Isolement et injection intraveineuse de moelle osseuse de souris dérivées monocytes

Résumé

Nous présentons ici un protocole qui génère de grandes quantités de monocytes murins à partir de moelle osseuse hétérogène pour des applications translationnelles. Par rapport à d’autres, cette nouvelle méthode permet de réduire le nombre d’animaux sacrifiés et de réduire les coûts en évitant des méthodes coûteuses telles que la séparation magnétique de cellules à gradient élevé (MACS).

Résumé

En tant que sous-type de leucocytes et progéniteurs de macrophages, les monocytes sont impliqués dans de nombreux processus importants des organismes et font souvent l’objet de divers domaines de la science biomédicale. La méthode décrite ci-dessous est un moyen simple et efficace d’isoler des monocytes murins de la moelle osseuse hétérogène.

La moelle osseuse du fémur et du tibia des souris Balb/c est prélevée par rinçage avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). La suspension cellulaire est complétée par du facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF) et cultivée sur des surfaces d’attache ultra-faibles pour éviter la différenciation des monocytes déclenchée par l’adhésion. Les propriétés et la différenciation des monocytes sont caractérisées à divers intervalles. Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), avec des marqueurs tels que CD11b, CD115 et F4/80, est utilisé pour le phénotypage. À la fin de la culture, la suspension est constituée de 45 %± 12 % de monocytes. En éliminant les macrophages adhésifs, la pureté peut être augmentée jusqu’à 86 %± 6 %. Après l’isolement, les monocytes peuvent être utilisés de différentes manières, et l’une des méthodes les plus efficaces et les plus courantes pour l’administration in vivo est l’injection intraveineuse de la veine de la queue.

Cette technique d’isolement et d’application est importante pour les études de modèles murins, en particulier dans les domaines de l’inflammation ou de l’immunologie. Les monocytes peuvent également être utilisés à des fins thérapeutiques dans des modèles de maladies chez la souris.

Introduction

L’isolement des monocytes est important et critique pour de nombreuses études in vitro et in vivo. Ces cellules sont des cibles pour des maladies telles que les maladies artérielles périphériques, les maladies coronariennes ou d’autres maladies ischémiques, car la croissance des vaisseaux collatéraux est fortement stimulée par l’inflammation locale. Les réponses inflammatoires comprennent l’activation endothéliale et le recrutement local de leucocytes, principalement des monocytes, qui se transforment ensuite en macrophages et créent un environnement hautement artériogène en sécrétant plusieurs facteurs de croissance pour induire le remodelage d’une artériole en une artère collatérale fonctionnelle^1-3. Les monocytes deviennent également des cellules dendritiques, qui sont fréquemment utilisées pour les études immunologiques^4,5 et la recherche sur le cancer^6,7.

Le problème dans l’approche d’isolement des monocytes à partir du sang périphérique⁸ est le nombre élevé d’animaux donneurs nécessaires pour produire une quantité suffisante de monocytes pour la plupart des analyses. Les protocoles précédents décrivent des méthodes telles que la centrifugation par gradient de densité et l’appauvrissement cellulaire via MACS⁹ lors de l’isolement des monocytes ; Cependant, ces techniques peuvent modifier les caractéristiques et la fonctionnalité des monocytes, ce qui peut entraîner des difficultés d’interprétation^10,11. De plus, ces méthodes sont difficiles et peuvent réduire la reproductibilité expérimentale.

Notre objectif avec ce protocole est de fournir une méthode simple et rentable pour générer de grandes quantités de monocytes dérivés de la moelle osseuse. En raison du rendement cellulaire élevé de 11 x 10⁶ ± 3 x 10⁶ cellules obtenues par ce protocole, nous pouvons réduire considérablement le nombre de souris nécessaires lors de l’isolement des monocytes dérivés de la moelle osseuse. La procédure peut être réalisée dans un minimum de temps et sans utiliser les techniques coûteuses et compliquées mentionnées ci-dessus. Ici, nous extrayons les monocytes de la suspension de moelle osseuse native de souris donneuses, cultivons la suspension sur des plaques de fixation ultra-faibles et complétons la solution avec 20 ng/ml de M-CFS. Au 5e jour d’incubation, les cellules sont récoltées et caractérisées pour confirmer les propriétés fonctionnelles et phénotypiques.

Pour les expériences dans le domaine de l’artériogénèse, la transplantation intraveineuse de ces monocytes dérivés de la moelle osseuse chez la souris est une méthode efficace d’administration systémique de médicaments, qui peut être combinée à la ligature de l’artère fémorale dans les modèles courants de maladie artérielle périphérique.

Protocole

Cette étude a été réalisée avec la permission de l'Etat de Saxe et de Saxe-Anhalt, Regierungspraesidium Dresden / Halle, selon l'article 8 de la loi allemande pour la protection des animaux (24D-9168,11 à 1 / 2008-24).

