L’objectif de cette technique est de permettre aux chercheurs d’effectuer la dissection, l’immunocoloration et le montage de disques oculaires nymphaux de Drosophila melanogaster de tout âge.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le disque oculaire de Drosophila melanogaster est un système puissant qui peut être utilisé pour étudier de nombreux processus biologiques différents. Il contient environ 800 unités oculaires distinctes, appelées ommatidies1. Chaque ommatidium contient huit photorécepteurs neuronaux qui se développent à partir de cellules indifférenciées après le passage du sillon morphogénétique dans le troisième stade larvaire2. Suite à la différenciation séquentielle des photorécepteurs, des cellules non neuronales se développent, y compris des cellules coniques et pigmentaires, ainsi que des cellules de poils mécanosensoriels3. Les processus finaux, y compris l’arrangement structuré de tous les types de cellules ommatidiennes, la mort cellulaire programmée des types cellulaires indifférenciés et l’expression de la rhodopsine, se produisent au cours de la phasenymphale 4-7. Cette technique se concentre sur la manipulation du disque oculaire nymphal, fournissant des informations et des instructions sur la façon de disséquer le disque oculaire pendant la phase nymphale, qui est intrinsèquement plus difficile à réaliser que le disque oculaire du troisième stade couramment disséqué. Cette technique fournit également des détails sur l’immunomarquage pour permettre la visualisation de diverses protéines et autres composants cellulaires.
Introduction
Les domaines de la biologie du développement et de la cellule ont été fortement touchés par l'organisme modèle: Drosophila melanogaster. Dans ce modèle, les études du disque de l'œil ont contribué beaucoup de connaissances sur la signalisation, biologie cellulaire et d'autres domaines. Le troisième disque stade de l'œil larvaire fin a été largement étudié et est un modèle puissant à utiliser, car il donne un aperçu d'une série de périodes de développement, chacun avec ses propres molécules et des processus de signalisation unique, comme le sillon morphogénétique progresse à travers le disque de l'oeil 8. Cependant, il est nécessaire d'étendre notre compréhension des processus de développement dans la phase de chrysalide de développement. Bien qu'il y ait eu des études sur le disque d'œil pupe 3-7, notre connaissance ne se rapproche pas de l'ampleur du travail qui a été effectué sur le troisième disque stade de l'œil. Cela est dû, en partie, à la plus grande difficulté à disséquer le disque d'oeil chrysalide. En conséquence, une présentation de labonne méthode de dissection pourrait grandement augmenter la recherche dans ce domaine.
Bien qu'il existe des étapes dans le développement du disque de l'œil des pupes qui sont facilement disséqués, en particulier autour de la période mi-pupe, d'autres périodes sont beaucoup plus difficiles à disséquer. Ce protocole représente une méthode pour disséquer disques oculaires de nymphose qui peuvent être universellement utilisés pour tous les délais de développement des pupes. Ce protocole peut être utilisé comme une alternative à un autre protocole que 9 montre un procédé plus facile et plus rapide à disséquer les disques de l'oeil à partir des points de temps midpupal. Ce protocole a été filmé et mis au point pour la formation des étudiants avancés de premier cycle dans le cycle UCLA Consortium de recherche en génomique fonctionnelle (URCFG) 10,11 dans la technique de dissection de l'oeil chrysalide. Beaucoup d'étudiants de premier cycle ont pu utiliser cette vidéo et méthode pour apprendre cette technique difficile.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Cette procédure est une procédure de deux jours.
Jour 1 (2 h + temps de dissection)
Dissection 1. pupes yeux disque
- Sélectionnez une nymphe pour la dissection.
NOTE: L'âge de la nymphe à être disséqué sera déterminé par les besoins expérimentaux. Toutefois, si l'examen de la morphologie des cellules, cela est souvent effectué à 42 h après la formation de pupe (CSA) à 25 ° C, ce qui est l'âge de l'pupes montré dans la vidéo. Recueillir pupes blanc (considéré comme de l'APF 0 h) avec un pinceau mouillé et les disposer dans l'ordre chronologique (en fonction du temps de collecte) dans un nouveau flacon de nourriture à la mouche maintenue à 25 ° C. Disséquer les nymphes ans dans ce même ordre chronologique afin de maintenir les différences de temps entre les nymphes aussi près que possible. - Transférer la nymphe dans une goutte de solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4, voir matériaux pour la recette) sur une plaque de silicone de dissection.
- Tenez le haut de la coque de nymphose avec une pince et percer et ouvrir la lpartie de tournesol de la pupe avec une paire de pinces coupantes. Retirer la nymphe de l'affaire dans le trou nouvellement formé.
