Nous présentons ici un protocole qui génère de grandes quantités de monocytes murins à partir de moelle osseuse hétérogène pour des applications translationnelles. Par rapport à d’autres, cette nouvelle méthode permet de réduire le nombre d’animaux sacrifiés et de réduire les coûts en évitant des méthodes coûteuses telles que la séparation magnétique de cellules à gradient élevé (MACS).
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Article de méthode
Isolement et injection intraveineuse de moelle osseuse de souris dérivées monocytes
Dans cet article
Résumé
Résumé
En tant que sous-type de leucocytes et progéniteurs de macrophages, les monocytes sont impliqués dans de nombreux processus importants des organismes et font souvent l’objet de divers domaines de la science biomédicale. La méthode décrite ci-dessous est un moyen simple et efficace d’isoler des monocytes murins de la moelle osseuse hétérogène.
La moelle osseuse du fémur et du tibia des souris Balb/c est prélevée par rinçage avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). La suspension cellulaire est complétée par du facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF) et cultivée sur des surfaces d’attache ultra-faibles pour éviter la différenciation des monocytes déclenchée par l’adhésion. Les propriétés et la différenciation des monocytes sont caractérisées à divers intervalles. Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), avec des marqueurs tels que CD11b, CD115 et F4/80, est utilisé pour le phénotypage. À la fin de la culture, la suspension est constituée de 45 %± 12 % de monocytes. En éliminant les macrophages adhésifs, la pureté peut être augmentée jusqu’à 86 %± 6 %. Après l’isolement, les monocytes peuvent être utilisés de différentes manières, et l’une des méthodes les plus efficaces et les plus courantes pour l’administration in vivo est l’injection intraveineuse de la veine de la queue.
Cette technique d’isolement et d’application est importante pour les études de modèles murins, en particulier dans les domaines de l’inflammation ou de l’immunologie. Les monocytes peuvent également être utilisés à des fins thérapeutiques dans des modèles de maladies chez la souris.
Introduction
L’isolement des monocytes est important et critique pour de nombreuses études in vitro et in vivo. Ces cellules sont des cibles pour des maladies telles que les maladies artérielles périphériques, les maladies coronariennes ou d’autres maladies ischémiques, car la croissance des vaisseaux collatéraux est fortement stimulée par l’inflammation locale. Les réponses inflammatoires comprennent l’activation endothéliale et le recrutement local de leucocytes, principalement des monocytes, qui se transforment ensuite en macrophages et créent un environnement hautement artériogène en sécrétant plusieurs facteurs de croissance pour induire le remodelage d’une ....
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Protocole
Cette étude a été réalisée avec la permission de l'Etat de Saxe et de Saxe-Anhalt, Regierungspraesidium Dresden / Halle, selon l'article 8 de la loi allemande pour la protection des animaux (24D-9168,11 à 1 / 2008-24).
Une cellule d'isolement
1.1 Préparation du fémur et du tibia
- Anesthésier la souris en utilisant une concentration d'isoflurane à 5% par vaporisation d'isoflurane dans un bac fermé. Après la souris a cessé de bouger pendant 3 secondes, effectuer la dislocation cervicale.
- Désinfecter les membres postérieurs avec de l'éthanol (96%). Enlever la peau et les m....
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Résultats
La solution d'extrait cellulaire de la moelle osseuse murine est constituée de divers types de cellules. Les principaux types de cellules sont des lymphocytes, les granulocytes et les monocytes. Les types de cellules peuvent être estimées par la taille et la granularité, qui est représentée sur la figure 1 pour les deux suspensions indigènes et les cellules récoltées après 5 jours de différenciation. Notez la composition cellulaire pendant la culture itinérante. Cependant, la classification exacte d.......
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Discussion
Nous décrivons une méthode simple et rentable pour isoler de grandes quantités de monocytes murins de la moelle osseuse. En comparaison à d'autres protocoles utilisant le sang périphérique, qui obtiennent des rendements de monocytes 5 1.4 x10 6, nous sommes en mesure d'obtenir des rendements plus élevés de 11 x 10 6 ± 3 x 10 6 monocytes d'une souris donateur.
Lors de l'examen des défis avec cette méthode, il est important de mention.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par la DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, Fondation allemande pour la recherche) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, centre de recherche collaborative).
