Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Quantification de l'immunosuppresseur tacrolimus sur des taches de sang séché en utilisant LC-MS / MS

16.4K vues

⸱

DOI :

10.3791/52424

⸱

8 novembre 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1iC42 Clinical Research and Development, University of Colorado, Anschutz Medical Campus, 2Division of Clinical Pharmacology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 3Food and Drug Administration (FDA), Center of Drug Evaluation Research - Office of Generic Drugs, 4Transplant Clinical Research, University of Cincinnati

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons ici un test de chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (HPLC-MS/MS) à haute performance pour quantifier l’immunosuppresseur tacrolimus dans des taches de sang séché à l’aide d’une simple étape manuelle de précipitation des protéines et d’une extraction en colonne en ligne.

Résumé

Le tacrolimus inhibiteur de la calcineurine est la pierre angulaire de la plupart des protocoles de traitement immunosuppresseur après une transplantation d'organe solide aux États-Unis. Tacrolimus est un médicament étroite indice thérapeutique et en tant que telle exige suivi thérapeutique et ajustement de la dose en fonction de l'ensemble de son concentrations résiduelles dans le sang. Pour faciliter la maison médicament thérapeutique et le suivi de l'adhésion, la collecte des taches de sang séché est un concept attrayant. Après un bâton de doigt, le patient perçoit une goutte de sang sur un papier filtre à la maison. Après que le sang est séché, il est envoyé au laboratoire d'analyse où le tacrolimus est quantifiée par liquide à haute performance chromatographie-spectrométrie de masse tandem (HPLC-MS / MS) en combinaison avec une étape protéines de précipitation manuel simple et l'extraction de la colonne en ligne.

Pour l'analyse de tacrolimus, un disque de 6 mm est poinçonnée du centre saturée de la tache de sang. La tache de sang est homogénéisé à l'aide d'une balle d'un mélangeure puis protéines sont précipitées avec du méthanol / 0,2 M ZnSO 4 contenant le standard interne D 2, 13 C-tacrolimus. Après agitation au vortex et centrifugation, 100 ul de surnageant sont injectés dans une colonne d'extraction en ligne et on les lave avec 5 ml / min de 0,1 acide formique / acétonitrile (7: 3, v: v) pendant 1 min. Ci-après, la soupape de commutation est activé et les analytes sont contre-rinçage sur la colonne analytique (et séparé en utilisant un gradient d'acide formique / acétonitrile 0,1%). Le tacrolimus est quantifiée en mode positif de réaction multiples (MRM) en utilisant un spectromètre de masse en tandem.

Le dosage est linéaire de 1 à 50 ng / ml. La variabilité inter-essai (3,6% -6,1%) et la précision (91,7% -101,6%) selon l'évaluation de plus de 20 jours répondent aux critères d'acceptation. Récupération d'extraction moyenne est de 95,5%. Il n'y a pas de report, les interférences de matrice et les effets de matrice pertinente. Tacrolimus est stable dans des taches de sang séchées à température ambiante et à 4 ° C pendant 1 semaine. Les échantillons extraits dans leéchantillonneur automatique sont stables à 4 ° C pendant au moins 72 heures.

Introduction

Le tacrolimus est un puissant immonosuppressant 1-7 qui a une structure de macrolide 8 (figure 1). En raison de cis - isomérie trans des liaisons CN il forme deux rotamères en solution 9 qui peuvent être séparés par chromatographie en phase liquide à haute performance en phase inverse (HPLC) Tacrolimus est lipophile et soluble dans les alcools (methanol: 653 g / L, de l'éthanol: 355 g / L), des hydrocarbures halogènes (chloroforme: 573 g / L) et de l'éther. Il est peu soluble dans les hydrocarbures aliphatiques (hexane: 0,1 g / L et de l'eau (pH 3:. 0,0047 g / L) 9 La molécule ne contient pas de chromophore et son maximum d'absorption UV est de 192 nm tacrolimus agit par l'intermédiaire inhibition de la calcineurine. . Son mécanisme d'action a été examiné dans les références 10,11. Il est actuellement utilisé dans plus de 80% des patients transplantés organes solides aux Etats-Unis 12.

L'indice thérapeutique du tacrolimus est considered soit 13 étroite. En outre, la corrélation entre les doses de tacrolimus et les concentrations sanguines est pauvre et la pharmacocinétique est variable 14,15. Suivi des concentrations thérapeutiques pour guider tacrolimus dosage chez les patients transplantés est donc pratique clinique générale 16-20. L'objectif est de maintenir les concentrations sanguines de tacrolimus dans une plage thérapeutique pré-défini. Les concentrations sanguines de tacrolimus en dessous de la gamme thérapeutique peut entraîner une augmentation de l'activité des réactions d'allo-immunes chroniques ou aiguës, tandis que des concentrations supérieures à la fenêtre thérapeutique augmentent le risque de sur-immunosuppression, le cancer et la toxicité, tels que la néphrotoxicité, la neurotoxicité, l'hypertension et le diabète. Haute pharmacocinétique variabilité intra-individuelle de tacrolimus peut être préjudiciable à la fois organe de greffe et de la survie des patients 21,22. Bien variabilité inter-individuelle de la pharmacocinétique du tacrolimus est principalement causée par des polymorphismes de CYP3A5, pour des raisons intra-individuellela variabilité comprennent, mais ne sont pas limités à des interactions médicament-médicament, la maladie-médicaments et de la nourriture-médicaments 14,15. Aussi le manque d'adhésion à la thérapeutique régime de médicament immunosuppresseur est un facteur et une raison majeure de perte du greffon 23,24.

