Corréler spécifique du gène ADN changements méthylation avec l'expression et l'activité transcriptionnelle des astrocytes KCNJ10 (Kir4.1)

Summary

La méthylation de l’ADN est capable de maintenir des niveaux stables d’expression génique et de permettre des changements dynamiques dans l’expression des gènes en réponse à une variété de stimuli. Nous détaillons les techniques qui permettent d’étudier les changements spécifiques aux gènes dans la méthylation de l’ADN et l’effet de ces changements sur l’expression des gènes.

Abstract

La méthylation de l’ADN sert à réguler l’expression génique par la fixation covalente d’un groupe méthyle sur la position C5 d’une cytosine dans une cytosine-guanine dinucléotide. Alors que la méthylation de l’ADN fournit des changements durables et stables dans l’expression des gènes, les modèles et les niveaux de méthylation de l’ADN sont également sujets à des changements en fonction d’une variété de signaux et de stimuli. En tant que telle, la méthylation de l’ADN fonctionne comme un régulateur puissant et dynamique de l’expression des gènes. L’étude de la neuroépigénétique a révélé une variété d’états physiologiques et pathologiques associés à des changements globaux et spécifiques aux gènes dans la méthylation de l’ADN. Plus précisément, des corrélations frappantes entre les changements dans l’expression des gènes et la méthylation de l’ADN existent dans les troubles neuropsychiatriques et neurodégénératifs, pendant la plasticité synaptique et après une lésion du SNC. Cependant, alors que le domaine de la neuroépigénétique continue d’élargir sa compréhension du rôle de la méthylation de l’ADN dans la physiologie du SNC, il est essentiel de délimiter les relations causales en ce qui concerne les changements dans l’expression des gènes et la méthylation de l’ADN. De plus, en ce qui concerne le domaine plus large des neurosciences, la présence de vastes différences régionales et cellulaires nécessite des techniques qui tiennent compte de ces variances lors de l’étude du transcriptome, du protéome et de l’épigénome. Ici, nous décrivons le tri FACS des astrocytes corticaux qui permet l’examen ultérieur de la transcription de l’ARN et de la méthylation de l’ADN. De plus, nous détaillons une technique pour examiner la méthylation de l’ADN, l’analyse à haute résolution sensible à la méthylation (MS-HRMA) ainsi qu’un test de promoteur de la luciférase. Grâce à l’utilisation de ces techniques combinées, on est en mesure non seulement d’explorer les changements corrélatifs entre la méthylation de l’ADN et l’expression des gènes, mais aussi d’évaluer directement si les changements dans le statut de méthylation de l’ADN d’une région génique donnée sont suffisants pour affecter l’activité transcriptionnelle.

Introduction

L’épigénétique est l’étude des modifications chimiques qui peuvent affecter l’activité transcriptionnelle du génome. Essentiellement, sans changement dans la séquence d’ADN, les modifications épigénétiques telles que la méthylation de l’ADN, l’acétylation des histones et la méthylation des histones sont suffisantes pour modifier de manière réversible les modèles d’expression génique ¹. La méthylation de l’ADN, un puissant régulateur de l’expression des gènes, est la modification épigénétique la mieux caractérisée. La méthylation de l’ADN est la fixation covalente des groupes méthyles sur la position C5 d’une cytosine, généralement la cytosine d’une cytosine-guanine dinucléotide, également connue sous le nom de site CpG. Les zones qui contiennent une forte densité de sites CpG sont appelées îlots CpG (CGI). Les CGI sont fréquemment associés aux sites de départ transcriptionnel (TSS) et aux promoteurs de gènes ^{1 à 3}. Ainsi, alors que les changements dans la méthylation de l’ADN aux CGI ne sont pas toujours concomitants avec des changements dans l’expression ou la fonction cellulaire, les changements dans la méthylation de l’ADN aux CGI peuvent exercer une puissante régulation sur l’activité transcriptionnelle ².