Merci à Hans-Holger Gärtner, Audiovisuelles Medienzentrum, Université Otto-von-Guericke de Magdebourg, Magdebourg, Allemagne, pour le soutien technique.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Plaque à 6 puits à très faible fixation | Corning Incorporated, NY, États-Unis | Plaque à 6 puits à très faible fixation, avec capuchon, | |
| stérile de 8 à 12 semaines, mâle, souris balb/c ; | Charles River, Sulzfeld, Allemagne | ||
| 96-well-plate | Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Allemagne | ||
| Coloration bleue à cellules mortes | Life technologies GmbH, Darmstadt, Allemagne | ||
| Albumine sérique bovine | GE Healthcare, Fribourg, Allemagne | Fraction V, pH 7.0 | |
| Canules | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Allemagne | 28G, 30G | |
| CD115 | eBioscience, San Diego, États-Unis | 12-1152 | |
| CD11b | eBioscience, San Diego, États-Unis | 53-0112 | |
| Plat de culture cellulaire | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Allemagne | Avec bouchon, steril | |
| Centrifugeuse | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Allemagne | Centrifugeuse X-15R | |
| Crème dépilatoire | Veet, Mannheim, Allemagne | ||
| Agent de désinfection | Schü ; lke& Mayr GmbH, Norderstedt, Allemagne | Kodan Tinktur | |
| forte Scalpel jetable n°10 ; | Rasoir de sûreté en plumes Co.Ltd, Osaka, Japon ; | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, Hambourg, Allemagne | ||
| Éthanol à 96 %² | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrü ; cken, Allemagne | ||
| Unité d’extraction Pipetus | Hirschmann Laborgerä ; te GmbH & Co.KG, Eberstadt, Allemagne | ||
| F4/80 | AbD Serotec, Dü ; sseldorf, Allemagne | MCA497APC | |
| tampon FACS ; | Fabriqué par notre groupe avec des composants | PBS, 0,5 % BSA, 0,1 % NaN3 | |
| FACS dispositif | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, États-Unis BD | FACS Canto II | |
| FACS tubes ; ; ; ; | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, États-Unis | ||
| Pipette Falcon® ; | Becton Dickenson Labware, NY, États-Unis | ||
| Sérum de veau fœtal | Sigma Aldrich, Hambourg, Allemagne | ||
| Pince fine | Rubis, Stabio, Suisse | ||
| Gants | Rö ; sner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Allemagne | ||
| Gr1 | eBioscience, San Diego, USA | 53-5931 | |
| Plaque chauffante ; | Labotect GmbH, Gö ; ttingen, Allemagne ; | Hot Plate 062 | |
| Incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Allemagne | Incu safe | |
| Isofluran | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleiß ; heim, Allemagne | ||
| Microscope optique | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Allemagne | Axiovert 40 ° ; c | |
| Facteur de stimulation des colonies de macrophages | Sigma Aldrich, Hambourg, Allemagne | SRP3110 ; | |
| Agitateur mécanique | IKA, Staufen, Allemagne | ms2 minishaker | |
| Medium 199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria | Warm in 37 ° ; C bain-marie avant utilisation | |
| Microtubes à essai | Eppendorf AG, Hambourg, Allemagne | ||
| Banc de travail microbiologique | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Allemagne | Hera | |
| safe Monocyte wash buffer ; | Fabriqué par notre groupe avec des composants | PBS, 0,5 % BSA, 2 mM EDTA | |
| Souris restrainer | Various | ||
| NaCl | Berlin Chemie AG, Berlin, Allemagne | ||
| NaN3 (sodium acide) | Sigma Aldrich, Hambourg, Allemagne | ||
| Chambre de comptage Neubauer | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Kö ; nigshofen, Allemagne | ||
| Nylon cellsieve | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, États-Unis | Passoire à cellules, 70 µ ; m maille | |
| pénicilline/streptomycine | Sigma Aldrich, Hambourg, Allemagne | ||
| Saline tamponnée au phosphate | Life technologies GmbH, Darmstadt, Allemagne | pH 7,4, | |
| stériles Pipettes | Eppendorf AG, Hambourg, Allemagne | 10µ ; L/100µ ; L / 200 et micro ; l/1 000µ ; l | |
| Têtes de pipetage | Eppendorf AG, Hambourg, Allemagne | ||
| Pipette sérologique | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Allemagne | Cellstar 5 ml, 10 ml | |
| Unité d’aspiration | Integra bioscience, Fernwald, Allemagne | Vacusafe | |
| comfort Ciseaux chirurgicaux | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, États-Unis | ||
| Seringue | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Allemagne | 1 ml Omnifix® ; Seringue insuline -F | |
| Tubes avec capuchon | Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Allemagne | 15 ml/50 ml Tubes Cellstar | |
| Bain d’eau chaude | Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Allemagne | Julabo SW22 |
Références
- Herold, J., et al. Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth. Hum Gene Ther. 15 (1), 1-12 (2004).
- Herold, J., Tillmanns, H., Xing, Z., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C.
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Réimpressions et autorisations
