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Article de méthode

Trancher les cultures organotypiques d'études de neurogenèse postnatale

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DOI :

10.3791/52353

⸱

4 mars 2015

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, University of Toronto, 2Institute of Anatomy and Cell Biology, School of Medicine, National Yang-Ming University, 3Department of Education and Research, Taipei City Hospital

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons ici une technique pour étudier la neurogenèse postnatale hippocampe en utilisant la technique de culture organotypique. Cette méthode permet la manipulation in vitro de la neurogenèse adulte et permet l'application directe d'agents pharmacologiques à l'hippocampe en culture.

Résumé

Nous décrivons ici une technique pour étudier la neurogenèse postnatale l'hippocampe dans le cerveau de rongeurs en utilisant la technique de culture organotypique. Cette méthode maintient la morphologie caractéristique topographique de l'hippocampe, tout en permettant l'application directe des agents pharmacologiques pour les développement gyrus denté de l'hippocampe. En outre, les cultures tranche peuvent être maintenues jusqu'à quatre semaines et donc, permettent d'étudier le processus de maturation des neurones granulaires nouveau-nés. Trancher les cultures permettent la manipulation pharmacologique efficace des tranches d'hippocampe tout en excluant les variables complexes tels que les incertitudes liées à la localisation anatomique profonde de l'hippocampe ainsi que la barrière hémato-encéphalique. Pour ces raisons, nous avons cherché à optimiser les cultures organotypique spécifiquement pour la recherche de la neurogenèse postnatale.

Introduction

La neurogenèse adulte dans l’hippocampe des mammifères représente un exemple remarquable de la capacité innée du cerveau à s’adapter et à devenir plasticite. Les cellules granulaires dentées (DGC) sont générées à partir d’un pool renouvelable de cellules progénitrices neurales dans le gyrus denté de l’hippocampe, qui est l’une des deux régions neurogènes actuellement bien caractérisées du cerveau des mammifères, et est considérée comme particulièrement importante pour l’apprentissage et la mémoire. L’hippocampe fait partie du système limbique et a un emplacement profond dans le cerveau des mammifères, ce qui en fait une cible difficile pour une manipulation pharmacologique précise. De plus, la neurogenèse aberrante a été impliquée dans des affections telles que l’épilepsie, la schizophrénie et la maladie d’Alzheimer, ce qui a suscité un intérêt pour la compréhension de l’influence de divers agents pharmacologiques pendant la maturation et la survie des neurones nouveau-nés. La distinction entre la neurogenèse postnatale et la neurogenèse adulte est floue et des études antérieures ont montré que de nombreuses caractéristiques du développement neuronal in vivo au début de la période postnatale et à l’âge adulte sont similaires25. Ici, nous mettons l’accent sur la neurogenèse postnatale et suggérons des applications possibles à la neurogenèse adulte.

Les cultures de coupes organotypiques constituent une méthode in vitro efficace pour étudier diverses propriétés physiologiques de l’hippocampe des mammifères. La valeur des cultures de tranches préparées à partir de cerveaux de rongeurs peut être résumée en trois qualités principales : 1) le protocole est simple et nécessite des matériaux facilement disponibles ; 2) les cultures en tranches permettent des études pharmacologiques qui éliminent des variables complexes telles que l’emplacement anatomique profond de l’hippocampe et contournent la barrière hémato-encéphalique1 ; et 3) la structure bien caractérisée de l’hippocampe et du circuit tri-synaptique est préservée2. Des chercheurs précédents ont utilisé la culture organotypique de l’hippocampe pour étudier le développement synaptique et la physiologie3,4, la gliogenèse5-7, les lésions cérébrales ischémiques8,9, la neuroprotection et la neuroréparation10-12 ainsi que l’épilepsie13-15. Les cultures de coupes pourraient également fournir un système de modèle utile permettant de surveiller le développement cellulaire en conjonction avec le marquage des cellules avec la protéine fluorescente verte (GFP) ou d’autres marqueurs vitaux.

Des cultures de tranches ont également été utilisées précédemment pour étudier la neurogenèse postnatale de l’hippocampe16-19, mais un facteur important dans la majorité de ces études est la dégénérescence bien caractérisée qui résulte de l’explantation de tissus d’animaux adultes après environ 2 semaines in vitro20,21. Pour cette raison, les cultures de tranches sont généralement préparées à partir de souris ou de rateaux postnatals précoces (P5-P10), qui utilisent la viabilité améliorée du tissu cérébral postnatal précoce pour la culture22. Bien que des études antérieures aient montré que l’hippocampe postnatal précoce et l’hippocampe adulte diffèrent en ce qui concerne la physiologie synaptique et l’expression de sous-types neuronaux spécifiques23,24, il existe une conservation substantielle du programme de développement chorégraphié par lequel les cellules granulaires dentées du nouveau-né passent au cours de la maturation25. De plus, des études récentes ont suggéré que les caractéristiques physiologiques des DGC nouveau-nés en culture sont très similaires à celles des neurones immatures dans la préparation de la coupe aiguë de l’hippocampe16.