Ces considérations suggèrent que la maison fréquente médicament thérapeutique et le suivi de l'observance des concentrations de tacrolimus sur sang total peut être bénéfique pour assurer que les patients ont une exposition de tacrolimus dans la fenêtre thérapeutique souhaité en tout temps. Cependant, la logistique et le coût de la surveillance plus fréquente de drogue thérapeutique comme il est de pratique clinique actuelle 15 est prohibitif. Une des raisons est que le patient doit voir un préleveur d'avoir l'échantillon de sang veineux nécessaire dessinée. Taches de sang séché ont récemment émergé comme un concept attrayant 25-28. Après un doigt simple coller le patient recueille une goutte de sang sur une carte de papier filtre spécial et la tache de sang a DRied, il peut être envoyé à un laboratoire central pour l'analyse de tacrolimus et de tout autre immunosuppresseur que le patient peut actuellement être pris. Ceci est devenu possible grâce à la mise au point de dosages LC-MS / MS hautement sensibles et spécifiques pour la quantification de tacrolimus et d'autres immunosuppresseurs dans de très petits volumes de sang tels que des taches de sang séché (typiquement 20 ul de sang) 25,29-43. Un autre avantage est que, les stratégies de collecte minimalement invasives faibles volumes d'échantillon tels que des taches de sang séché facilitent grandement suivi thérapeutique et des études pharmacocinétiques chez les petits enfants 28.

Tacrolimus est généralement mesurée en toute EDTA sang veineux 15. Les raisons sont que le tacrolimus distribue principalement dans les cellules de sang et que des études cliniques ont signalé des meilleure corrélation entre les concentrations résiduelles de tacrolimus dans le sang que dans le plasma à des événements cliniques 15,18. En comparaison, l'analyse de tacrolimus en taches de sang séché est basée sur sang capillaire qui est mélangée avec la matrice de papier-filtre. Cela pose des défis en termes de solubilisation de tacrolimus et les interférences potentielles avec l'analyse LC-MS / MS. Ici, nous présentons un test établi et validé sur la base de l'homogénéisation de la tache de sang séché en utilisant un mélangeur de balle en combinaison avec un débit élevé échantillon de colonne ligne nettoyer procédure et l'analyse LC-MS / MS. En date d'aujourd'hui, ce test a été utilisé avec succès pour la quantification de plus de cinq mille tacrolimus séchée échantillons de taches de sang pour le suivi de l'observance dans les essais cliniques.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Des échantillons de sang de-identifiés de personnes en bonne santé ont été de l'Université de Colorado Hospital (Aurora, Colorado). L'utilisation d'échantillons sanguins bancaires dépersonnalisées pour les études de validation ainsi que pour la préparation des étalons et d'échantillons de contrôle de qualité a été considéré comme «exonéré» par le Conseil Colorado multi-institutionnel de révision (COMIRB, Aurora, Colorado).