Une cellule d'isolement

1.1 Préparation du fémur et du tibia

1. Anesthésier la souris en utilisant une concentration d'isoflurane à 5% par vaporisation d'isoflurane dans un bac fermé. Après la souris a cessé de bouger pendant 3 secondes, effectuer la dislocation cervicale.
2. Désinfecter les membres postérieurs avec de l'éthanol (96%). Enlever la peau et les muscles et séparer les os avec un scalpel stérile.
   1. Commencez par une incision inguinale de la peau, et d'étendre l'incision vers la malléole interne et effectuer une dissection circulaire de la peau autour du mollet. Retirez la peau des jambes complètement par éplucher proximale.
   2. Détachez le muscle quadriceps du fémur avec un scalpel, enlever les deux péroné antérieureset les groupes musculaires jumelles et disjoignent la jambe à l'articulation de la hanche en localisant et en disséquant les ligaments.
   3. Commencez en avant et procéder autour de l'articulation en tournant soigneusement la jambe et sectionnant les ligaments, désarticulant ainsi la commune.
3. Laver fémur et le tibia avec 96% d'éthanol pendant au moins 90 secondes pour garantir préparation cellulaire aseptique. Poursuivre le processus de lavage avec du PBS stérile pour rincer éthanol restant.
   Remarque: Toutes les étapes suivantes doivent être stériles pour éviter la contamination.

1.2 La récolte de moelle osseuse

1. Couper l'extrémité proximale et distale de chaque os avec une paire de ciseaux fins d'accéder aux arbres fémorale et tibiale. Soyez prudent avec cette étape, puisque ces os se cassent très facilement.
2. Rincer les os avec un milieu chaud (M199 + 10% de sérum de veau foetal (FCS), + 1% de pénicilline / streptomycine). Utiliser une aiguille stérile 28-G, une seringue de 1 ml, et entre 10 à 15 ml par milieuosseuse pour le rinçage.
3. Maintenez l'os avec une pince fine et rincer une par une jusqu'à ce qu'il devienne semi-translucide. Appliquer soigneusement pression à l'extrémité du plongeur de la seringue afin de minimiser le stress cellulaire.
4. Filtrer la moelle osseuse à travers un nylon web 70 um et de recueillir le filtrat. Pour extraire la quantité maximale de la moelle osseuse, rincer de manière répétée à partir des extrémités distale et proximale.
5. Rincez le tamis avec du PBS et recueillir le filtrat. Déloger soigneusement les débris et les conglomérats cellulaires par agitation douce et pipetage.

1.3 Culture

1. Centrifuger la suspension de cellules à 250 xg pendant 10 min à température ambiante. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules avec environ 25 ml de milieu. Répéter une fois.
2. Resuspendre les cellules dans 6 ml de milieu après la seconde étape de lavage. Mélanger 50 ul de la solution de cellules avec 50 pi de bleu trypan. Compter les cellules dans une chambre de comptage au microscope optique. Calculer le nombre de caunes dans la solution à l'aide de cette formule:
   
3. Ensemencer les cellules sur des plaques de surface à très faible fixation 6 puits pour empêcher l'adhérence permanente au fond de la plaque. Utiliser une concentration de 10 ⁶ cellules par ml avec jusqu'à 6 ml par puits.
4. Compléter la suspension avec 20 ng / ml de M-CSF pour promouvoir la différenciation cellulaire.
5. Culture des cellules pendant 5 jours à 37 ° C et 5% de dioxyde de carbone et d'observer tous les jours.

1.4 La récolte des cellules

Remarque: ces étapes doivent être effectuées sur la glace. Procéder à 1.4.1 ou 1.4.2 soit en conséquence.

1. À ce stade, récolter toute la culture, y compris les macrophages différenciés qui adhèrent à la culture plaques, même se ils sont des plaques de surface ultra-faible fixation.
   1. Récolter la culture entière par pipetage doux et détacher avec une solution de 4 ° C PBS, 0,5% d'albumine de sérum bovin (BSA) et 2 mM d'EDTA. Répétez jusqu'à ce que les plaques sont clairement de rester cellules adhérentes - confirmer sous un microscope en cas de doute.
2. Sinon, jetez macrophages adhérentes en récoltant le surnageant avec les cellules en suspension, qui contiennent principalement des monocytes.
   1. Récolter les cellules non adhérentes avec une solution de PBS sans EDTA et 0,5% de BSA. Ne pas appliquer trop de force pour ne pas déloger les macrophages légèrement adhérentes.

1,5 FACS-analyse (Facultatif)

Remarque: Il est possible d'épuiser la suspension cellulaire de cellules progénitrices et stem- CD117 ⁺ en utilisant des MACS. Utilisez protocoles du fabricant pour cette procédure.