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Protocole

NOTE: Toutes les procédures d'animaux étaient conformes aux lignes directrices du ministère de médecine comparée à l'Université de Toronto et de santé bien-être animal.

1. Préparation des tranches hippocampiques

  1. Stériliser les instruments suivants en utilisant l'autoclave sec à 125 ° C: Manche de bistouri (# 3) (2), une pince de modèle standard, grande (1), Petit dissecteur ciseaux (angle à l'autre) (1), Micro cuillère (cuillère et plat extrémités de spatule) (1), Micro-spatules (arrondis et arrondis extrémités effilées) (2), pinceau fin (1), polie au feu pipette Pasteur (2), des carrés de gaze, 2 x 2 pouces (5).
  2. Lorsque stérile, mettre les instruments dans un récipient stérile et de garder couvert jusqu'à utilisation. Immédiatement avant la dissection, immerger les instruments dans une solution d'éthanol à 70%.
  3. Préparer une plaque de culture à 6 puits avec insert de culture avant de commencer la procédure de dissection par addition de 1 ml de milieu de culture / puits et le stockage de la plaque dans l'incubateur à 35 ° C unee 5% de CO 2.

2. Disposer d'instruments de dissection stérile dans la hotte à flux laminaire

  1. Vaporiser la hotte à flux laminaire avec 70% d'éthanol et de supprimer des instruments de dissection stérilisés de l'alcool. Laissez les instruments sécher tout en reposant sur une boîte de Pétri stérile pour éviter tout contact entre l'alcool et le tissu du cerveau disséqué.
  2. Dépôt 5-7 ml de solution de dissection glacée stérilisé dans deux grandes boîtes de Pétri stériles. Un plat se détendre et de nettoyer la tête (sale), l'autre pour le refroidissement et le rinçage du cerveau creusé (propre). Placer un papier filtre stérilisé dans l'un des couvercles plat de Pétri pour disséquer le cerveau.
  3. Placez un petit papier filtre stérilisé dans une des petites boîtes de Petri couvercle pour disséquer l'hippocampe. Dépôt 3-5 ml de solution de dissection glacée stérilisé dans deux petites boîtes de Pétri stériles. Un plat tiendra l'hippocampe creusé, une tiendra sections lors de la séparation des sections de l'hippocampesous microscope de dissection.
  4. Préparer le broyeur de tissus en collant un morceau de papier filtre stérilisé à l'étape de coupe et le montage d'une lame de rasoir stérile. Mouiller le papier filtre avec une solution de dissection stérilisés.
  5. Vaporiser un sac bio propre avec de l'alcool et le placer dans un écoulement laminaire banc propre.