1. Préparation de références et Solutions

  1. Achat tacrolimus et l'étalon interne D 2, 13 C-tacrolimus auprès des vendeurs figurant dans la liste des matériaux.
    1. Préparation des solutions mères dans du methanol pur à une concentration de 1 mg / ml pour le tacrolimus et une concentration de 10 ug / ml pour 13 D 2, C-tacrolimus. Assurez solutions de stockage de matériaux de référence basé sur trois pondérations indépendants. Aliquote solutions mères et conserver à -70 ° C ou moins.
  2. Préparer la solution pour précipiter les protéineset extraire le tacrolimus en utilisant du méthanol / 0,2 M ZnSO 4 dans l'eau (7: 3, v: v). Cette solution contient également de l'étalon interne D 2, C-13 tacrolimus à une concentration de 2,5 ng / ml et est utilisé pour l'extraction de tous les échantillons à l'exception de l'extraction des échantillons à blanc (s'il vous plaît voir 1.3.3).
    1. Préparer cette solution de protéines de précipitation fraîchement chaque jour d'extraction et définir l'expiration de la solution à 12 h.
  3. Préparation de la courbe d'étalonnage et de contrôle de qualité (QC) échantillons
    1. Préparer des solutions mères de tacrolimus en effectuant des dilutions appropriées de la solution mère en utilisant du méthanol pur.
    2. Pour préparer les étalons et les échantillons de contrôle de la qualité, spike 20 pi de solution stock diluée de manière appropriée dans le sang total EDTA, incuber à 37 ° C sous agitation dans un bain d'eau douce pour permettre une distribution homogène de tacrolimus dans les composants cellulaires du sang pour 20 min et aliquote dans 1,5 ml polyperopylene tubes à fond conique et enfichable sur les couvercles. Assurez-vous que le volume relatif de solvant organique ne dépasse pas 5%.
    3. Point 50 pi du sang total à pointes dans le milieu de chaque cercle sur les cartes de filtre à l'aide d'une pipette.
    4. Sécher les taches de sang sur les cartes de filtre à la température ambiante pendant 3 heures.
    5. Préparer des normes d'étalonnage de tacrolimus dans le sang total humain de l'EDTA à des concentrations de tacrolimus de 1, 2,5, 5, 10, 25, et 50 ng / ml. Préparer un échantillon à blanc pour l'extraction comme les normes d'étalonnage avec la solution de protéines de précipitation contenant le standard interne D 2, 13 C-tacrolimus («échantillon zéro").
    6. Préparer les échantillons de CQ en tout EDTA sang humain à des concentrations de 0, 2, 4, 20, 40 ng / ml. Préparer un échantillon témoin. A la différence des échantillons QC qui sont extraits par précipitation contenant le standard interne D 2, C-13 tacrolimus, extraire cette solution échantillon à blanc avec la protéine de précipitations qui faitpas contenir de l'étalon interne D 2, 13 C-tacrolimus ("échantillon blanc").
  4. Collection d'échantillons cliniques
    1. Recueillir taches de sang séché comme décrit dans 43,44.

2. Extraction de Tacrolimus sang séché des échantillons ponctuels

  1. Visuellement inspecter la tache de sang séché pour assurer une qualité acceptable et le volume 45 échantillon.
  2. Frappe du centre tache de sang sur la carte du filtre avec une perforation de 6 mm.
    Remarque: La qualité des poinçons peut être contrôlée par pesée. Un disque de filtre saturé de poing pèse en moyenne 5,02 mg ± 0,09 mg (gamme: 4.83- 5.14 mg, n = 12).
  3. La place des disques dans 1,5 ml tubes en polypropylène à fond conique et couvercles encliquetables.
  4. Ajouter 20-30 balles à chaque tube.
  5. Ajouter 500 ul de la solution de précipitation de protéines (methanol: 0,2 M ZnSO 4, 7: 3, v: v à 2,5 ng / ml d'étalon interne) dans chaque tube. Pour l'extraction des échantillons blancs, utiliser la solution de précipitation des protéines sans l'étalon interne.
  6. Homogénéiser les disques dans le mélangeur de balle pendant 1 min (vitesse maximale, le réglage "10").
  7. Agiter les échantillons à température ambiante sur la multi-tubes vortex (vitesse maximale, le réglage "10") pendant 10 min.
  8. Centrifuger les échantillons à 16 000 x g et 4 ° C pendant 10 min.
  9. Transférer le surnageant dans des flacons de HPLC en verre équipé d'un insert de 300 ul. Utilisez pré-fente joints en téflon.
    Remarque: Extrait échantillons peuvent être conservés à -20 ° C ou moins jusqu'à l'analyse LC-MS / MS.

3. LC-MS / MS Analysis

  1. Charge: 100 pi de surnageant de l'extrait de l'échantillon sur la colonne d'extraction de la cartouche d'C8 et laver avec un 7: 3 de l'acide formique à 0,1% dans l'eau: acétonitrile à un débit de 5 ml / min pendant 1 min. Les connexions de la soupape de commutation sont représentés sur la figure 2 et le gradient gérées par la pompe d'extraction dans le tableau 1 .
  2. Ci-après, activer la soupape de commutation résultant à l'arrière-ras des analytes de la pré-colonne sur la colonne analytique.
  3. Réglez la colonne thermostat à 65 ° C.
  4. Éluer les analytes de la colonne analytique à l'aide des débits et gradient indiquées dans le tableau 1.
  5. Branchez la colonne analytique à un spectromètre de masse en tandem via la source d'ionisation électrospray turbo. Régler les paramètres clés du spectromètre de masse selon le tableau 2.
  6. Détecter les ions positifs ([M + Na] +) de dans le mode de réaction multiple (MRM). Utilisez les transitions d'ions suivants pour la quantification: tacrolimus: m / z (masse / charge) = 826,6 → 616,2 et D 2, 13 C-tacrolimus: m / z = 829,6 → 619,2.
    Remarque: La durée totale est de 4,6 min.

4. Quantification

  1. Pour chaque terme, générer une courbe d'étalonnage sur la base des calibrateurs préparés et 1.3.5inclure dans chaque série d'analyses.
    1. Générer une courbe d'étalonnage en portant les concentrations nominales par rapport facteur d'analyte de réponse (Peak [Analyte] / Peak [étalon interne]) en utilisant le logiciel du spectromètre de masse.
    2. Monter les calibrateurs en utilisant un ajustement quadratique en combinaison avec 1 / X pondération.
  2. Pour la quantité de tacrolimus dans les taches de sang séché intégrer le tacrolimus et de l'étalon interne dans les chromatogrammes MRM extraites. Calculer le facteur de réponse pour le tacrolimus (Peak [Analyte] / Peak [étalon interne]) et comparer avec la courbe d'étalonnage en utilisant le logiciel de spectrométrie de masse.