Historiquement, la méthylation de l’ADN a été observée comme essentielle dans l’embryogenèse, l’empreinte et le développement, avec de petits changements dans les niveaux de méthylation de l’ADN se produisant dans les cellules post-mitotiques (à l’exception des altérations dans les gènes liés au cancer) ^4,5. Cependant, le domaine de la neuroépigénétique a mis en évidence un rôle non développemental important pour la méthylation de l’ADN. Plus précisément, l’épigénétique cognitive a redéfini la méthylation de l’ADN comme un mécanisme hautement plastique faisant partie intégrante de la médiation de l’activation transcriptionnelle et de la répression des gènes essentiels au processus d’apprentissage et de mémoire ⁶. Outre l’épigénétique cognitive, les études modélisant les lésions ischémiques et la douleur neuropathique caractérisent la méthylation de l’ADN comme un mécanisme labile qui répond rapidement à une variété d’agressions du SNC ^7-9. En ce qui concerne les astrocytes, plusieurs sources de preuves suggèrent que la méthylation de l’ADN joue un rôle important dans l’astrogliogenèse. Fan et al., ont constaté que la KO conditionnelle de DNMT1 dans les cellules progénitrices neurales (NPC) entraînait un développement précoce d’astrocytes concordant avec un état global d’hypométhylation ¹⁰. De plus, Perisic et al. ont conclu que les niveaux différentiels de méthylation de l’ADN du promoteur GLT-1 médiaient les niveaux différentiels d’expression du transporteur de glutamate dans le cortex et le cervelet, mettant l’accent sur un rôle dans la méthylation de l’ADN dans l’établissement de modèles spécifiques à la région cérébrale de l’expression des gènes astrocytaires ¹¹. Dans l’ensemble, de nombreuses études soulignent la nature dynamique et labile de la méthylation de l’ADN dans le SNC, car il a été démontré que l’environnement, les médicaments et les lésions modifient la méthylation de l’ADN et, souvent, l’expression des gènes ^4,9. Ensemble, ces études neuroépigénétiques indiquent que la méthylation de l’ADN est une cible thérapeutique réalisable ayant le potentiel d’atténuer une variété de pathologies du SNC.

À mesure que le domaine de l’épigénétique élargit sa compréhension du rôle de la méthylation de l’ADN dans le développement neurologique et la maladie, le défi de déplacer la méthylation de l’ADN vers une cible thérapeutique consiste à réaliser des études non seulement corrélatives, mais aussi causales qui définissent des cibles et des sites génétiques spécifiques. De plus, l’étude des changements dans la méthylation de l’ADN spécifiques à la région du cerveau et au type de cellule reste un défi continu et digne d’intérêt unique au domaine de la neuroépigénétique. Ce protocole utilise une variété de techniques, notamment le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) des astrocytes, l’analyse à haute résolution de la fusion sensible à la méthylation (MS-HRM) et un test de méthylation luciférase pour étudier l’état de méthylation de l’ADN de KCNJ10, un gène qui code pour Kir4.1. Kir4.1 est un canal potassique glial spécifique qui démontre à la fois des modèles d’expression spécifiques à la région du cerveau et aux cellules dans le SNC ^12-16. L’expression de Kir4.1 augmente en se déplaçant des régions rostrale vers les régions caudales du SNC, l’expression la plus élevée se produisant dans la moelle épinière ¹⁵. Bien que le canal soit exprimé dans les cellules épendymaires, les oligodendrocytes et leurs cellules précurseurs, Kir4.1 est principalement exprimé dans les astrocytes et est considéré comme essentiel pour maintenir les niveaux homéostatiques de potassium ainsi que pour soutenir l’absorption du glutamate en fixant le potentiel de membrane de repos astrocytaire à un -80mV hyperpolarisé ^12,16-19. Il est important de noter que l’expression de Kir4.1 est non statique à la fois pendant le développement et après plusieurs formes de lésions ^{du SNC 20-25}. Nous avons souhaité examiner la régulation épigénétique de ce canal, en particulier dans les astrocytes au cours du développement. Les techniques utilisées offrent des analyses de sites CpG spécifiques et ciblées qui fournissent des preuves causales d’un rôle de la méthylation de l’ADN dans la régulation de l’expression du gène KCNJ10. Ces techniques peuvent être appliquées à d’autres gènes.