3. hippocampe Dissection

  1. Vaporisez le raton P7 Sprague Dawley éthanol à 70% à l'extérieur du banc de nettoyage à écoulement laminaire et décapiter rapidement l'animal en utilisant de grands ciseaux chirurgicaux stériles à l'intérieur du banc de flux laminaire. Laissez tomber la tête en solution de dissection glacée dans l'une des boîtes de Pétri.
  2. Dans la boîte de Pétri, rincer le sang et les transférer à la tête de papier filtre stérilisé, de face ventrale rapidement.
  3. Utilisation du scalpel, couper le long de la surface dorsale dans le plan sagittal afin d'exposer le crâne sous-jacent. Couper à travers la peau, mais pas l'os sous-jacent, qui est doux et facilement pénétrable chez les rats de tson âge. Mettez de côté ce scalpel «sale» et ne pas utiliser sur les tissus du cerveau.
  4. Utilisation des petits ciseaux de dissecteur (inclinées à l'autre) et des pinces, couper ouvert le crâne long suture sagittale du crâne au bregma, le point anatomique sur le crâne où la suture coronale est coupée perpendiculairement par la suture sagittale. Utilisez une pince pour tirer volets du crâne et loin de la ligne médiane du crâne.
  5. Placez le micro cuillère sur la face inférieure du cerveau, en dessous du tronc cérébral, de soulever légèrement le cerveau sur le crâne. Soulevez le cerveau pour exposer les nerfs optiques et bulbe olfactif sur la surface de base de cerveau. Coupez ces structures avec de petits ciseaux à détacher entièrement le cerveau du crâne. Retirer et transférer le cerveau intact à l'autre grand plat de Pétri contenant une solution de dissection glacée.
  6. Utilisation de la micro cuillère, transférer le cerveau à un petit couvercle boîte de Petri contenant du papier filtre stérile. Avec une pipette Pasteur stérile, rincer le cerveau avec quelques gouttes de DISsecting solution pour maintenir le tissu humide.
  7. En utilisant une lame de scalpel "propre" couper les deux hémisphères à part. Transférer l'hémisphère arrière gauche à la grande boîte de Pétri avec micro cuillère et placez côté pia de l'hémisphère dans une solution de dissection glacée pour une utilisation ultérieure.
  8. Voir le visage médiale de l'hémisphère droit et identifier le cul de sac de bord, une bande importante de la matière blanche le long du bord médial de l'hippocampe. L'utilisation d'un scalpel stérile, faire une coupe sagittale à travers le cul de sac, mais attention, car seulement 0,5 cm de la pointe de scalpel seront suffisants pour couper le cul de sac.
  9. Utilisation de deux micro-spatules, supprimer le premier hippocampe de l'hémisphère droit en plaçant la main-spatule droite sur le tronc cérébral et la levée du cortex sus-jacente avec la spatule gauche. Soulevez doucement le cortex pour révéler le ventricule latéral et face médiale de l'hippocampe. Une ligne courbe blanche, la frange, doit maintenant être visible.
  10. Aligner la courbure de la spatule avec le curvature du fimbria et appuyez doucement sur la spatule sous la frange. Faites glisser la spatule à gauche et rouler le long de l'axe de rostrale-caudale et puis soulevez spatule direction dorsale pour enlever hippocampe.
  11. Transférer l'hippocampe à un deuxième petit plat 2 Petri avec une solution de dissection glacée. Répétez la même procédure sur l'hémisphère gauche pour retirer l'hippocampe gauche.
  12. Utilisation d'un micro-spatule, transférer soigneusement la hippocampes à l'étape de découpage de tissu. Disposer les adjacente et parallèle les uns aux autres et perpendiculaires à l'axe de la lame de hachage. Utilisez un pinceau pour positionner le tissu et ajouter quelques gouttes de la solution de dissection sur le dessus de l'hippocampe.
  13. Coupez le tissu dans 400 um tranches sans se arrêter pour enlever des tranches individuelles (en général, ils ne adhèrent pas à la lame). Après l'ensemble de l'hippocampe a été coupé, utilisez le pinceau pour transférer doucement les sections à un deuxième petit plat 2 Petri avec une solution de dissection.
  14. Sous annonceissecting microscope, séparer soigneusement les tranches flottantes utilisant amicro-spatule et le pinceau.
  15. Retirer la plaque de culture pré-préparés avec insert de culture de l'incubateur et le placer dans une hotte à flux laminaire.
  16. Avec une pipette Pasteur polie au feu, dessiner 4-5 tranches dans la pipette et de transfert des tranches à la surface apicale de la membrane de l'insert de culture. Ensuite, ajuster le positionnement avec un pinceau et laisser de l'espace entre les sections individuelles et la frontière de l'insert de culture.
  17. Avec une pipette Pasteur stérile, retirez la solution de dissection excès de surface apicale de la membrane.
    REMARQUE: Lors du retrait de solution éviter de tirer des coupes de tissus dans la pipette. Vous pouvez également utiliser une pipette régulière (P200 ou P1000) avec des embouts de pipette stérilisés pour éliminer lentement solution.
  18. Placer la plaque de culture par du milieu de culture contenant du sérum et les tranches d'hippocampe de nouveau dans l'incubateur à 35 ° C et 5% de CO 2.
    NOTE: Si les appels d'expérimentationpour générer des cultures à partir de plusieurs animaux, nettoyer soigneusement le banc de nettoyage à écoulement laminaire entre dissections. Instruments revenir à une solution d'alcool et remplacer tous les boîtes de Pétri, des papiers-filtres et des lames de rasoir stérile avant la deuxième dissection.

4. alimentation et en maintenant organotypiques tranches

  1. cultures d'alimentation dans un banc de nettoyage à écoulement laminaire stérile.
  2. Effectuer la première alimentation des sections de culture 2 jours post-dissection. Aspirer moyenne ancienne de culture en utilisant stérilisée pipette en verre.
  3. Utilisation stériles de 5 ml pipette sérologique pour ajouter 1 ml de milieu frais, stérile, contenant du sérum dans les puits.
  4. Replacez délicatement l'insert de culture et de prendre soin d'enlever les bulles d'air qui se sont formées sous la surface de la membrane.
  5. Après la première tétée, changement de milieu tous les deux jours.