5. Les procédures de validation

  1. Limite inférieure de détection (LLOD) et la limite inférieure de quantification (LIQ).
    1. Considérons la plus faible concentration de tacrolimus avec un rapport de crête à bruit de 4: 1 comme limite inférieure de détection (LLOD). Définir la limite inférieure de quantification (LIQ) en tant quela plus faible concentration de la courbe d'étalonnage avec une précision égale ou supérieure à ± 20% d'écart de la concentration nominale et une précision égale ou supérieure à 20% (coefficient de variation).
  2. Intra- et précision inter-jour et précisions.
    1. Testez l'exactitude et la précision à quatre niveaux de 2 ng / ml (QC1), 4 ng / ml (QC2), 20 ng / ml (QC3) et 40 ng / ml (QC4) concentration.
    2. Préparer les échantillons QC de chaque jour de la validation dans le sang total EDTA humain, sèche sur les cartes de filtre, extraire et analyser comme décrit ci-dessus.
    3. Déterminer la précision intra-jour et la précision avec 6 échantillons par niveau de concentration de QC.
    4. Évaluer la précision inter-journée et une précision de plus de 20 jours. Mesurer chaque niveau QC avec 4 échantillons par jour.
    5. Analyser les deux courbes d'étalonnage avec des échantillons QC de chaque jour.
    6. Calculer la précision intra-jour que le% de la concentration nominale (six échantillons par niveau de concentration, s'il vous plaît voir 5.2.2). Calculer précision que le coefficient de variance (CV%).
    7. Envisager la précision intra-day acceptable si elle tombe dans l'acceptation limite de 85% à 115% de la concentration nominale. Considérez précision intra-day acceptable si elle est égale ou supérieure à un CV (coefficient de variation) de 15%.
    8. Calculer la précision inter-jour et de précision que la moyenne pour chaque niveau de concentration QC analysé au cours des 20 jours de validation.
    9. Envisager la précision moyenne inter-jour acceptable si elle tombe dans l'acceptation limite de 85% à 115% de la concentration nominale. Considérons précision inter-jour acceptable si elle est égale ou supérieure à une CV (coefficient de variation) de 15%.
  3. Exclusion des interférences de la matrice.
    1. Pour l'exclusion des interférences qui peuvent être causés par des signaux de la matrice, d'analyser taches blanches séchées de sang (8 individus différents, de préférence 4 hommes et 4 femmes).
    2. Inspecter visuellement chromatogrammes ioniques. Si pics dans le temps de rétentionfenêtre de tacrolimus sont détectés, d'intégrer et de comparer leurs domaines sous la courbe avec celles des pics de tacrolimus dans les échantillons blancs enrichis avec le tacrolimus à la LLOQ. La zone de pics dans les échantillons blancs ne sont pas censés dépasser 15% de ceux de tacrolimus à la LLOQ.
  4. Ion suppression / amélioration d'ions.
    1. Utiliser un protocole de perfusion post-colonne telle que décrite 45 pour évaluer l'interférence potentielle de renforcement ion suppression / d'ions provoquée par des composants de matrice de co-élution.
    2. Infuser le tacrolimus à une concentration de 10 pg / ml dissous dans de l'acide formique à 0,1%: methanol (30:70, v / v) post-colonne à un débit de 10 ul / min.
      1. Raccorder une pompe à seringue par l'intermédiaire de la pièce en T entre la colonne analytique et de la source d'électronébulisation le spectromètre de masse.
      2. Surveiller l'intensité du signal MS / MS des transitions MRM tacrolimus et son étalon interne (m / z = 826,6 → 616,2 et m / z = 829,6 → 619,2) après injection de extracTED échantillons blancs (n = 8 échantillons provenant d'individus différents).