- Faire une coupe en diagonale avec des ciseaux, mi-thorax, à la nymphe. Retirer les débris ou transférer la tête de nymphe à une nouvelle baisse de PBS. Nettoyer avec le tube pipette de ventilateur (voir Figure 1 et matériaux pour plus de détails) et ajouter d'autres PBS selon les besoins. Assurez-vous d'éviter la déshydratation.
- La poignée fermement le haut de la tête cuticule nymphale avec une paire de pinces. Avec la pointe du tube de ventilateur, poussez doucement sur la coque de nymphose à extruder le cerveau et d'autres tissus, y compris les disques de l'oeil, sur la coque de nymphose. Soyez sûr d'éviter l'accaparement tout tissu dans la cuticule.
- Utilisation du tube de soufflage remplie de PBS, soufflez doucement le tissu de corps gras et d'autres débris sur le cas de la tête de séparer clairement et identifier les disques du cerveau et des yeux.
REMARQUE: Garder le cerveau fixé au boîtier de la tête de pupe permettra au chercheur d'utiliser l'ilannonce cas comme une "poignée" de manipulation avenir du tissu sans endommager les disques des yeux ou le cerveau. Cependant, il est courant de déloger le cerveau et les yeux de disques le cas de la tête et ce ne nuit pas à l'ensemble de la procédure et les résultats. Il faut souvent plusieurs tentatives de souffler et pousser à extraire avec succès les disques œil et le cerveau de l'intérieur de la tête pupe et afin qu'ils soient clairement séparés du tissu environnant. Le nettoyeur et un plus séparé peuvent obtenir les disques d'oeil du tissu environnant aidera à prévenir les tissus étrangers de fixation sur les disques de l'oeil. - Après dissection, transférer immédiatement le tissu dans un plat en verre de 3 bien sur la glace avec 0,5 ml de solution Fix (voir matériaux). Flotter le tissu sur la surface de la solution Fix pendant quelques minutes (généralement le temps qu'il faut pour disséquer le prochain jeu de disques de l'œil).
REMARQUE: Si ce ne sont pas le premier disque d'oeil à être disséqué dans cette ronde de dissection, Completely immerger le disque de l'œil précédente dans la solution Fix. Si l'exécution des procédures de coloration spéciales (par exemple, les espèces réactives de l'oxygène, les lysosomes, etc.) cela doit être fait avant la fixation. Pour ce faire, stocker les disques oculaires disséqués dans du PBS glacé avant de continuer avec le protocole de coloration appropriée. - Après dissection et l'immersion de tous les disques de l'oeil étant disséqué, déplacer le plat en verre de 3 à bien un rocker et le rock à la température ambiante pendant 30 min.
2. Immunocoloration
- Retirez délicatement la solution Fix et ajouter 0,5 ml de PBS avec 0,3% de Triton X-100 (0,3% PBT, voir matériaux) et laver le tissu sur une bascule pour 10 min. Répétez cette étape trois fois pour un total de 4 lavages (10 minutes chacun).
REMARQUE: élimination soigneuse de la solution dans le puits peut être réalisée sous un microscope à dissection pour prévenir les lésions tissulaires ou de la perte. La solution peut être aspiré soigneusement avec une pipette; nous préférons une amende-tipped, jetable pipette de transfert qui a eu l'ouverture aplatie pour réduire le risque de tissus aspiration. - A la fin de la 4ème lavage, retirer le lavage et ajouter 0,5 ml de solution de bloc (voir matériaux) pour le bien et incuber pendant 30 min.
NOTE: Ce délai peut être prolongé en fonction de vos besoins. - A la fin du temps de blocage de 30 min, la pipette 10 ul de la solution d'anticorps primaire (dilué dans une solution Block) dans le nombre approprié de puits dans une plaque de microtitration.
REMARQUE: Un puits d'une microplaque pourra accueillir environ 4 paires de disques oculaires attachés à la coque de nymphose ou 8 paires isolées de disques oculaires avec des cerveaux connectés. Les anticorps primaires utilisés dans ce protocole pour les données représentatives sont antiphosphotyrosine (dilution 1: 500) et anti-Cut (dilution 1: 200). - Transférer le tissu disséqué dans les puits de plaques de microtitration remplies de la solution d'anticorps primaire de la boîte de verre de 3 puits.
- Lieula microplaque sur une serviette en papier mouillée (pour prévenir la déshydratation) dans une boîte vide de la pipette de pointe (ou d'autres contenants similaires) et conserver à 4 ° C pendant la nuit.