Protocol

Tous les animaux ont été traités en conformité avec les Instituts nationaux de la santé des lignes directrices. Le soin et l'utilisation Comité animale de l'Université de l'Alabama à Birmingham a approuvé l'utilisation des animaux.

1. Obtenir l'ARN et l'ADN à partir d'une population enrichie en utilisant astrocytique cellulaire activé par fluorescence (FACS) des astrocytes Whole Brain Tissue

1. Animaux Sedate _avec le CO 2 pendant 1 min, puis décapiter rapidement. Disséquer cortex comme décrit dans Albuquerque et al, ^26.; il est pas nécessaire de retirer les méninges.
   Remarque: les rats transgéniques exprimant eGFP sous la S100β (un marqueur des astrocytes) promoteur ont été générés par Itakura et al ^{27 et} utilisés pour FACS tri des astrocytes..
2. Préparer homogénat de cerveau entier en utilisant un kit de dissociation de la papaïne dans des conditions non stériles selon le protocole du fabricant. Heat-activer la papaïne à 37 ° C au bain-marie pendant 10 min. Note:Solution de papaïne est fourni par le fabricant et qui contient la L-cystéine et de l'EDTA (voir le tableau des matériaux).
   1. Couper ou dremel un trou dans la partie supérieure d'un tube conique de 50 ml pour permettre à un tube de transport 95% O _2: 5% de CO ₂ pour être introduit dans un tube conique fermée (figure 1A). Placez cortex disséqués en 10mm boîte de culture contenant un milieu de dissociation (MEM complété avec 20 mM de glucose et de la pénicilline / streptomycine (500 U / ml) et équilibrée à 95% O _2: 5% de CO ₂₎ et d'utiliser une lame de rasoir propre pour hacher tissu dans 1 x 1 mm ^{2 pièces.}
3. Tissus de transfert en utilisant 10 ml de Pipteman manuel à 50 ml tube conique de solution contenant de la papaïne. Permettre au tissu de se déposer au fond de pipette de transfert avant de décharger de minimiser la quantité de support de dissociation reportés. Conserver la solution de papaïne équilibrée à 95% d'O _2: 5% de CO ₂ par l'intermédiaire d'un échange de gaz de la surface de la durée de l'incubation. Ne bulle papaïne solutisur. Incuber les tissus pendant 20 min dans 37 ° C bain d'eau.
4. Après incubation dans une solution de papaïne, la trituration tissu 10 fois avec une pipette 10 ml de transfert à vitesse lente. Centrifugeuse suspension cellulaire nuageux à 1000 g pendant 5 min à température ambiante.
   1. Equilibrer solution d'inhibiteur de DNase / albumine (fourni par le fabricant) par l'intermédiaire d'un échange de gaz de surface et remettre en suspension les cellules rassemblées en un culot dans 3 ml de solution d'inhibiteur / albumine de DNase. Préparer gradient de densité commerciale discontinue suivant les instructions du fabricant.
5. Spin gradient de densité discontinu à 1000 g pendant 6 min. Isoler les cellules dissociées du fond du tube en suçant culot fond à l'aide d'une pipette.
6. Re-suspendre cellules dissociées dans 3.2 ml de DPBS avec 0,02% d'albumine de sérum bovin et 1 mg / ml de DNase ou mises en mémoire tampon HEPES préférés milieux de culture. Passez à travers 40 um filtre avant FACS (figure 2A). Gardez cellules sur la glace jusqu'à ce que le tri.
   1. Effectuer FACS ^28.
   2. Cellules de culot dans 1,5 ml tubes de centrifugation à 2000 g pendant 5 min à 4 ° C.
      Remarque: Les astrocytes peuvent être utilisées sous forme de culot immédiatement ou conservés à -80 ° C jusqu'à l'extraction de l'ADN.
7. Extrait ARN et l'ADN en utilisant la méthode d'isolement préféré ^{29 30.} Évaluer l'ARN et de l'ADN et la concentration qualité via spectrophotomètre et bioanalyseur ^31.
   Remarque: Utilisez uniquement l'ARN de haute qualité et de l'ADN dans des étapes ultérieures, 260/280 = 2,0-2,2 et 1,8-1,9, respectivement. Bioanalyzer analyse est essentielle pour évaluer la dégradation des ARN ou fragmentation de l'ADN. ARN ou d'ADN peuvent être utilisées immédiatement ou stockées à -80 ° C ou -20 ° C, respectivement pour des études ultérieures.