        Remarque: En l'absence d'amélioration ions suppression / ion du signal continu causé par perfusion des analytes ne devrait pas être affectée par l'injection de la matrice de blanc, tandis que la suppression d'ions provoque un plongeon du signal et de l'ion amélioration un pic.
  5. Reporter.
    1. Évaluer le potentiel de report en analysant extrait des échantillons blancs après les plus hauts calibrateurs (50 ng / ml, n = 6).
    2. Inspecter visuellement chromatogrammes ioniques. Si des pics dans la fenêtre de temps de rétention de tacrolimus sont détectés, d'intégrer et de comparer leurs domaines sous la courbe avec celles des pics de tacrolimus dans les échantillons blancs enrichis avec le tacrolimus à la LLOQ. La zone de pics dans les échantillons blancs ne sont pas censés dépasser 15% de ceux de tacrolimus à la LLOQ.
  6. Recouvrements d'extraction.
    1. Déterminer les recouvrements en comparant les signaux des analytes après extraction de QC samples à tous les quatre niveaux de concentration (n = 6) par concentration avec ceux des vierges taches de sang séché dopés avec des quantités correspondantes de tacrolimus après l'extraction.
    2. Préparer quatre ensembles de cercles de qualité (taux de concentration: 2, 4, 20, 40 ng / ml).
    3. Préparer 4 autres ensembles de «échantillons de test de récupération" correspondant en repérant 50 pi de sang total EDTA vierge sur les cartes de papier filtre et le séchage pendant 2 heures.
    4. Ci-après, à la fois pour le QC et «échantillons de test de récupération" vierges, découper la tache de sang entier sur la carte du filtre avec des ciseaux et placez les disques résultant dans un tube en polypropylène à fond conique et le couvercle snap-on.
    5. Extraire tous les échantillons.
    6. Transférer les surnageants (400 pi) dans des flacons de HPLC de verre.
    7. Ajouter la solution tacrolimus boursier pour les «échantillons de test de récupération extrait" vierges pour atteindre des concentrations de 2, 4, 20 et 40 ng / ml (4 pi de 200, 400, 2000, 4000 ng ml tacrolimus Stock sol /utions à 400 ul de surnageant).
    8. Après analyse LC-MS / MS, comparer les signaux dans les deux échantillons QC et échantillons d'essai "de récupération" de la concentration correspondante (récupération =% des échantillons de signaux avant que les échantillons dopés extraction / signaux dopés après extraction x 100).
  7. L'intégrité de dilution.
    1. Établir l'intégrité de la dilution en utilisant des échantillons enrichis avec des analytes à 500, 250 et 100 ng / ml.
    2. Après extraction, diluer les échantillons en utilisant une solution de protéine de précipitation (1:10, n = 3 par niveau de concentration).
    3. Calculer écarts par rapport aux concentrations nominales. Examiner les résultats qui relèvent de 85% -115% de la valeur nominale acceptable.
  8. Stabilités.
    1. Enquêter stabilités en utilisant les échantillons QC à tous les quatre niveaux de concentration (n = 4 par concentration) ont analysé à différents points dans le temps et dans les différentes conditions d'entreposage.
    2. Comparer les résultats après stockage avec les valeurs nominales. Considérez résultats qui relèvent de 85% -115% de la valeur nominale acceptable.
    3. Établir la stabilité de l'échantillon pendant 1 semaine à la température ambiante, 1 semaine à 4 ° C, 1 mois à -20 ° C et 1 mois à -80 ° C.
    4. Test de stabilité gel-dégel sur trois cycles (-20 ° C). Essai échantillon extrait et la stabilité de l'échantillonneur automatique en plaçant des échantillons dans l'échantillonneur automatique thermostaté réglé à 4 ° C. Injecter échantillons après 72 h.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Chromatogrammes d'ions représentatifs d'un échantillon témoin, un échantillon enrichi à la limite inférieure de quantification et un échantillon de patient sont présentés dans la figure 3.

