Article de méthode

In vitro caractérisation fonctionnelle de la souris colorectal afférente Endings

DOI :

10.3791/52310

⸱

21 janvier 2015

 , 
1Center for Pain Research, Department of Anesthesiology, University of Pittsburgh

Dans cet article

Résumé

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Cette vidéo présente un protocole pour la réalisation d’enregistrements électrophysiologiques à fibre unique sur une préparation in vitro du nerf colorectum de souris.

Résumé

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Cette vidéo montre en détail une seule fibre protocole d'enregistrement électrophysiologique in vitro en utilisant une préparation souris rectum nerf. L'approche permet l'identification et la caractérisation fonctionnelle impartiale des afférences colorectal individuels. Enregistrements extracellulaires des potentiels d'action (PA) à multiplication qui proviennent d'une ou de quelques afférents (par exemple, une seule fibre) champs récepteurs (RFS) dans le rectum sont fabriqués à partir taquiné faisceaux de fibres nerveuses. Le cancer colorectal est retiré avec soit le pelvienne (PN) ou lombaire splanchnique (LSN) nerf attachée et ouvert longitudinalement. Le tissu est placé dans une chambre d'enregistrement, goupillé plat et perfusé avec une solution oxygénée de Krebs. Stimulation électrique focale est utilisé pour localiser les terminaisons afférentes colorectaux, qui sont ensuite testés par trois stimuli mécaniques distinctes (émousser sondage, muqueuse caresser et de se étirer circonférentielle) de classer fonctionnellement les afférences en cinq mechanosensiles classes tifs. Fins répondu à aucune de ces stimuli mécaniques sont classées comme afférences mécaniquement insensibles (SIAM). Les deux mécanosensible et MIAs peuvent être évalués pour la sensibilisation (par exemple en réponse améliorée, seuil réduit, et / ou l'acquisition d'mécanosensibilité) par l'exposition localisée de la RFS aux produits chimiques (par exemple, la soupe inflammatoire (IS), la capsaïcine, l'adénosine triphosphate (ATP)). Nous décrivons l'équipement et la préparation d'enregistrement rectum nerf, la récolte du côlon et du rectum avec PN ci-joint ou LSN, l'identification de la RFS dans le rectum, l'enregistrement mono-fibre à partir de faisceaux nerveux, et l'application localisée de produits chimiques à la RF. En outre, les défis de la préparation et l'application de la stimulation mécanique normalisée sont également discutés.

Introduction

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La douleur et hypersensibilité sont les plaintes prédominantes de patients souffrant de troubles gastro-intestinaux fonctionnels, y compris le syndrome du côlon irritable (IBS), qui existent en l'absence de la cause pathobiologique apparente ou dommages aux tissus. Par exemple, les patients IBS présentent une hypersensibilité, y compris les réponses accrues à rectale distension du ballon et une sensibilité accrue au cours de la fonction intestinale normale, ainsi que l'hypersensibilité de la saisine somatiques (ce est à dire, sensibilité à la palpation de la région abdominale) 1. Parce que le ciblage afférences colorectal se est révélé être efficace pour soulager la douleur et l'hypersensibilité chez les patients IBS (par exemple, l'instillation intra-rectale de 2,3 anesthésiques locaux; ingestion orale de la guanylate cyclase C-agoniste linaclotide 4-6), une meilleure compréhension de la innervation afférente du côlon et du rectum est important.

Afférences viscérales, y compris les afférences colorectal, Sont capables de répondre aux modalités chimiques / en nutriments et thermiques (par exemple, 7-9). Cependant, les afférences viscérales répondant à des stimuli mécaniques (c.-à-afférences mécanosensibles) ont été le plus étudié à fond parce stimuli mécaniques (par exemple, distension luminale, extensibles) sont celles qui donnent généralement lieu à des sensations conscientes, y compris inconfort et la douleur 10-16. En outre, les viscères sont également innervés par les afférences mécaniquement insensibles (SIAM) de, communément appelés nocicepteurs silencieux ou de dormir 17. Dans des conditions physiologiques normales, MIAs ne répondent pas à la stimulation mécanique ou avoir de très haute réponse seuils 18, mais peuvent devenir actifs et se dotent mécanosensibilité dans des conditions physiopathologiques et contribuer à une hypersensibilité.