2. Évaluer méthylation de l'ADN Statut d'un gène à l'aide sensible à la méthylation haute résolution Melt analyse (MS-AGRH)

1. Entrez séquence de gène d'intérêt dans le logiciel de cartographie de méthylation en ligne préféré pour identifier les îlots CpG dans le gèned'intérêt ^32.
   1. Conception des amorces contre converties au bisulfite de l'ADN ³³ séquence et amplifient l'aide d'ADN polymerase préférée selon le protocole du fabricant. Vérifier la taille du produit amplifié par l'exécution d'un gel d'ADN agarose à 1% à 100 V pendant 45 min. Amorces de magasins à concentration stock de 20 pm à -20 ° C.
2. Bisulfite convertir 500-1000 ng d'ADN de chaque échantillon et de l'ADN méthylé normes allant de 0-100% de ces mêmes espèces animales ^34. Éluées des échantillons pour fournir une concentration de 20 ng / ul. Vérifiez la concentration de l'ADN converti au bisulfite via spectrophotomètre ^31.
3. Configuration 20 réactions pi pour l'amplification MS-GRH utilisant polymérase et des amorces d'ADN préférée à une concentration de 5 uM selon le Tableau 1 et 2. Exécuter tous les échantillons, y compris l'ADN et méthylés normes FACS, en trois exemplaires.
4. Selon le logiciel d'analyse, définissez pré- et post démarrer et arrêter les paramètresautour des transitions de la courbe de fusion. Régler le début de pré-fusion et paramètres d'arrêt pré-fusion de sorte que la différence entre les deux est de 0,2 à 0,5 ° C. Set Start post-fusion et post-fusion arrêter similaire. Extraire des données de différence de température de pointe pour chaque échantillon.
5. Utilisation de normes pour cent méthylés (valeur Y) et de leurs différences de température moyenne de crête correspondantes (x-valeur) générer une équation de régression linéaire (figure 3A-B, tableau 4.3). Utiliser cette équation de régression linéaire pour estimer l'état de méthylation des ³⁵ échantillons inconnus.