Jour 2 (4 h + temps de montage)
- Transférer le tissu de la microplaque à un nouveau plat en verre de 3 et de 0,3% de PBT (≈0.5 ml) et laver le tissu pendant 10 min sur la bascule. Répétez cette étape trois fois pour un total de 4 lavages (10 min chacun)
- Retirez le dernier lavage et ajouter 0,5 ml de solution de blocs pour le bien. Bloquer pendant 30 min.
NOTE: Ce délai peut être prolongé en fonction de vos besoins. - Retirer la solution de bloc et ajouter 0,5 ml de la solution d'anticorps secondaire (fait à partir d'anticorps marqués par fluorescence correspondant à votre anticorps primaire et longueur d'onde fluorescente, dilué dans une solution Block) pour le bien et protéger le plat en verre de 3 et de la lumière avec une couverture ou aluminium déjouer et incuber pendant au moins 2 h à la salletempérature.
NOTE: Toutes les étapes suivantes devraient également être protégés contre l'exposition de la lumière. Cette incubation peut être prolongée pour une nuit à 4 ° C, dans une configuration similaire à l'incubation d'anticorps primaire, mais il peut également être effectuée dans un récipient en verre 3 de puits recouvert d'un film de laboratoire, ou une plaque de microtitration, si la conservation de l'anticorps est souhaitée. - À la fin de l'incubation d'anticorps, enlever la solution d'anticorps secondaire et ajouter 0,5 ml de 0,3% PBT pour le bien et laver sur la bascule pour 10 min. Répétez cette étape pour un total de 4 lavages (10 min chacun).
NOTE: Si la coloration DAPI est souhaité, avant de commencer le premier lavage, ajouter 0,5 pi de solution DAPI des stocks (voir matériaux) pour les 500 pi de PBT qui seront utilisés pour le premier lavage (1: 1000 dilution).
3. Montage
- A la fin de la dernière lavage, monter les disques yeux des antennes / sur une diapositive en utilisant 70% de glycérol ou PBS comme un moyen de supprimer le largeain et d'autres tissus non désirés dans une piscine d'un côté de la lame.
- Déplacez doucement le tissu en utilisant la pression hydrostatique entre les forceps, ou très doucement avec une pointe forceps, et aligner les disques d'oeil dans une colonne vers le centre de la diapositive.
- Retirer tous glycérol étrangère ou PBS à travers le tissu (en utilisant effet de mèche d'un laboratoire lingette ou les forceps travailler pour cela).
- Placer une petite quantité (≈10 pi) de milieu de montage sur un côté de la colonne de disque de l'oeil et placer une lamelle couvre-objet sur le tissu de façon à répartir le milieu de montage sur les disques de l'oeil.
- Laissez diapositive sit pendant 1 à 2 minutes pour permettre le / milieu de montage de tissu pour étaler complètement.
- Essuyez tout support de montage de congé supplémentaire autour des bords de la lamelle et le sceller avec du vernis à ongles transparent.
- Capturer des images fluorescentes des disques de l'oeil à l'aide de la microscopie confocale.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
A titre d'exemple de l'utilisation de ce protocole, des résultats illustrant midpupal (42 heures APF à 25 ° C) des disques de l'oeil immunocolorées avec des anticorps différents sont présentés dans la figure 2. En utilisant un anticorps dirigé contre les résidus de phosphotyrosine, la membrane des cellules peut être observée (figure 2A). Ceci peut être utilisé pour identifier l'agencement régulier de cellules dans l'œil ommatidial nymphal suivant les procédés de mise en forme finale ...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Bien qu’il semble que le processus soit simple et facile à réaliser, en réalité, cette technique nécessite beaucoup de pratique pour être maîtrisée. Régulièrement, nous commençons les élèves en apprenant à disséquer et à monter les disquesoculaires du troisième stade 12, qui sont beaucoup plus faciles à utiliser. Cette pratique aide à développer une position de dissection appropriée des bras, des mains et des doigts13 afin que la manipulation de la pince sous le microscope de dissection soit stabl...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous apprécions et tenons à remercier l’Institut médical Howard Hughes pour le prix du professeur HHMI à U.B., qui a rendu ce projet possible. Nous remercions le collège de l’Université de Californie à Los Angeles d’avoir fourni des installations et un soutien à l’infrastructure d’enseignement pour ce travail. Le travail a également été soutenu par un financement de l’Université Midwestern et un généreux don du Charity Fidelity Gift Fund. Nous remercions John VandenBrooks pour ses commentaires sur le manuscrit et Krista Pearman pour son assistance technique.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4) | 80 g NaCl, 2g ; KCl, 14,4 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4, Porter le volume à 1 μ ; l, ajustez le pH à 7,4, stérilisez en autoclave ou en filtre, diluez à 1x PBS avec du ddH2O autoclavé avant utilisation. | ||
