Article de méthode

Virus de la grippe Propagation dans embryonnés de poulet Oeufs

DOI :

10.3791/52421

⸱

19 mars 2015

 , 
1Department of Medicine, Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Women's Guild Lung Institute, Cedars-Sinai Medical Center

Dans cet article

Résumé

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Les œufs de poule fertiles sont largement utilisés pour produire de grandes quantités de virus de la grippe A humaine, car ils constituent un système pratique et rentable pour prouver des rendements élevés de virus.

Résumé

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L'infection grippale est associée à environ 36 000 morts et plus de 200 000 hospitalisations chaque année aux États-Unis. L'émergence continue de nouvelles souches de virus de la grippe en raison de la mutation et de réassortiment complique le contrôle du virus et nécessite le développement permanent de nouveaux médicaments et vaccins. L'étude de la grippe en laboratoire nécessite une méthode fiable et rentable pour la propagation du virus. Ici, un protocole complet est fourni pour la grippe A propagation des virus dans des œufs de poule fertiles, ce qui donne toujours des stocks viraux à titre élevé. En bref, le sérum (SPF) des œufs de poule fécondés exempts d'agents pathogènes sont incubées à 37 ° C et 55-60% d'humidité pendant 10 à 11 jours. Sur cette période, le développement de l'embryon peut être facilement contrôlé en utilisant un candler d'oeuf. Virus inoculation est effectuée par injection de stock de virus dans la cavité allantoïque en utilisant une aiguille. Après 2 jours d'incubation à 37 ° C, les oeufs sontréfrigérés pendant au moins 4 heures à 4 ° C. La coquille d'oeuf au-dessus de la poche d'air et la membrane chorio-allantoïde sont ensuite ouvert avec précaution, et le fluide allantoïque contenant le virus est récolté. Le liquide est éliminé de débris par centrifugation, aliquoté et transféré à -80 ° C pour stockage à long terme. La grande quantité (5-10 ml de liquide par oeuf contenant virus) titre et de haute virus qui est habituellement obtenue avec ce protocole a fait l'utilisation d'œufs pour la préparation de virus notre méthode favorable, en particulier pour les études in vitro qui nécessitent de grandes quantités de virus où des dosages élevés de la même stock de virus sont nécessaires.

Introduction

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La grippe A continue d'être une menace majeure pour la santé humaine. Ce est une maladie respiratoire potentiellement dévastatrice avec une grande charge mondiale causant jusqu'à 500 000 décès dans le monde chaque année 1. Les virus grippaux sont dans la famille des Orthomyxoviridae et portent huit sens négatif ARN simple brin dans leur génome 1,2. La haute mutabilité (ce est à dire, "dérive" antigénique) du génome viral empêche immunité à long terme. En outre, la grippe est de plus en plus résistantes aux médicaments anti-viraux 3.

La pandémie de grippe H1N1 2009 a mis en évidence toutes les questions difficiles associés à la maladie de la grippe (souche pandémique, la résistance anti-virale, la production de vaccins retardé). La formulation de vaccin est déterminé annuellement par l'Organisation mondiale de la santé pour les souches de la grippe les plus susceptibles pathogènes (un pour chaque H1N1, H3N2 et la grippe B) 4. Parce que cette méthode est basée sur la souche de grippe annoncées, les souches pathogènes sont parfois mal identifiés et l'efficacité du vaccin diminue considérablement. En outre, l'apparition de nouvelles souches de la grippe peut contourner ces programmes de prévention en cas de pandémie provoquant la maladie 2.

La création d'un vaccin contre la grippe universelle a été difficile à atteindre 5. Par conséquent, la recherche doit se poursuivre dans la compréhension de la pathogenèse des lésions pulmonaires. Pour la recherche en laboratoire de l'installation, plusieurs méthodes ont été développées pour l'isolement du virus et la propagation 6. Virus de la grippe humaine peuvent être amplifiés dans une variété de substrats de cellules de mammifères. Cependant, générant virus de titre élevé en grandes quantités sont mieux atteints dans des oeufs embryonnés. Le protocole suivant décrit une technique pour la grippe A propagation du virus et le stockage de stocks de virus existants.

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Protocole

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NOTE: Remarques générales: Effectuer toutes les procédures impliquant la manipulation de l'œuf dans des conditions stériles, et la technique stérile doit être utilisé en conséquence. Pré-nettoyer tous les équipements avec 70% d'éthanol avant utilisation. En général, l'inoculation du virus de la grippe et la récolte doivent être effectués dans un laboratoire BSL-2. Toutefois, si ce protocole est utilisé pour propager beaucoup plus pathogène virus de la grippe (par exemple, les souches pandémiques et prépandémiques, souches qui présentent un danger pour la volaille et le bétail, les souches de la grippe aviaire hautement pathogène, le 1918 souche H1N1), les niveaux de biosécurité plus élevés et dans certains cas, des mesures de biosécurité et autorisations sont nécessaires. Le comité institutionnel de biosécurité locale devrait approuver toutes les recherches sur le virus de la grippe.