3. Evaluation Hyper-méthylé activité promotrice par utilisation de Luciferase Assay

1. Identifier les îlots CpG de gène cible (étape 2.1). Amplifier par PCR des régions d'intérêt ^{36 et} clone en amont du Firefly gène rapporteur luciférase pour produire de luc2 plasmides CpG-île-luc2 ^37.
2. Linéariser 30 ug de plasmide CpG-île-luc2 via restriction³⁸ digestion enzymatique. Vérifiez les sites de digestion de restriction et éviter les coupures doubles en utilisant le logiciel de coupe préféré ^38. Inactiver les enzymes à la chaleur à la température et la durée appropriée après digestion selon le protocole du fabricant. Une perte minimale de l'ADN se produit au cours de l'étape de linéarisation.
3. Méthylations plasmides linéarisés en utilisant CpG méthylase (M.Sssl) O / N à 30 ° C non traitée ou laisser le protocole du fabricant de suite, sauf pour les ajustements suivants.
4. Effectuer des réactions de 50 pi.
5. Utilisez 5 unités de CpG méthylase de méthyler 700 ng de plasmide linéarisé.
6. Exécutez réactions O / N pour 13-19 h.
7. Après CpG réaction de méthylase, effectuer le nettoyage à l'aide d'ADN standard, disponibles dans le commerce membrane de gel de silice nettoyer kit selon le protocole du fabricant. Des pertes importantes de l'ADN se produisent suite à CpG réaction de méthylase, 30-60% de perte.
8. Vérifiez la méthylation de plasmides via une restriction Hpa II Digest.
9. Prendre 1 ug d'ADN méthylé ou non méthylé et digestion de restriction avec Hpa II pendant 1 heure à 37 ° C. Utilisez 5-10 unités de Hpa II pour chaque pg d'ADN. Après la digestion Hpa II, effectuer le nettoyage de l'ADN en utilisant une membrane disponible dans le commerce de gel de silice nettoyer kit préféré,. Exécuter deux plasmides méthylés et non méthylés CpG sur un gel d'agarose de l'ADN de 1% dans du tampon TAE ou TBE à 100 V pendant 45 min pour la visualisation (figure 4B).
10. Plasmides Sujet fois méthylés et non méthylés à double digestion avec des enzymes de restriction appropriées pour libérer toute la longueur luc 2 (vecteur) et l'île de CpG (insert) ³⁸ fragments. Effectuez double digestion O / N à la température appropriée et enzymes de chaleur inactiver après digestion selon le protocole du fabricant. Une perte minimale de la concentration de l'ADN se produit pendant deux digestion de restriction.
11. Exécutez plasmides double digestion sur gel ADN agarose à 1% à 100 V pendant 1 heure pour permettre la séparation of vecteur et insérez (figure 4C). Attention. Le port de protection UV écran facial, placer le gel de l'ADN sur une lumière noire de table à visualiser les bandes. Basé sur la taille, l'accise insert méthylé et non méthylé et non méthylé vecteur en utilisant une lame chirurgicale propre.
12. ADN extrait sur gel en utilisant du phénol saturé, pH 6,6. Brièvement, peser gel d'ADN contenant le vecteur ou insert. Utilisez 100 pi de phénol par 0,1 gramme de gel d'ADN. Homogénéiser gel de l'ADN dans le phénol utilisant dounce de verre homogénéisateur.
13. Ajouter chloroforme (en utilisant 1/5 du volume de phénol) et agiter les échantillons pendant 20 sec. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 2-3 min. Centrifugeuse pendant 15 min à la vitesse max (16,1 x 1000 XG) à 4 ° C.
14. Retirer solution aqueuse et ajouter le volume de 0,1X de 3 M d'acétate de sodium et le volume d'éthanol 2.5X. Incuber les échantillons pendant 1 heure à -80 ° C. Après l'incubation, éliminer l'éthanol et remettre en suspension l'ADN dans 30 ul de tampon préféré. Perte significative de l'ADN se produit l'isolement suivant des inserts et des vecteurs, 30-50% loss.
15. Re-ligaturer inserts méthylés et non méthylés à vecteur non-méthylé en utilisant l'ADN ligase T4 ^38. Utiliser un rapport de 1: 4 de vecteur à insérer pour des réactions de ligature. Réaction de configuration selon les instructions du fabricant. Utiliser un volume total de 50 pi pour les réactions et incuber O / N à -20 ° C ou sur de la glace avec couvercle sur le seau à glace.
16. Après la ligature, effectuez l'ADN en utilisant une membrane nettoyage disponible dans le commerce de gel de silice nettoyer kit préféré,. Perte significative de l'ADN se produisent après la réaction de ligature, environ une perte de l'ADN de 30-50%. Vérifier re-ligature en exécutant sur ​​gel à 1% d'agarose de l'ADN à 100 V pendant 45 min et à évaluer la concentration de plasmides re-ligaturé (figure 4D).
17. Transfecter des plasmides méthylés ou non méthylés dans des cellules D54 en utilisant un réactif de transfection du commerce, selon le protocole du fabricant. Cellules D54 de semences sur la plaque de 12 puits à 0,14 x 10 ⁶ cellules / puits.
18. Après 24 h, les cellules transfecter wides concentrations égales e de soit (1) plasmide non methyated CpG luc2 + Renilla ou un autre vecteur de contrôle de la luciférase ou (2) méthylé plasmide CpG luc2 + Renilla ou un autre vecteur de contrôle de la luciférase.
19. Laisser les cellules pour la transfection pendant 24 heures avant d'effectuer des dosages de la luciférase double. Effectuer dosage selon les instructions du fabricant. Effectuer des relevés au moyen d'un luminomètre. Lire chaque puits en triple.
20. Calculer le rapport de l'activité de la luciférase de luciole de Renilla ou une autre activité de la luciférase de contrôle. Normaliser Firefly méthylé: activité de la luciférase de commande Firefly non méthylé: activité de la luciférase de contrôle en divisant l'activité de la luciférase méthylé par l'activité de la luciférase non-méthylé