| Triton X-100 | Promega | H5142 | Attention : Irritant ! Portez des gants. |
| 0,3 % PBT | 1,5 ml de Triton X-100, 500 ml 1X PBS. | ||
| Solution de formaldéhyde à 37 % | Fisher Scientific | F75P1GAL | Attention : Toxique, probablement cancérogène pour l’homme ! Portez des gants. |
| Solution | (&asymp ; 4 % de formaldéhyde dans PBS) 50 &mu ; l de 37 % de formaldéhyde, 450 &mu ; l 1x PBS, faire frais avant utilisation | ||
| Sérum de chèvre normal | Rockland anticorps & dosages | B304 | Aliquote en volumes de 1 ml et conserver à -80 ° ; |
| Solution | 10 % NGS en PBT. Celui-ci peut être fabriqué et stocké à 4 ° ; C pendant quelques jours avant l’utilisation. | ||
| Solution mère DAPI | Life Technologies | D3571 | Pour la coloration des noyaux. Préparez une solution à 1 mg/ml avec du ddH2O. |
| VectaShield Support de montage Vector | Labs | H-1000 | Support de montage |
| Glycérol | Sigma | G5516 | Pour le montage. Préparer une dilution à 70 % avec du ddH2O. |
| Equipement | |||
| Mélangeur à nutation | VWR | 82007-202 | Utilisé pour rocher les tissus dans un plat en verre à 3 puits |
| Kit d’élastomère de silicone SylGard 182 | Krayden | NC9897184 | Utilisé pour fabriquer un plat de dissection |
| en silicone Plat | de dissection en siliconeMélangez doucement le kit élastomère Sylgard (ci-dessus) selon les instructions (pour éviter les bulles). Verser le mélange dans une boîte de Pétri (de n’importe quelle taille). Laisser SylGard durcir pendant la nuit en 37 ° ; C. | ||
| Plat en verre à 3 puits | Corning | 7220-85 | La variété à 3 puits de ceux-ci n’est plus disponible, c’est le produit à 9 biens. |
| Minitray à micropuits 72 puits | Nunc | 438733 | |
| Pince tranchante (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Micro-ciseaux de type Vannas, droit, lame de 5 mm | Ted Pella | 1346 | |
| Capillaires en verre borosilicate de 100 mm | World Precision Instruments | 1B100-4 | Tirez avec l’extracteur d’aiguille pour faire une pointe fine qui permet à un petit jet de PBS de s’écouler. |
| Pipettes de transfert jetables, pointe fine | Samco Scientific | 231 | |
| Les dimensions du tube indiquées sont le diamètre intérieur (ID) x le diamètre extérieur (OD) x l’épaisseur de la paroi en pouces | |||
| Tube en PVC (1/8 x 3/16 x 1/32) | Nalgene | 8000-0010 | Utilisez-les avec l’aiguille tirée pour assembler le tube du ventilateur comme illustré à la figure 2. |
| Tubes en silicone Tygon (3/32 x 5/32 x 1/32) | Saint Gobain Performance Plastics | ABW00004 | |
| Tubes en silicone Tygon (1/32 x 3/32 x 1/32) | Saint Gobain Performance | Plastics ABW00001 |
Références
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113 (3), 841-850 (1991).
- Carthew, R. W. Pattern formation in the Drosophila eye. Curr Opin Genet Dev. 17 (4), 309-313 (2007).
- Bao, S., Cagan, R. Preferential adhesion mediated by Hibris and Roughest regulates morphogenesis and patterning in the Drosophila eye. Dev cell. 8 (6), 925-935 (2005).
- Grzeschik, N. A., Knust, E. IrreC/rst-mediated cell sorting during Drosophila pupal eye development depends on proper localisation of DE-cadherin. Development. 132 (9), 2035-2045 (2005).
- Sprecher, S. G., Desplan, C. Switch of rhodopsin expression in terminally differentiated Drosophila sensory neurons. Nature. 454 (7203), 533-537 (2008).
- Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster. Cell. 40 (4), 851-858 (1985).
- Voas, M. G., Rebay, I. Signal integration during development: insights from the Drosophila eye. Dev Dyn. 229 (1), 162-175 (2004).
- Hsiao, H. Y., et al. Dissection and immunohistochemistry of larval, pupal and adult Drosophila retinas. J Vis Exp. , 4347(2012).
- Call, G. B., et al. Genomewide clonal analysis of lethal mutations in the Drosophila melanogaster eye: comparison of the X chromosome and autosomes. Genetics. 177 (2), 689-697 (2007).
- Chen, J., et al. Discovery-based science education: functional genomic dissection in Drosophila by undergraduate researchers. PLoS Biol. 3 (2), 59(2005).
- Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. 37, 1936(2010).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