1. Récolter les cellules selon l'une des étapes 1.4.1 ou 1.4.2.
2. Centrifuger les cellules à 250 g pendant 10 min à 4 ° C et répéter cette étape.
3. Remettre en suspension au moins 250 000 cellules dans 300 pi de FACS buffer par sonde.
4. Transfert solution de cellules sur un 96-bien-plaque (30 pi par puits).
5. Centrifuger la suspension de cellules à 250 xg pendant 5 min à 4 ° C.
6. Retirer le surnageant et ajouter 25 ul d'anticorps à chaque puits (utilisation constructeur dilution).
7. Colorer les cellules avec des anticorps (suivant les protocoles du fabricant pour le phénotypage cellulaire après les étapes 1.5.1-1.5.6. Marqueurs couramment utilisés pour l'identification des monocytes / macrophages comprennent CD11b, F4 / 80 (Figure 3), CD115 (Figure 2), et Gr- 1.
   Remarque: Pour une description plus détaillée des solutions cellulaires, l'utilisation de marqueurs comme CD4, CD8a, CD11c, CD25, CD45, CD45R, CD62L, CD80, CD86, CD145, CD117, MHCⅡ, Ly6C, Ly6G et CD192 est recommandé. Caractéristiques cellulaires ont été précédemment décrites ^12.
8. Incuber les sondes pendant 20 min à 4 ° C.
9. Centrifuger les sondes à 250 xg pendant 5 min à 4 ° C et remettre en suspension avec 200 ul de tampon FACS. Répétez eest l'étape deux fois.
10. Transférez les sondes dans des tubes FACS et effectuer l'analyse FACS ^12.
11. Effectuer l'analyse FACS ¹² au jour 0, 3 et 5 pour analyser la différenciation cellulaire.

2. Injection veine caudale

Préparation 2.1

1. Réchauffez les animaux sur une plaque chauffante à 37 ° C pendant environ 10 min. Observer les animaux tout en chauffant à reconnaître les signes de surchauffe.
2. Resuspendre les monocytes isolés dans les étapes, 1.1- 1.4, dans 150 ul de NaCl, et de charger les cellules dans une seringue de 1 ml à l'insuline avec une aiguille de 30G. Légèrement vortex la solution avant de charger la seringue pour se assurer que tous les monocytes sont injectés. Toujours manipuler les cellules sur de la glace pour éviter l'attachement de chaleur médiation et l'activation des monocytes.

2.2 Retenir

1. Éviter de déranger les autres souris dans la cage lors du choix d'une souris pour l'injection intraveineuse.
2. Passer la souris dans le dispositif de retenue. Eviter trop de prEssure et être prudent avec les membres postérieurs. (Figure 4)
   Remarque: Vous pouvez également utiliser l'anesthésie générale pour garantir sans stress manipulation des animaux.
3. Assurez-vous que la souris possède un espace pour respirer avant la fermeture du dispositif de retenue.

2.3 Injection

1. Désinfecter le site d'injection avec un agent de désinfection. Vaporiser sur la queue de la souris et laisser reposer pendant au moins 1 min.
2. Arrêtez veineuse flux sanguin de la queue en appliquant une légère pression sur le côté latéral de la queue au-dessus du site d'injection, pour une meilleure visibilité des veines.
3. Mettez la queue de 90 degrés, avant l'injection. (Figure 5)
4. Injecter à un angle de 45 degrés. Injecter lentement et pas plus de 5 pi par g pour éviter de nuire animaux.
5. Se il ya un blister, qui est un signe d'une injection échoué, cesser immédiatement et répéter l'injection plus proximale.
6. Arrêter l'hémorragie sur le côté d'injection en appliquant douce pression pendant environ 1 min.
7. A la fin de la procédure, le rétracteur ouvrir et placer la souris dans une cage.
8. Observez la souris pendant 20 min pour se assurer que l'animal n'a pas été blessé par l'injection et décubitus sternal est maintenue. Prolonger le délai d'observation jusqu'à ce que la souris reprend conscience suffisante. Retour la souris vers la compagnie d'autres animaux seulement après qu'il a complètement récupéré.

Résultats

La solution d'extrait cellulaire de la moelle osseuse murine est constituée de divers types de cellules. Les principaux types de cellules sont des lymphocytes, les granulocytes et les monocytes. Les types de cellules peuvent être estimées par la taille et la granularité, qui est représentée sur la figure 1 pour les deux suspensions indigènes et les cellules récoltées après 5 jours de différenciation. Notez la composition cellulaire pendant la culture itinérante. Cependant, la classification exacte des p...