Utilisation de la préparation et le protocole in vitro décrit ici, nous avons développé et emploie une stratégie de stimulation électrique à la mer RCH pour terminaisons réceptives, permettant l'identification objective des deux terminaisons mécanosensibles et Mia dans le rectum 19. L'innervation colorectal est dérivé de lombaire splanchnique (LSN) et nerf pelvien (PN) les parcours, et comprend afférences colorectal qui peuvent être classés en cinq catégories (mécanosensibles séreuse, muqueuse, musculaire, musculaire-muqueuse, mésentériques) et une classe MIA 20. L'utilisation de cette préparation in vitro, nous avons constaté que MIAs colorectal mécanosensibilité acquise (sensibiliser) après une brève exposition de leurs champs réceptifs à une soupe inflammatoire (IS), qui a sensibilisé 71% des soldats portés disparus dans la voie PN et 23% des soldats portés disparus dans la voie LSN 19. Nous avons également documenté une sensibilisation à long terme (jusqu'à 28 jours) des soldats portés disparus dans le cadre de l'hypersensibilité viscérale comportementale longue durée (ce est à dire, chez les souris recevant des traitements intracoliques avec zymosan 21 ou de l'acide 2,4,6-trinitrobenzène (TNBS) 22) .

jove_content "> Parmi afférences mécanosensibles, afférences musculaires et musculo-muqueuses sont les seules classes qui codent tonique tronçon périphérique du côlon et du rectum (ce est à dire, sont tronçon sensible) et subserve l'encodage des nocive distension colorectale 23,24. L'utilisation d'un contrôlé par ordinateur vigueur actionneur, nous avons appliqué une norme, homogène et reproductible tronçon rampe dans la direction circonférentielle du tissu colorectal aplatie et subdivisés afférences extensibles sensible à seuil bas et seuil haut 23. En outre, le cours du temps de la sensibilisation d'étirement afférences -sensibles après zymosan intracolique 21 ou 22 TNBS traitement correspond à l'apparition, la persistance et / ou le rétablissement de l'hypersensibilité viscérale comportement, suggérant un rôle des afférences colorectal extensibles sensible dans la douleur et l'hypersensibilité viscérale.

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Protocole

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NOTE: Ce protocole a été examiné et approuvé par l'Université de Pittsburgh institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité.

1. Préparation de la solution de Krebs modifiée et Drug Test aliquotes

  1. Ajouter 6 L d'une solution de Krebs modifiée qui contient (en mM): 117,9 NaCl, 4,7 KCl, 25 NaHCO 3, 1,3 NaH 2 PO 4, 1,2 MgSO 4, 2,5 CaCl2, 11,1 D-glucose, le butyrate de 2 sodium, l'acétate 20 de sodium , 0,004 nifédipine (pour bloquer les contractions musculaires spontanées), et 0,003 indométacine (pour bloquer la synthèse des prostaglandines endogènes). Utiliser des solutions glace froides et chaudes Krebs pour la dissection des tissus et l'enregistrement monofibre, respectivement.
  2. Préparer des solutions chimiques (par exemple, IS, la capsaïcine, ATP) en aliquotes à des concentrations désirées.

2. Dissection du tissu colorectal nerf

  1. Anesthésier et euthanasier les souris mâles (6 - 8 semaines, de 20 à 30 g) dansune chambre de CO 2 à un débit d'écoulement qui déplace 10 - 30% du volume de la chambre par minute jusqu'à ce que la respiration se arrête complètement les souris, comme indiqué par l'absence de mouvement de la poitrine.
  2. Immédiatement après l'euthanasie, exsangue en coupant ouvert la chambre thoracique, perforation de l'oreillette droite, et en l'immergeant la carcasse de la souris dans un volume suffisant (~ 500 ml) de glace-froid Krebs (4 ° C) solution barboter avec carbogène (95% O 2 , 5% CO 2).
  3. Retirez soigneusement tous les viscères, mais le côlon et les organes pelviens. Transect la souris dans la moitié à travers le segment rachidien T12 légèrement au-dessus du diaphragme thoracique et transférer la moitié caudale à une chambre de dissection contenant glacée, barboter solution de Krebs.
  4. Sous un stéréomicroscope, retirez la vessie et les organes reproducteurs par sectionnant à leurs jonctions à l'urètre, et enlever la descente / aorte abdominale jusqu'à ce qu'elle bifurque dans les artères iliaques communes. Libérer le PN ou la LSN de leur surrounding tissus par dissection et suivre le nerf de l'extérieur de la crête iliaque jusqu'à son point d'entrée dans le L6 ventrale et S1 colonne vertébrale (pour PN) ou T13 et L1 colonne vertébrale (pour LSN).
  5. Couper la symphyse pubienne et à droite et les articulations du cotyle gauche, et enlever l'os iliaque. Sans précaution soit le PN ou LSN du muscle attenant et du tissu conjonctif de près de la rectum jusqu'à où le nerf pénètre dans la colonne vertébrale.
  6. Réséquer soigneusement l'os iliaque pour exposer le cancer colorectal distal. Disséquer le cancer colorectal distal avec le PN-joint ou LSN en continuum.
  7. Transférer le rectum avec le nerf fixé à la chambre de bain de la chambre de tissu. Retirer le tissu conjonctif excessive par la poursuite de la dissection, et ouvrez le rectum longitudinalement le long de la frontière anti-mésentérique.
  8. Avec côté de la muqueuse vers le haut, la broche le bord mésentérique du côlon et du rectum adjacent au compartiment d'enregistrement dans la base de silicone de la chamber et fixer la longueur du côlon et du rectum antimésentérique à un râteau de crochets reliés à un actionneur de force (illustré sur la figure 1 et photographié à la figure 2A).
  9. Elargir le PN LSN ou dans le compartiment d'enregistrement, qui est relié au compartiment de bain par un trou de souris et la porte. Posez délicatement le tronc de nerf sur un petit miroir de verre dans le compartiment d'enregistrement, qui fournit une surface hydrophile pour le nerf à respecter. Superfuse le compartiment de salle de bain avec chaud (30-32 ° C), une solution de Krebs oxygénée et remplir le compartiment d'enregistrement avec de l'huile minérale.