5. en incubation des tranches de tissu avec de la thymidine analogues à l'étiquette du nouveau-né neurones

  1. Afin d'étudierla maturation et l'intégration des cellules granulaires du dentate dans l'hippocampe, incuber les tranches organotypiques avec un analogue de la thymidine, comme bromodésoxyuridine (BrdU) ou Chlorodeoxyuridine (CldU). Ici, nous utilisons CldU en raison de sa plus grande solubilité dans une solution saline.
  2. Après 3DIV, ajouter 1 pl de 10 mg ml solution mère / CldU dans une solution saline à 1 ml de milieu de culture pour une concentration finale de 10 pg / ml. Si BrdU est utilisé, corriger la concentration des différences de poids moléculaire. Ajouter à la moyenne avec CldU puits de culture et incuber le tissu avec un milieu contenant CldU pendant 2 heures à 35 ° C.
  3. Après 2 heures d'incubation à 35 ° C, éliminer le milieu CldU contenant et le remplacer par un milieu d'alimentation régulière de reprendre horaire d'alimentation normale (décrite ci-dessus).

6. Les tissus Fixation et stockage

  1. Établir un calendrier pour l'application de traitements et de fixation des échantillons de tissus avant de commencer les expériences de culture (figure 2B).
  2. A un post-dissection de jours prédéterminé, à préparer une hotte de laboratoire, ce qui suit: 10 à 50 ml d'un bêcher contenant 4% de paraformaldehyde (PFA) dans du tampon phosphate salin (PBS); un bécher vide milieu de culture mis au rebut; petite pince; et une pipette de 1 000 ml avec embouts jetables.
  3. Retirer la plaque (s) de culture provenant de la chambre d'incubation et le transfert d'une hotte de laboratoire. Inclinez les inserts et individuels de la plaque avec une pince. Ensuite, utilisez une pipette pour éliminer le milieu de culture et le transfert dans un bécher d'élimination. Inclinez la plaque de culture à un angle pour aider à assurer que tous les milieu de culture est retiré.
  4. Terminer la suppression moyenne pour une plaque de culture à la fois. Lorsque moyen a été supprimé, ajouter 1 ml de PFA 4% à chaque puits de culture et de bien sceller la plaque avec du parafilm. Répétez l'opération pour autant de plaques de culture que les plaques nécessaires et de transfert à un réfrigérateur à 4 ° C pendant 24 heures.
  5. Après 24 heures, préparer le suivant dans une hotte: 10-50 ml bécher contenant 0,1% d'azoture de sodium dans du PBS; un videbécher pour PFA rejetées (suivre les précautions de sécurité lors de l'élimination des substances toxiques); petite pince; et 1000 ml pipette à embouts jetables.
  6. Suivez la procédure décrite au point 6.4 pour ajouter PFA, mais ajouter 1 ml de PBS avec de l'azoture de sodium à la place. Une fois complètement transféré, les plaques d'étanchéité et pour un usage ultérieur en enveloppant les bords en parafilm et stockage dans un réfrigérateur à 4 ° C.

7. sectionnement tissus pour immunohistochimie

  1. Effectuer tissus coupe en utilisant un vibratome. La série d'étapes suivante aider à maximiser le rendement des coupes de tissus utilisables à partir de cultures organotypiques.
    REMARQUE: Immédiatement après la dissection de l'hippocampe et le placage de tranches, le tissu a une épaisseur d'environ 400 um. Toutefois, après 2 à 3 semaines dans la chambre d'incubation, des tranches de tissu vont commencer à se aplatir, ce qui entraîne une épaisseur de section finale de 150 à 300 um.
  2. Préparez les éléments suivants à la section tissu cultivé: un bistouri n ° 11 blade et à manipuler, une boîte de Pétri en verre contenant PBS glacé, un micro-dissection pince, et une étape de coupe de vibratome propre au tissu monter.
  3. Utiliser un scalpel pour couper soigneusement le long du périmètre de la membrane de l'insert circulaire de sorte qu'il peut être détaché du boîtier d'insertion en plastique. Laissez suffisamment d'espace entre la tranche de culture et le scalpel.
  4. Transférer la membrane insert détaché pour une boîte de Pétri contenant du PBS. Après rinçage dans du PBS, utiliser une pince pour transférer la membrane à l'étape de montage de vibratome.
  5. Ensuite, utilisez le scalpel pour éliminer l'excès de membrane entourant tranches de culture et de réduire les excès de matériau pour créer des bords nets. Cette étape assure que la membrane est plane et peut facilement adhérer à la surface de coupe.
  6. Placer 1-2 gouttes de colle sur la scène de coupe de vibratome et diffuser, même couche à l'aide d'une aiguille 22 G. Étendre l'adhésif en une forme rectangulaire avec le long bord parallèle à la lame de coupe de la vibratome. Effectuez cette étaperapidement, pour empêcher l'adhésif de sécher.
  7. Utilisez une pince pour transférer la membrane garni contenant des tranches d'hippocampe à l'étape de coupe et doucement positionner la membrane sur la colle et de se assurer qu'il n'y a pas de bulles d'air.
  8. Comme le superglue sèche, transférer la scène vibratome avec la membrane collée revenir à la boîte de Pétri contenant PBS. Préparer la lame de vibratome et contenant un azoture de sodium 48 et de la plaque pour stocker des sections de tissu.
  9. Utilisez le vibratome pour générer 30 um sections du tissu organotypique de tranche et le transfert à un contenant de l'azoture de sodium 48 de la plaque et pour le stockage et la coloration immunohistochimique suivante.
  10. Reportez-vous à des protocoles de coloration immunohistochimique 26,29 préexistants.