Discussion

Nous décrivons une méthode simple et rentable pour isoler de grandes quantités de monocytes murins de la moelle osseuse. En comparaison à d'autres protocoles utilisant le sang périphérique, qui obtiennent des rendements de monocytes ⁵ 1.4 x10 ^6, nous sommes en mesure d'obtenir des rendements plus élevés de 11 x 10 ⁶ ± 3 x 10 ⁶ monocytes d'une souris donateur.

Lors de l'examen des défis avec cette méthode, il est important de mention...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaque à 6 puits à très faible fixation	Corning Incorporated, NY, États-Unis		Plaque à 6 puits à très faible fixation, avec capuchon,
stérile de 8 à 12 semaines, mâle, souris balb/c ;	Charles River, Sulzfeld, Allemagne
96-well-plate	Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Allemagne
Coloration bleue à cellules mortes	Life technologies GmbH, Darmstadt, Allemagne
Albumine sérique bovine	GE Healthcare, Fribourg, Allemagne		Fraction V, pH 7.0
Canules	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Allemagne		28G, 30G
CD115	eBioscience, San Diego, États-Unis	12-1152
CD11b	eBioscience, San Diego, États-Unis	53-0112
Plat de culture cellulaire	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Allemagne		Avec bouchon, steril
Centrifugeuse	Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Allemagne		Centrifugeuse X-15R
Crème dépilatoire	Veet, Mannheim, Allemagne
Agent de désinfection	Schü ; lke& Mayr GmbH, Norderstedt, Allemagne		Kodan Tinktur
forte Scalpel jetable n°10  ;	Rasoir de sûreté en plumes Co.Ltd, Osaka, Japon  ;
EDTA	Sigma Aldrich, Hambourg, Allemagne
Éthanol à 96 %²	Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrü ; cken, Allemagne
Unité d’extraction Pipetus	Hirschmann Laborgerä ; te GmbH & Co.KG, Eberstadt, Allemagne
F4/80	AbD Serotec, Dü ; sseldorf, Allemagne	MCA497APC
tampon FACS  ;	Fabriqué par notre groupe avec des composants		PBS, 0,5 % BSA, 0,1 % NaN3
FACS dispositif	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, États-Unis BD		FACS Canto II
FACS tubes  ;   ;   ;   ;	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, États-Unis
Pipette Falcon® ;	Becton Dickenson Labware, NY, États-Unis
Sérum de veau fœtal	Sigma Aldrich, Hambourg, Allemagne
Pince fine	Rubis, Stabio, Suisse
Gants	Rö ; sner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Allemagne
Gr1	eBioscience, San Diego, USA	53-5931
Plaque chauffante  ;	Labotect GmbH, Gö ; ttingen, Allemagne  ;		Hot Plate 062
Incubator	Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Allemagne		Incu safe
Isofluran	Baxter Deutschland GmbH, Unterschleiß ; heim, Allemagne
Microscope optique	Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Allemagne		Axiovert 40 ° ; c
Facteur de stimulation des colonies de macrophages	Sigma Aldrich, Hambourg, Allemagne	SRP3110  ;
Agitateur mécanique	IKA, Staufen, Allemagne		ms2 minishaker
Medium 199	PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria		Warm in 37 ° ; C bain-marie avant utilisation
Microtubes à essai	Eppendorf AG, Hambourg, Allemagne
Banc de travail microbiologique	Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Allemagne		Hera
safe Monocyte wash buffer  ;	Fabriqué par notre groupe avec des composants		PBS, 0,5 % BSA, 2 mM EDTA
Souris restrainer	Various
NaCl	Berlin Chemie AG, Berlin, Allemagne
NaN3 (sodium acide)	Sigma Aldrich, Hambourg, Allemagne
Chambre de comptage Neubauer	Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Kö ; nigshofen, Allemagne
Nylon cellsieve	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, États-Unis		Passoire à cellules, 70 µ ; m maille
pénicilline/streptomycine	Sigma Aldrich, Hambourg, Allemagne
Saline tamponnée au phosphate	Life technologies GmbH, Darmstadt, Allemagne		pH 7,4,
stériles Pipettes	Eppendorf AG, Hambourg, Allemagne		10µ ; L/100µ ; L / 200 et micro ; l/1 000µ ; l
Têtes de pipetage	Eppendorf AG, Hambourg, Allemagne
Pipette sérologique	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Allemagne		Cellstar 5 ml, 10 ml
Unité d’aspiration	Integra bioscience, Fernwald, Allemagne		Vacusafe
comfort Ciseaux chirurgicaux	Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, États-Unis
Seringue	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Allemagne		1 ml Omnifix® ; Seringue insuline -F
Tubes avec capuchon	Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Allemagne		15 ml/50 ml Tubes Cellstar
Bain d’eau chaude	Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Allemagne		Julabo SW22