Courbes d'étalonnage

La limite inférieure de détection était de 0,5 ng / ml et la limite inférieure de quantification était de 1,0 ng / ml. Cinquante ng / ml a été choisi comme étalon le plus élevé que des concentrations plus élevées sont peu suscep...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Bien que, comme mentionné ci-dessus, la notion de médicament thérapeutique et le suivi de l'observance du tacrolimus sur la base de taches de sang séché est attrayant, il ya des défis analytiques qui vont au-delà de ceux qui sont habituellement associés à l'analyse LC-MS / MS du tacrolimus dans EDTA veineuse échantillons de sang total. Ceux-ci comprennent, mais sans y être limités, le fait que la matrice est du sang total capillaire trempé dans la matière des linters de coton de la matière de carte de filtre uti...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le contrat de la Federal Drug Administration (FDA) des États-Unis HHSF223201310224C et la subvention 1U01FD004573-01 des National Institutes of Health/FDA des États-Unis.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
TacrolimusU.S. Pharmacopeial Convention1642802
D2,13C-TacrolimusToronto Research Chemicals Inc.
Cellules rougesHôpital de l’Université du ColoradoW20091305500 V
Plasma Hôpitalde l’Université du ColoradoW2017130556300Q
Acétone CHROMASOLV, HPLC, &ge ; 99,9 %Sigma-Aldrich439126-4 L
Acétonitrile Optima LC/MS, UHPLC-UVThermo Fisher ScientificA955-4
Isopropanol 99,9 %, HPLCFisher ScientificBP2632-4
Méthanol Optima LC/MSThermo Fisher ScientificA452-4
Eau Optima LC/MS, UHPLC-UVThermo Fisher ScientificW6-4
Acide formiqueThermo Fisher ScientificA118P-500
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Sigma-AldrichD8537
Sulfate de zincThermo Fisher ScientificZ68-500
0,5 &ndash ; 10 &ndash ; pipette l, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008649
tube Eppendorf 1,5 mlThermo Fisher Scientific02-682-550
10 &ndash ; 100 & micro ; l pipette, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008651
10 &mu ; l pointes de pipette avec filtre, stérilesNeptuneBT 10XLS3
100 &ndash ; 1 000 & micro ; pipette, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008653
100 &mu ; l pointes de pipette avec filtre, stérilesNeptuneBT 100
1 000 &mu ; l pointes de pipette avec filtre, stérilesMultimax2940
2 &ndash ; 20 & micro ; pipette VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008650
tube Eppendorf de 2 mlThermo Fisher Scientific02-681-258
20 &ndash ; 200 & micro ; pipette, VoluMate LIQUISYSTEMSMettler Toledo17008652
20 &mu ; l pointes de pipette avec filtre, stérilesGeneMateP-1237-20
200 &mu ; l pointes de pipette avec filtreMultimax2938T
200 &mu ; l pointes de pipette avec filtre, stérilesMultimax2936J
50 ml Tube FalconBD Falcon352070
300 &mu ; l inserts pour flacons HPLCPhenomenexARO-9973-13
Balance PR2002Mettler Toledo1117050723
Balances AX205 Delta RangeMettler Toledo1119343379
Bullet Blender HomogénéisateurNext AdvanceBBX24
Centrifugeuse Biofuge FrescoHeraeus290395
Lingettes jetablesPDIQ55172
Verres en verre, 4 mlThermo Fisher Scientific14-955-334
Flacons en verre, 20 mlGants Thermo Fisher ScientificB7800-20
, gants en nitrilede marque Titan Flacons44-100S
, 9 mm, 2 ml, transparentPhenomenexARO- 9921-13
Couvercles pour flacons HPLCPhenomenexARO- 8952-13-B
Aiguille, 18 G 1,5Precision Glide305196
Rack pour tubes EppendorfThermo Fisher Scientific03-448-11
Rack pour flacons HPLCThermo Fisher Scientific05-541-29
Perles d’acier 0,9 &ndash ; 2 mmNext AdvanceSSB14B
Boîtes de rangement pour congélateurs / réfrigérateursThermo Fisher Scientific03-395-464
Vortex multitubes standardVWR Scientific Products658816-115
Papier Whatman, 903 Protein Saver US 100/PKGE Whatman  ;2016-05
Échantillonneurautomatique CTC PAL  ;ami. HTCABIx1
Pompe binaire, Agilent 1260 InfinityAgilent Technologies1260 G1312B
Pompe binaire, Agilent 1290 InfinityAgilent Technologies1290 G4220A
Micro dégazeur sous vide, Agilent 1260Agilent Technologies1260 G13798
Four à colonne,  ; Agilent 1290 avec 2 positions  ;Agilent Technologies1290 G1216C
Compartiment de colonne thermostaté avec vanne de commutation 6 ports intégréeAgilent Technologies1290 G1316C
Cartouche pré-colonne HPLC, Zorbax XDB C8 (5 µ ; m taille des particules), 4,6 & middot ; ColonnePhenomenex820950-926
, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 & micro ; m taille des particules), 4,6 & middot ; 150 mmPhenomenex993967-906
de masse tandem
API5000 MS/MS avec source TurboIonsprayAB Sciex4364257
Logiciel de spectrométrie de masseAB SciexAnalyst 1.5.1
F370002 HPLC analytique HPLC de 12,5 mmSpectromètre