Results

Une population enrichie de astrocytes a été acquis par l'intermédiaire de tri FACS de eGFP-S100β animaux transgéniques ^27. En raison de la diminution de la qualité cellules et des molécules moléculaires isolées chez les animaux âgés de plus de 50 jours après la naissance (p50), les animaux âgés de P0-P40 sont optimales pour de telles expériences. Tissu cortical a été utilisé pour ces expériences. Cortex de deux à six animaux ont été mis en commun. FACS a été effectuée à l'installation complète UAB cytométrie ...

Discussion

Ce protocole décrit l’isolement d’une population enrichie d’astrocytes via FACS ainsi qu’une variété de techniques qui permettent des études à la fois corrélatives et causales entre la méthylation de l’ADN et l’expression génique. Ces techniques, utilisées isolément ou en combinaison, sont particulièrement utiles pour les laboratoires qui travaillent avec des tissus de haute hétérogénéité cellulaire ou qui s’intéressent à l’état de méthylation de l’ADN d’un gène ou d’une région génique particulière par rapport aux change...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Système de dissociation de la papaïne	Worthington Biochemical Corporation	LK003150
Mini kit d’ADN/ARN AllPrep	Qiagen	80204
Methyl Primer	en ligne	Biosystems	pour localiser les îles CpG Kit
méthylation de l’ADN EZ	Zymo Research	D5001
Rat Premixed Calibration Standard	EpiGenDx	80-8060R-Premix
CpG Méthylase (M.Sssl)	Zymo Research	E2010
QIAquick Gel Extraction  ;	QIagen	28704	Utilisé pour l’extraction de gel et le nettoyage de l’ADN
	Enzymes de restriction New England BioLabs
NEB cutter	New England BioLabs	vérification en ligne	sites de digestion
de restriction Dual Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1910
Luc2 vecteur, pGL4.10	Promega	E6651
renilla vecteur, pGL4.74	Promega	E2241
TD-20/20 Luminomètre	Turner Designs
Lipofectamine LTX et Plus Reagent	Life Technologies	A12621
Phénol, pH saturé 6,6/6,9	Fisher Scientific	BP 17501-100
Nanodrop 2000/2000c Spectrophtomètre	ThermoScientific
MeltDoctor Master Mix	Life Technologies	4415440
Logiciel de fusion haute résolution (HRM) v2.0	Life Technologies	4397808
Logiciel AB SDS v2.3	Life Technologies	en ligne
AB High Resolution Melting Guide de mise en route  ;	Life Technologies	en ligne
AB 7900HT Système rapide en temps réel	Life Technologies