1. Préparation des oeufs pour l'inoculation

  1. Obtenir des œufs aviaires (SPF) exempts d'agents pathogènes fraîchement fécondé sériques d'un fournisseur approprié. Typiquement, des œufs de poule sont utilisés. Les œufs doivent être noused immédiatement à l'arrivée.
  2. À l'arrivée mettre les œufs dans un incubateur d'œufs humidifié avec un tourneur automatique des oeufs pour faire tourner les oeufs régulièrement. Si un tourneur automatique des oeufs ne est pas disponible, faire pivoter manuellement oeufs au moins 2 à 3 fois par jour (assurez-vous de porter des gants et de garder tout aussi stérile que possible).
  3. Incuber les œufs à 37 ° C et 55-60% d'humidité pendant 10 à 11 jours.

2. mirage des oeufs

  1. Utilisez un candler d'oeuf à examiner l'œuf devant une lumière vive dans une pièce sombre pour vérifier les œufs de l'infertilité par mirage après environ 7 ou 8 jours d'incubation.
    1. Essuyez le candler d'œuf avec 70% d'éthanol. Changer de gants souvent et désinfecter avec 70% d'éthanol afin de minimiser le risque de contamination par des agents pathogènes.
    2. Retirer les oeufs dans l'incubateur et les placer dans des boîtes d'œufs vides.
    3. Éteignez les lumières dans la salle.
    4. Maintenez la grande fin de chaque oeuf un à la fois contre le candler.
    5. Observez l'œuf Détermineze si elle est fertile ou infertile.
      REMARQUE: les vaisseaux sanguins minces conduisant à un embryon en forme de haricot doit être clairement visible. Les œufs non fécondés apparaissent comme une tache de sang petite avec un jaune d'œuf visible.
  2. Jeter les œufs qui sont fécondés, et retourner les oeufs viables à l'incubateur. Ne laissez pas œufs à l'extérieur de l'incubateur pendant plus de 30 min. Si l'état d'un œuf ne peut être confirmée, marquer, et observer plus tard.

3. Préparation de l'inoculum Virus

  1. Diluer virus de la grippe disponibles à environ 10 mars au 10 avril pfu / ml dans du PBS stérile contenant 10 mM HEPES (pH 7,4). Étape critique: Diluer le stock de virus immédiatement avant l'emploi et garder le virus dilué sur la glace tout le temps.

4. Virus de la grippe inoculation par voie allantoïdienne

  1. Le jour de l'inoculation du virus (jours 10 ou 11), bougie à nouveau les oeufs et éliminer les embryons morts. Distinguer embryons vivants parla recherche de mouvement à l'intérieur de l'œuf.
  2. Retirez trois oeufs de l'incubateur, et d'organiser les oeufs dans un support séparé avec le sac d'air vers le haut.
  3. Marquer l'espace aérien des oeufs avec un marqueur permanent.
  4. Laver la coquille dessus de l'espace aérien avec 70% d'éthanol.
  5. Mettez les œufs avec l'air l'espace dans une boîte d'œufs et dans une hotte de biosécurité (BSL-2).
  6. Utiliser une aiguille de 18G stérile pour percer un petit trou dans la coquille sur le sac d'air de chaque œuf. Veillez à ne pas insérer l'aiguille trop profondément pour éviter poignarder l'embryon ou le jaune.
  7. Dessinez le virus de la grippe diluée dans une seringue de 1 ml stérile et fixer une aiguille de 22G.
  8. Avancer avec précaution la seringue avec une aiguille à un angle dans la cavité allantoïdienne 45 °.
  9. Injecter 0,2 ml du virus dilué de la grippe.
  10. Répéter l'injection avec les deux autres oeufs, puis jeter la seringue et l'aiguille.
  11. Sceller le trou avec une goutte de colle à partir d'un pistolet à colle (ou de la cire de paraffine fondue). Be Veillez à ce que la colle ne fuit pas à l'intérieur de l'œuf.
  12. Placez les oeufs de nouveau dans l'incubateur d'œufs avec l'espace d'air pointé vers le haut.
  13. Répétez les étapes 4.2 à 4.12 jusqu'à ce que tous les oeufs ont été inoculés.

5. Temps d'incubation

  1. Incuber les œufs infectés sans tourner à 37 ° C et ~ 60% d'humidité.
  2. Choisir le temps d'incubation optimal en fonction du type de virus de la grippe. Incuber la grippe A pendant 48 h; incuber la grippe B et C pendant 72 heures.