Références

  1. Goto, T., et al. Discovery of FK506, a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 19 (5 Suppl 6), 4-8 (1987).
  2. Kino, T., Hatanaka, H., Miyata, S. FK506, a novel immunosuppressant isolated from a streptomyces. I: Fermentation, isolation and physico-chemical and biological characteristics. J. Antibiotics. 40 (9), 1249-1255 (1987).
  3. Starzl, T. E., et al. FK506 for liver, kidney and pancreas transplantation. Lancet. 2 (8670), 1000-1004 (1989).
  4. Randomised trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporin in prevention of liver allograft rejection. European FK506 Multicentre Liver Study Group. Lancet. 344 (8920), 423-428 (1994).
  5. A comparison of tacrolimus (FK 506) and cyclosporine for immunosuppression in liver transplantation. The U.S. Multicenter FK506 Liver Study Group. N. Engl. J. Med. 331 (17), 1110-1115 (1994).
  6. Mayer, A. D., et al. Multicenter randomized trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporine in the prevention of renal allograft rejection: a report of the European Tacrolimus Multicenter Renal Study Group. Transplantation. 64 (3), 436-443 (1997).
  7. Pirsch, J. D., Miller, J., Deierhoi, M. H., Vincenti, F., Filo, R. S. A comparison of tacrolimus (FK506) and cyclosporine for immunosuppression after cadaveric renal transplantation. FK506 Kidney Transplant Study Group. Transplantation. 15 (7), 977-983 (1997).
  8. Tanaka, H., et al. Physicochemical properties of FK506 a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 14 ((5 Suppl 6)), 11-16 (1987).
  9. Spencer, C. M., Goa, K. L., Gills, J. C. Tacrolimus. An update of its pharmacology and clinical efficacy in the management of organ transplantation. Drugs. 54 (6), 925-975 (1997).
  10. Clipstone, N. A., Crabtree, G. R. Identification of calcineurin as a key signalling enzyme in T-lymphocyte activation. Nature. 357 (6380), 695-697 (1992).
  11. Barbarino, J. M., Staatz, C. E., Venkataramanan, R., Klein, T. E., Altman, R. B. PharmGKB summary: cyclosporine and tacrolimus pathways. Pharmacogenet. Genomics. 23 (10), 563-585 (2013).
  12. Annual Data Report. , Department of Health and Human Services, Health Resources and Services Administration, Healthcare Systems Bureau, Division of Transplantation. Available from: http://optn.transplant.hrsa.gov/data/annualreport.asp (2014).
  13. Draft Guidance on Tacrolimus. , Food and Drug Administration, Office of Generic Drugs. Available from: http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM181006.pdf (2012).
  14. Christians, U., Benet, L. Z., Lampen, A. Mechanisms of clinically significant drug interactions associated with tacrolimus. Clin. Pharmacokinet. 41 (11), 813-851 (2002).
  15. Christians, U., Pokaiyavananichkul, T., Chan, L. Tacrolimus In: Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. Principles of Therapeutic Drug Monitoring. Burton, M. E., Shaw, L. M., Schentag, J. J., Evans, W. ebb , 4th Edition, Lipincott, Wiliams, and Wilkins. =Baltimore. 529-562 (2005).
  16. Holt, D. W., et al. International Federation of Clinical Chemistry/ International Association of Therapeutic Drug Monitoring and Clinical Toxicology working group on immunosuppressive drug monitoring. Ther. Drug Monit. 24 (1), 59-67 (2002).
  17. Holt, D. W., Jones, K., Lee, T., Stadler, P., Johnston, A. Quality assessment issues of new immunosuppressive drugs and experimental experience. Ther. Drug Monit. 18 (4), 362-367 (1996).
  18. Jusko, W. J., et al. Consensus document: therapeutic drug monitoring of tacrolimus (FK-506). Ther. Drug Monit. 17 (6), 606-614 (1995).
  19. Oellerich, M., et al. Therapeutic drug monitoring of cyclosporine and tacrolimus. Update on Lake Louise Conference on cyclosporine and tacrolimus. Clin. Biochem. 31 (5), 309-316 (1998).
  20. Wong, S. H. Therapeutic drug monitoring for immunosuppressants. Clin. Chim. Acta. 313 (1-2), 241-253 (2001).
  21. Kahan, B. D., et al. Low intraindividual variability of cyclosporin A exposure reduces chronic rejection incidence and health care costs. J. Am. Soc. Nephrol. 11 (6), 1122-1131 (2000).
  22. Kahan, B. D., et al. Variable oral absorption of cyclosporine. A biopharmaceutical risk factor for chronic renal allograft rejection. Transplantation. 62 (5), 599-606 (1996).
  23. Kelly, D. A. Current issues in pediatric transplantation. Pediatr. Transplant. 10 (6), 712-720 (2006).
  24. Spivey, C. A., Chisholm-Burns, M. A., Damadzadeh, B., Billheimer, D. Determining the effect of immunosuppressant adherence on graft failure risk among renal transplant recipients. Clin. Transplant. 28 (1), 96-104 (2014).
  25. Taylor, P. J., Tai, C. H., Franklin, M. E., Pillans, P. I. The current role of liquid chromatography-tandem mass spectrometry in therapeutic drug monitoring of immunosuppressant and antiretroviral drugs. Clin. Biochem. 44 (1), 14-20 (2011).
  26. Edelbroek, P. M., van der Heijden, J., Stolk, L. M. Dried blood spot methods in therapeutic drug monitoring: methods, assays, and pitfalls. Ther. Drug Monit. 31 (3), 327-336 (2009).
  27. Meesters, R. J., Hooff, G. P. State-of-the-art dried blood spot analysis: an overview of recent advances and future trends. Bioanalysis. 5 (17), 2187-2208 (2013).
  28. Pandya, H. C., Spooner, N., Mulla, H. Dried blood spots, pharmacokinetic studies and better medicines for children. Bioanalysis. 3 (7), 779-786 (2011).
