-PCR quantitative en utilisant la norme ¹⁴ volumes égaux de chaque fraction et les amorces de PCR spécifiques pour l'ARNm (s) d'intérêt.

9. L'isolement de protéines à partir de saccharose fractions.

1. En plus de l'ARN, les protéines peuvent être isolées et identifiées dans les fractions de polysomes individuels. Utilisez l'un des nombreux excellents protocoles disponibles pour l'isolement des protéines, par exemple ^18.

Nous avons récemment décrit un nouveau rôle pour le suppresseur de tumeur PDCD4 comme un inhibiteur sélectif de la traduction des ARNm codant pour des inhibiteurs apoptotiques XIAP et Bcl-xL 12 IRES-hébergement. Profilage polysome était une technique clé pour démontrer l'implication spécifique de PDCD4 dans la traduction IRES-médiation. Les cellules HEK293 ont été transfectées de manière transitoire pour épuiser les niveaux endogènes de PDCD4 (figure 1A) et ensuite soumis à une analyse polysomes profil. Nous avons observé que la réduction des niveaux de PDCD4 ne portent pas atteinte à la traduction cellulaire mondial, à en juger par l'absence de changements dans le profil de polysome lorsque l'on compare siCTRL et siPDCD4 cellules traitées (figure 1B). De même, la distribution de polysomes IRES non-XIAP variant de 19 est resté inchangé entre les cellules traitées et non traitées (Figure 1C). En revanche, polysome distribution des ARNm deux IRES-hébergeant, XIAP et Bcl-xL, a été modifiée de façon significative. En l'absence de PDCD4 la distribution de ces deux ARNm est décalé dans ribopolysomes lourds (figure 1D, E). Depuis ce ne soit pas accompagnée de changements dans les niveaux de XIAP et Bcl-xL ARNm (figure 1F) ces résultats à l'état stationnaire démontrent une amélioration de la traduction de la protéine XIAP et Bcl-xL dans les cellules avec des niveaux réduits PDCD4, qui a été confirmée par Western blot (Figure 1G).

Figure 1:. Polysomes profilage identifie PDCD4 comme inhibiteur sélectif de la traduction XIAP et Bcl-xL (A) des cellules HEK293 ont été traitées avec ou PDCD4 siRNA contrôle (CTRL), le siRNA ciblant non, lysées et soumises à une analyse Western blot avec des anticorps anti-PDCD4 et des anticorps anti-nucléoline de vérifier l'étendue de PDCD4 knock-down. (B) PDCD4 a été renversé comme dans (A) etLes lysats cellulaires ont été soumis à des polysomes profilage. Profil de polysome représentatif est montré dans le panneau supérieur; la distribution de l'IRES de XIAP non (C), Bcl-xL (D), et d'IRES de XIAP (E) par rapport à celui des ARNm de GAPDH est représenté comme le pour cent de l'ARNm total (% de l'ARNm) dans chaque fraction. (F) Steady les niveaux d'ARNm -state ont été mesurés par RT-PCR quantitative en PDCD4 siRNA ou de contrôle (CTRL) siRNA cellules traitées. (G) Les lysats provenant de (A) ont également été soumis à une analyse Western blot avec des anticorps anti-XIAP, anti-Bcl-xL, et anticorps anti-nucléoline. (NB. Les données présentées dans la figure 1 ont été à l'origine publié en 12) Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.