Quantification de l&#39;immunosuppresseur tacrolimus sur des taches de sang séché en utilisant LC-MS / MS

Touraj Shokati; Nicholas Bodenberger; Holly Gadpaille; Björn Schniedewind; Alexander A. Vinks; Wenlei Jiang; Rita R. Alloway; Uwe Christians

doi:10.3791/52424

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Article de méthode

Quantification de l'immunosuppresseur tacrolimus sur des taches de sang séché en utilisant LC-MS / MS

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DOI :

10.3791/52424

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8 novembre 2015

Touraj Shokati¹ , Nicholas Bodenberger¹ , Holly Gadpaille¹ , Björn Schniedewind¹ , Alexander A. Vinks² , Wenlei Jiang³ , Rita R. Alloway⁴ , Uwe Christians¹

¹iC42 Clinical Research and Development, University of Colorado, Anschutz Medical Campus, ²Division of Clinical Pharmacology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, ³Food and Drug Administration (FDA), Center of Drug Evaluation Research - Office of Generic Drugs, ⁴Transplant Clinical Research, University of Cincinnati

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons ici un test de chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (HPLC-MS/MS) à haute performance pour quantifier l’immunosuppresseur tacrolimus dans des taches de sang séché à l’aide d’une simple étape manuelle de précipitation des protéines et d’une extraction en colonne en ligne.

Résumé

Le tacrolimus inhibiteur de la calcineurine est la pierre angulaire de la plupart des protocoles de traitement immunosuppresseur après une transplantation d'organe solide aux États-Unis. Tacrolimus est un médicament étroite indice thérapeutique et en tant que telle exige suivi thérapeutique et ajustement de la dose en fonction de l'ensemble de son concentrations résiduelles dans le sang. Pour faciliter la maison médicament thérapeutique et le suivi de l'adhésion, la collecte des taches de sang séché est un concept attrayant. Après un bâton de doigt, le patient perçoit une goutte de sang sur un papier filtre à la maison. Après que le sang est séché, il est envoyé au laboratoire d'analyse où le tacrolimus est quantifiée par liquide à haute performance chromatographie-spectrométrie de masse tandem (HPLC-MS / MS) en combinaison avec une étape protéines de précipitation manuel simple et l'extraction de la colonne en ligne.

Pour l'analyse de tacrolimus, un disque de 6 mm est poinçonnée du centre saturée de la tache de sang. La tache de sang est homogénéisé à l'aide d'une balle d'un mélangeure puis protéines sont précipitées avec du méthanol / 0,2 M ZnSO ₄ contenant le standard interne D _2, ¹³ C-tacrolimus. Après agitation au vortex et centrifugation, 100 ul de surnageant sont injectés dans une colonne d'extraction en ligne et on les lave avec 5 ml / min de 0,1 acide formique / acétonitrile (7: 3, v: v) pendant 1 min. Ci-après, la soupape de commutation est activé et les analytes sont contre-rinçage sur la colonne analytique (et séparé en utilisant un gradient d'acide formique / acétonitrile 0,1%). Le tacrolimus est quantifiée en mode positif de réaction multiples (MRM) en utilisant un spectromètre de masse en tandem.

Le dosage est linéaire de 1 à 50 ng / ml. La variabilité inter-essai (3,6% -6,1%) et la précision (91,7% -101,6%) selon l'évaluation de plus de 20 jours répondent aux critères d'acceptation. Récupération d'extraction moyenne est de 95,5%. Il n'y a pas de report, les interférences de matrice et les effets de matrice pertinente. Tacrolimus est stable dans des taches de sang séchées à température ambiante et à 4 ° C pendant 1 semaine. Les échantillons extraits dans leéchantillonneur automatique sont stables à 4 ° C pendant au moins 72 heures.

Introduction

Le tacrolimus est un puissant immonosuppressant ^1-7 qui a une structure de macrolide ⁸ (figure 1). En raison de cis - isomérie trans des liaisons CN il forme deux rotamères en solution ⁹ qui peuvent être séparés par chromatographie en phase liquide à haute performance en phase inverse (HPLC) Tacrolimus est lipophile et soluble dans les alcools (methanol: 653 g / L, de l'éthanol: 355 g / L), des hydrocarbures halogènes (chloroforme: 573 g / L) et de l'éther. Il est peu soluble dans les hydrocarbures aliphatiques (hexane: 0,1 g / L et de l'eau (pH 3:. 0,0047 g / L) ⁹ La molécule ....