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Résultats

Déterminer si les cultures organotypiques seraient appropriés pour la recherche de la neurogenèse adulte nécessaires qu'ils remplissent deux critères principaux: 1) que les tranches conserver des caractéristiques morphologiques caractéristiques de tranches d'hippocampe après 10-21 jours in vitro (DIV), et 2) que DGCS nouveau-nés peuvent être quantifiés en utilisant des techniques immunohistochimiques standard habituellement utilisés dans la recherche de la neurogenèse adulte. En ce qui concerne le premi...

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Discussion

Après CldU (ou BrdU) l'administration, le calendrier d'application des agents pharmacologiques peut être choisi de cibler DGCS nouveau-né pendant particuliers fenêtres développement. Par exemple, un agent hypothétique peut être appliquée pendant la seconde injection semaines post-CldU, qui est proposé pour coïncider avec l'âge de neurones immatures qui sont à un stade de développement où GABA est dépolarisants. Les études futures utilisant ce protocole pourraient adapter l'agent pharmacologique et la fen...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par une subvention de recherche MOP 119271 à JMW par les Instituts de recherche en santé du Canada. Les auteurs tiennent à remercier Mme Yao Fang Tan pour l’assistance technique exceptionnelle qu’elle a fournie.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
5-chloro-2'-désoxyuridine (CldU)MP Biomedicals105478Dangereux, cancérigène
Inserts de culture cellulaire, 30 mm de diamètre, 0,4 & micro ; m taille des poresThermo scientific  ;140660revêtement Nuclon delta sur ces inserts offre une meilleure adhérence des tissus et améliore la qualité des tranches.
Tubes à centrifuger coniques (stériles)Fisher Scientific14-432-22
Ciseaux à dissection (inclinés sur le côté)Outils pour les sciences fines  ;14082-09
Milieu essentiel minimum (MEM)Gibco11095 ; liquideConserver à 4 ° ; C
Eclipse Ni-U microscopeNikon
Colle pour tissusKrazy GlueKG585Utilisez une quantité minimale de colle pour obtenir une adhérence car tout tissu exposé à la colle sera inutilisable pour l’IHC.
Hank' s Solution saline équilibrée (HBSS) (500 ml)Gibco14025-092Conserver à 4 ° ; C
Sérum de cheval inactivé à la chaleur (500 ml)Gibco16050-122Fabriquer 50 ml d’aliquotes et conserver à -20 ° ; C
KimwipesKimberly-ClarkeTW 31KYPBX
Pipettes en verre modifié (le bas de la pipette Pasteur a été retiré et le bord a été lissé à la flamme de Bunsen)
Boîte de Pétri (100 mm x 15 mm) et (60 mm x 15 mm)FB0875712 et FB0875713Ade marque Fisher
#11Fine Science Tools10011-00
Manche de scalpel #3Fine Science Tools10003-12
Pipettes sérologiquesSorfa Medical Plastic Co.P8050
Pince à motif standardOutils pour les sciences fines11000-12
Filtre à vide stérileThermo-Scientific565-0020
Ciseaux chirurgicauxOutils pour les sciences fines14054-13
Unité de filtration entraînée par seringueMillipore-MillexSLGP033RS
Hachoir à tissus avec platine mobileStoelting& nbsp ;51425
à pointe fine
Le fluorescent Lames de scalpel Pinceau

Références

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