  29. Koster, R. A., Alffenaar, J. W., Greijdanus, B., Uges, D. R. Fast LC-MS/MS analysis of tacrolimus, sirolimus, everolimus and cyclosporin A in dried blood spots and the influence of the hematocrit and immunosuppressant concentration on recovery. Talanta. 115 (Oct 15), 47-54 (2013).
  30. Hinchliffe, E., Adaway, J., Fildes, J., Rowan, A., Keevil, B. G. Therapeutic drug monitoring of ciclosporin A and tacrolimus in heart lung transplant patients using dried blood spots. Ann Clin. Biochem. 51 (Pt 1), 106-109 (2014).
  31. Koop, D. R., Bleyle, L. A., Munar, M., Cherala, G., Al-Uzri, A. Analysis of tacrolimus and creatinine from a single dried blood spot using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 926 ((May 1)), 54-61 (2013).
  32. Sadilkova, K., Busby, B., Dickerson, J. A., Rutledge, J. C., Jack, R. M. Clinical validation and implementation of a multiplexed immunosuppressant assay in dried blood spots by LC-MS/MS. Clin. Chim. Acta.. 421 ((Jun 5)), 152-156 (2013).
  33. Li, Q., Cao, D., Huang, Y., Xu, H., Yu, C., Li, Z. Development and validation of a sensitive LC-MS/MS method for determination of tacrolimus on dried blood spots. Biomed. Chromatogr. 27 (3), 327-334 (2013).
  34. Hinchliffe, E., Adaway, J. E., Keevil, B. G. Simultaneous measurement of cyclosporin A and tacrolimus from dried blood spots by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 883-884 ((Feb 1)), 102-107 (2012).
  35. Webb, N. J., Roberts, D., Preziosi, R., Keevil, B. G. Fingerprick blood samples can be used to accurately measure tacrolimus levels by tandem mass spectrometry). Pediatr. Transplant. 9 (6), 729-733 (2005).
  36. Keevil, B. G., Fildes, J., Baynes, A., Yonan, N. Liquid chromatography-mass spectrometry measurement of tacrolimus in finger-prick samples compared with venous whole blood samples. Ann. Clin. Biochem. 46 (Pt 2), 144-145 (2009).
  37. Yonan, N., Martyszczuk, R., Machaal, A., Baynes, A., Keevil, B. G. Monitoring of cyclosporine levels in transplant recipients using self-administered fingerprick sampling. Clin. Transpl. 20 (2), 221-225 (2006).
  38. Keevil, B. G., et al. Simultaneous and rapid analysis of cyclosporin A and creatinine in finger prick blood samples using liquid chromatography tandem mass spectrometry and its application in C2 monitoring. Ther Drug Monit. 24 (6), 757-767 (2002).
  39. Hoogtanders, K., et al. Dried blood spot measurement of tacrolimus is promising for patient monitoring. Transplantation. 83 (2), 237-238 (2007).
  40. Heijden, J., et al. Therapeutic drug monitoring of everolimus using the dried blood spot method in combination with liquid chromatography-mass spectrometry. J. Pharm. Biomed. Anal. 50 (4), 664-670 (2009).
  41. Cheung, C. Y., et al. Dried blood spot measurement: application in tacrolimus monitoring using limited sampling strategy and abbreviated AUC estimation. Transpl. Int. 21 (2), 140-145 (2008).
  42. Hoogtanders, K., et al. Therapeutic drug monitoring of tacrolimus with the dried blood spot method. J. Pharm. Biomed. Anal. 44 (3), 658-664 (2007).
  43. Wilhelm, A. J., den Burger, C. J., Vos, R. M., Chahbouni, A., Sinjewel, A. Analysis of cyclosporin A in dried blood spots using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877 (14-15), 1595-1598 (2009).
  44. Ostler, M. W., Porter, J. H., Buxton, M. O. Dried blood spot collection of health biomarkers to maximize participation in population studies. J. Vis. Exp. (83), e50973(2014).
  45. Hannon, H. W., et al. Blood collection on filter paper for neonatal screening programs, approved standard LA4-A5. , Clinical Laboratory and Standards Institute. Available from: http://www.clsi.org (2007).
  46. Schäfer, P., Störtzel, M., Vogt, S., Weinmann, W. Ion suppression effects in liquid chromatography-electrospray-ionisation transport-region collision induced dissociation mass spectrometry with different serum extraction methods for systematic toxicological analysis with mass spectra libraries. J. Chromatogr. B. 773 (1), 47-52 (2002).
  47. Peck, H. R., Timko, D. M., Landmark, J. D., Stickle, D. F. A survey of apparent blood volumes and sample geometries among filter paper bloodspot samples submitted for lead screening. Clin. Chim. Acta. 400 (1-2), 103-106 (2009).
  48. Christians, U., et al. Automated, fast and sensitive quantification of drugs in blood by liquid chromatography-mass spectrometry with on-line extraction: immunosuppressants. J. Chromatogr. B. 748 (1), 41-53 (2000).
  49. Clavijo, C., et al. Development and validation of a semi-automated assay for the highly sensitive quantification of Biolimus A9 in human whole blood using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877 (29), 3506-3514 (2009).
  50. Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J. Nutr. 131 (5), S1631-S1636 (2001).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Quantification du tacrolimusanalyse par LC MS MSpr cipitation des prot inesextraction sur colonne en lignemode de r action multiplecourbe d talonnagetalon internepunchage de gouttes de sanghomog n isation par Bullet Blender
Quantification de l'immunosuppresseur tacrolimus sur des taches de sang séché en utilisant LC-MS / MS
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.