Enregistrement 3. monofibre et la localisation du champ récepteur

  1. Retirer délicatement revenir l'épinèvre (gaine des nerfs) du PN ou LSN sous la loupe binoculaire à fort grossissement (50 - 60X). En utilisant des pinces fines, taquiner le tronc nerveux dans 5-8 faisceaux nerveux de ~ 100 um d'épaisseur.
  2. Placez la référence de platine-iridiumélectrode en contact avec la solution de Krebs dans la chambre de tissu. Placer séquentiellement les faisceaux de nerfs individuels sur l'électrode d'enregistrement constituée de la même matière.
  3. Utilisez un pinceau souple pour évoquer les points d'accès des afférences colorectal en caressant doucement monter et descendre la surface colorectal. Localisez le pack (s) de nerf qui innervent le côlon par détectable AP (potentiel d'action) des enregistrements.
    NOTE: Le PN et LSN innervent aussi la vessie et d'autres organes pelviens.
  4. Utilisez une paire de 30 g de pointes d'aiguilles de diviser davantage le faisceau nerveux en filaments de fascicule fines de ~ 10 um d'épaisseur et placer un filament individuel sur l'électrode d'enregistrement.
  5. Placer l'électrode concentrique à bout rond perpendiculaire à la surface de la muqueuse pour exciter électriquement des terminaisons afférentes à supraliminaire intensité de stimulation (10 mA d'amplitude, durée 0,5 ms @ 0,3 Hz), qui produit un rayon de ~ 2 mm de propagation courant. Déplacez l'électrode systématiquement (~ 1,5 mm étapes) Le long de la longueur et la largeur du côlon et du rectum aplatie pour localiser les terminaisons réceptives.
  6. Lorsque une fin afférente est excité, ajuster la position de l'électrode d'identifier le site d'activation (champ récepteur, RF) qui nécessite l'intensité du stimulus minimum (seuil de stimulation). Jeter terminaisons avec un seuil de stimulation> 3 mA 19.
  7. Calculer la vitesse de conduction (CV) à partir de 1) la distance entre l'électrode de stimulation au champ récepteur (RF) et le site d'enregistrement et 2) le retard de conduction (par exemple, figure 2B) entre l'artefact du stimulus et le début de potentiel d'action .
    CV (m / s) = distance (mm) / conduction retard (ms).

4. Classification fonctionnelle des mécanosensibles colorectal Afférences

  1. Après avoir localisé un RF par la stimulation électrique, appliquer les trois stimuli mécaniques suivantes à la RF:
    1. Effectuer le stimulus de sondage en appuyant sur la pointe d'un Calibramonofilament Ted von Frey-comme le nylon (0,4 et 1 g vigueur) perpendiculairement vers la RF sur le cancer colorectal aplatie.
    2. Effectuer le stimulus caressant en caressant doucement le muqueuse colorectale avec un brin de filament en nylon fine (10 mg de force) pour générer une petite contrainte de cisaillement de surface à la RF.
    3. Effectuer le tronçon périphérique en utilisant une force actionneur contrôlé par ordinateur, qui fournit une force d'étirement rampe (0-170 mN à 5 mn / sec) en direction circonférentielle le long du bord anti-mésentérique du côlon et du rectum par le râteau de crochets décrites à l'étape 2.8 .
  2. Classer afférences que séreuse (ne répondre qu'aux émousser sondage), la muqueuse (répondre aux muqueuses caressant et émousser le sondage), musculaire (répondre à tronçon périphérique et émousser le sondage) musculaire / muqueuse (répondre à tronçon périphérique, muqueuse caresser et émousser le sondage), ou MIA (non sensible à l'un des trois stimuli mécaniques).
  3. Pour afférences mésentériques (uniquement enl'innervation LSN) qui sont difficiles à activer sélectivement par la stimulation électrique, localiser leurs terminaisons réceptives en caressant mécanique / sondage du mésentère.
  4. Pour afférences stretch-sensibles (musculaire et musculo-muqueux), déterminer le seuil de réponse, qui est définie comme la force qui évoque la première AP cours tronçon rampe.
  5. Pour afférences séreuses, enregistrer leurs réponses à monter les niveaux de sonder ponctuée du champ récepteur entraîné par la force actionneur contrôlé par ordinateur.