6. Virus de la grippe récolte

  1. Après la période d'incubation, les oeufs refroidir à 4 ° C pendant un minimum de 4 heures (ou O / N) pour tuer l'embryon et la constriction des vaisseaux sanguins pour réduire le risque de contamination du fluide allantoïque infecté avec le sang. Pour ce faire, pour empêcher les globules rouges de l'absorption du virus, ce qui réduit le rendement. Alternativement, les œufs de refroidissement pendant 30 min à -20 ° C; Mais cela augmente le risque de contamination par le sang.
  2. Après les oeufs ont été suffisamment refroidi, transférer les oeufs à une hotte de biosécurité. Placez l'oeuf dans un support solide avec le sac d'air vers le haut. Nettoyer la surface de l'œuf avec 70% d'éthanol.
  3. Utilisez des ciseaux stériles pour ouvrir la coquille dessus de la poche d'air. Retirer la coquille autour de la poche d'air tout en faisant attention de ne pas détruire la membrane chorioallantoïque.
  4. Ouvrez la membrane chorioallantoïque avec des pinces stériles contondants. Déplacez doucement côté l'embryon et le sac jaune avec une petite spatule ou une cuillère. Prenez soin de ne pas rompre le jaune.
  5. L'utilisation d'un 1 ml pipette Eppendorf, recueillir soigneusement le fluide allantoïque. Si nécessaire, inclinez l'œuf un peu sur le côté pour recueillir autant de liquide que possible.
  6. Mélanger le liquide allantoïdien de tous les oeufs dans un tube en plastique conique de 50 ml. Garder les tubes sur la glace en tout temps pendant la récolte de virus. Un rendement d'oeufs 5-10 ml d'un fluide légèrement jaunâtre.
  7. Spin le fluide allantoïque contenant le virus à 1000 g pendant 10 min à 46; C pour sédimenter les débris. Transférer le liquide clair dans un nouveau tube de 50 ml conservé dans la glace. Éliminer œufs dans un conteneur à déchets BSL-2.

7. Stockage

  1. Aliquoter immédiatement le fluide clarifié allantoïdien (par exemple, 50, 100 ou 500 ul aliquotes) et enclenchez-gel dans l'azote liquide. Transfert stocks de virus congelés à -80 ° C congélateur pour le stockage à long terme.

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Résultats

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Plusieurs méthodes ont été développées pour titrer le virus de la grippe. Une considération lors du choix d'une méthode appropriée est que certains déterminer particules totales, indépendamment de la viabilité (par exemple, le dosage de l'hémagglutinine) alors que d'autres sont basés sur l'infectiosité, qui permettra d'évaluer virions viables (par exemple, essai de plaque) 6. Ici, le titre viral de liquide allantoïdien recueilli à partir d'œufs de poulet inoculés avec un virus de la grippe a...

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Discussion

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L'influenza cause une grande charge mondiale de morbidité, et le travail se poursuit dans la compréhension de la pathogenèse des lésions pulmonaires 7. Pour la recherche facilitée dans cette maladie mortelle, diverses méthodes ont été développées pour propager le virus de la grippe 6. Ici, nous décrivons une technique pour produire des virus de la grippe dans les oeufs de poulet. L'avantage de cette méthode est qu'il est hautement reproductible et se traduit par de grandes quantités de ...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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La présente étude a été financée par les subventions des NIH HL120947 (P.C.), HL103868 (P.C.) et l’American Heart Association Grant-in-Aid (P.C.)

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Cellgro  ;21-040-CV
de poule fécondés sans agent pathogène sérique (FPS)  ;VALO BioMedia
  ;FARM iNNOVATORSModèle 2100
retourneur d’œufs automatiqueFARM iNNOVATORSModèle 3200
bougie à œufsFARM iNNOVATORSModèle 3300  ;
Seringue de 1 mlBD Bioscience309659
aiguille 18GBD Bioscience305196
aiguille 20G / 22GBD Bioscience305176 / 305156
HEPESSigma-AldrichH3375
Éthanol>99,5 %Sigma-Aldrich459844dilué à 70 % à l’aide d’un
pistolet à colle à eau "Ad tech Hi Temp Projet Pro"Ad tech, Adhesive Technologies, Inc.Colle modèle 1105
« Ad tech MINI SIZE, Multi Temp"Ad tech, Adhesive Technologies, Inc.220-34ZIP30
Cellules MDCKATCCCRL-2935
Globules rouges de dinde lavés en pool, 10 %Laboratoires biologiquesLampire 724908
œufs Incubateur d’œufs humidifié

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Estimates of deaths associated with seasonal influenza --- United States, 1976-2007. MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).
  2. Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus. Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).
  3. Tumpey, T. M., Garcia-Sastre, A., et al. Pathogenicity of Influenza Viruses with Genes from the 1918 Pandemic Virus: Functional Roles of Alveolar Macrophages and Neutrophils in Limiting Virus Replication and Mortality in Mice. J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).
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  9. Robertson, J. S., Nicolson, C., Major, D., Robertson, E. W., Wood, J. M. The role of amniotic passage in the egg-adaptation of human influenza virus is revealed by haemagglutinin sequence analyses. J Gen Virol. 74 (Pt 10), 2047-2051 (1993).
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Mots-clés

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