5. Chemical Application / Modulation de Endings réceptives

  1. Enregistrer une réponse de base à un stimulus mécanique (ce est à dire, la réponse à l'étirement rampe, ponctuée de sondage, ou muqueuse caresser).
  2. Enduire le bord inférieur d'un morceau de tube (laiton ou en acier inoxydable, 10 mm de haut et 4 x 4 mm 2 carré ou 4 - 5 mm de diamètre) avec de la vaseline et le placer sur le champ récepteur sur le cancer colorectal.
  3. Supprimerla solution de Krebs à l'intérieur du tube, et exposer la fin réceptif pour les 3 - 5 minutes à 170 ul de la solution contenant le produit chimique (s) à tester.
  4. Surveiller la réponse du afférent pendant l'application chimique (certains afférences sont chimiosensible).
  5. Retirer la solution chimique et la tubulure de mettre fin à l'action de la substance chimique. De 4 à 6 min, tester la réponse afférente au même stimulus mécanique comme dans la réponse de référence.
  6. Réappliquer nouveau le stimulus mécanique après la période suffisante de wash-out (> 15 min).

6. Enregistrement et pointes Discriminating AP

  1. Numériser les signaux électriques enregistrés à partir des axones à 20 kHz et enregistrer les données dans un ordinateur. Surveiller le signal en ligne par un moniteur audio.
  2. Analyser les pointes AP off-line et de discriminer sur la base de simples unités analyse en composantes principales de formes d'onde de pic individuels 25.
    NOTE: Un enregistrement doit pas contenir plus eun deux unités actives facilement discriminables.

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Résultats

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La configuration est illustrée sur la figure 1. Il comprend une chambre de tissu sur mesure qui abrite le rectum dans un compartiment de bain silicone doublée et le nerf fixé dans un compartiment rempli d'huile minérale contiguë. La chambre à deux compartiments a été usiné à partir d'un bloc de plastique acrylique par une machine CNC; le fond des deux compartiments a ensuite été doublé avec de la silicone solide pour permettre à la broche facile bas du tissu colorectal. AP extracellulaires de faisceaux ...

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Discussion

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Le vitro préparation colorectum-nerf décrit ici se est avérée être une approche puissante pour étudier les fonctions de codage neural de afférences colorectal individuels, qui complète bien d'autres approches non-fonctionnels (par exemple, des études cellulaires, moléculaires et histologiques) sur les neurones sensoriels viscérales ( lire l'article 27 pour plus de détails). Mécanismes neuronaux qui contribuent à la nociception et colorectal hypersensibilité à long terme ont ...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Soutenu par le prix NIH R01 DK093525 (GFG). Nous apprécions grandement l’examen scientifique et l’édition grammaticale du manuscrit par le Dr Amber Shaffer (Université de Pittsburgh) et remercions Michael Burcham pour son aide dans la préparation des figures.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Stéréomicroscope Leica MZ16Leica Microsystems Inc.
Caméra Leica IC DLeica Microsystems Inc.
AmplificateurWorld Precision instruments, Inc.SYS-DAM80Amplificateur différentiel à faible bruit
Chambre à tissus à deux compartiments Power1401
Cambridge Electronic Design LimitedPower1401Acquisition de données, entrée/sortie de signal analogique
Spike2 v5.02Cambridge Electronic Design LimitedProgiciel compatible avec le moniteur audio Power1401
NatusAm
Stimulateur à impulsions carréesNatusS48Pour délivrer des stimuli
électriques Unité d’isolation photoélectriqueNatusPSIU6Isolation des stimulus pour réduire le bruit
Microélectrode bipolaire concentriqueFHC Inc.CBFFG75Pour délivrer des stimuli électriques
Système de levier bimodeAurora Scientific Inc.Série 300CPour délivrer des stimuli mécaniques
PincesFine Science Tools11252-00Pinces à pointes fines
8

Références

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Mots-clés

lectrophysiologie de la fibre uniqueTest de stimulation m caniquevaluation de la sensibilit chimiqueIdentification du champ r cepteurDissection des fibres nerveusesPerfusion de solution de KrebsEnregistrement du potentiel d actionClassification m canosensibleApplication de soupe inflammatoire

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