Le but de ce protocole est de démontrer les principes et les techniques de mesure et de calcul du débit de filtration glomérulaire, du débit urinaire et de l’excrétion de sodium et de potassium chez un rat. Cette démonstration peut être utilisée pour fournir aux étudiants une compréhension conceptuelle globale de la façon de mesurer la fonction rénale.
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Article de méthode
Laboratoire de Physiologie et de démonstration: taux de filtration glomérulaire dans un Rat
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les mesures du débit de filtration glomérulaire (DFG) et de l’excrétion fractionnée de sodium (Na) et de potassium (K) sont essentielles pour évaluer la fonction rénale dans la santé et la maladie. Le DFG est mesuré comme la clairance rénale à l’état d’équilibre de l’inuline qui est filtrée au niveau du glomérule, mais qui n’est pas sécrétée ou réabsorbée le long du néphron. L’excrétion fractionnée de Na et de K peut être déterminée à partir de la concentration de Na et de K dans le plasma et l’urine. La clairance rénale de l’inuline peut être démontrée chez un animal anesthésié qui a des cathéters dans l’artère fémorale, la veine fémorale et la vessie. L’équipement et les fournitures utilisés pour cette procédure sont ceux qui sont couramment disponibles dans une plateforme de recherche, ce qui fait de cette procédure un moyen pratique de mesurer la fonction rénale. Le but de cette vidéo est de démontrer les procédures requises pour effectuer une démonstration en laboratoire dans laquelle la fonction rénale est évaluée avant et après un médicament diurétique. La technique présentée peut être utilisée pour évaluer la fonction rénale dans des modèles de maladie rénale chez le rat.
Introduction
La fonction la plus importante du rein est la régulation homéostatique de la teneur en eau et en électrolytes extracellulaires. Les reins régulent étroitement l’eau extracellulaire, le sodium (Na) et le potassium (K) pour maintenir des niveaux physiologiques normaux. Les troubles de la fonction rénale peuvent entraîner de graves troubles métaboliques qui peuvent être mortels. Le processus rénal de base se produit dans le néphron et commence par la filtration du plasma au niveau du glomérule et se termine par l’excrétion de l’urine. D’autres processus qui déterminent la concentration finale de l’eau, du Na et du K dans l’urine sont la sécrétion et la réabsorption dans le néphron. Les mesures du débit de filtration glomérulaire (DFG) et de l’excrétion fractionnée de Na et de K sont essentielles pour évaluer la fonction rénale dans la santé et la maladie. Le lecteur est invité à consulter des articles de synthèse et des manuels déjà publiés pour une discussion plus approfondie de la fonction rénale1-4.
< classe p = 'jove_content'> DFG peut être mesuré comme la clairance rénale à l’état d’équilibre de l’inuline qui est filtrée au niveau du glomérule, mais non sécrétée ou réabsorbée le long du néphron5. Bien que cette technique nécessite une anesthésie, une préparation chirurgicale et une expérience terminale, elle est considérée comme l’étalon-or de la mesure du DFG. À l’aide d’inuline marquée avec de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC), la concentration plasmatique et urinaire de FITC-inuline peut être facilement mesurée en petits volumes et utilisée pour calculer le DFG à plusieurs moments d’une expérience. L’excrétion fractionnée de Na et de K peut être déterminée à partir de la concentration de Na et de K dans le plasma et l’urine.La compréhension conceptuelle de la façon de mesurer la fonction rénale peut facilement être démontrée dans un court laboratoire conçu pour permettre aux étudiants de participer activement à certains aspects de l’expérience. Cette vidéo présente la préparation pré-laboratoire, la démonstration de la fonction rénale et l’évaluation post-laboratoire des résultats. Les techniques chirurgicales nécessaires pour mesurer le DFG sont démontrées chez un rat anesthésié. De plus, des exemples de calculs pour le DFG et l’excrétion fractionnelle de Na et de K sont présentés avant et après l’administration d’un médicament diurétique.
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Protocole
Avant toute procédure d'animaux, les soins des animaux et l'utilisation comité institutionnel (IACUC) doit approuver le protocole. Ce protocole a été approuvé par l'Université Michigan State IACUC.
1. Préparation pré-lab de Solution FITC-inuline
- Chaud 20 ml d'une solution saline à 70 ° C et agiter lentement à 100 mg de FITC-inuline (5 mg / ml de FITC-inuline) jusqu'à ce que toute l'inuline se dissout.
- Solution refroidir à température ambiante et ajouter 800 mg d'albumine de sérum bovin (40 mg / ml de BSA, de la poudre lyophilisée, essentiellement globuline libre, endotoxine faible, ≥98% de pureté par électrophorèse sur gel d'agarose).
- Filtrer la solution inuline-BSA avec du papier filtre (grade 1). Placer la solution filtrée dans une seringue de 20 ml avec un filtre seringue pointe (0,2 um) et couvrir de papier d'aluminium pour protéger de la lumière.
2. anesthésie et la chirurgie
- Placez le rat dans une chambre d'induction rempli avec 5% d'isoflurane pour induire une anesthésie. bod d'enregistrementpoids y (250-350 g) et de placer le rat sur une plate-forme chirurgicale chauffé conçu pour maintenir 37 ° C la température du corps pendant toute l'expérience. Sécuriser doucement le rat à la plate-forme avec la bande de laboratoire sur les pattes. Maintenir l'anesthésie avec 1-2% d'isoflurane avec qualité médicale 100% O 2 au taux de 0,8-1,0 L / min de débit d'air.
- Insérer un cathéter conique (pointe de OD intravasculaire, 2.7f) dans l'artère fémorale pour la pression artérielle et la surveillance de la fréquence cardiaque, et le prélèvement de sang.
- Insérer un cathéter (PE-50) dans la veine fémorale pour l'injection d'inuline. Fixez le cathéter aux tissus de soie tressée 5-O suture chirurgicale 6 environnante.
- Attacher le cathéter artériel à un transducteur de pression à jauge de contrainte. Enregistrez la pression artérielle et le rythme cardiaque en utilisant le logiciel d'acquisition de données et l'affichage sur un écran d'ordinateur en temps réel. Cette technique est démontrée en détail sur la vidéo 6.
- Exposer la vessie par une incision sus-pubienne. Coupez un petittrou dans la pointe de la vessie et d'insérer une canule (PE-190) avec une chaleur évasées pointe intérieur de la vessie pour la collecte d'urine. Fixez la canule à la vessie avec une suture en bourse.
3. L'urine et de prélèvement sanguin
- Placer la seringue de FITC-inuline dans une pompe à seringue avec un débit fixé de 1 ml / h pour 100 g de poids corporel (3 ml / h pour un rat pesant 300 g). Fixer la seringue au cathéter de la veine fémorale. Lancer la perfusion de l'inuline et de permettre une période d'équilibrage de 1-2 h. Gardez seringue recouverts d'une feuille de protéger de la lumière.
- Déterminer si le taux d'écoulement de l'urine est stable et appropriée pour l'analyse de l'échantillon (20 pl / min) en recueillant un échantillon d'urine dans un flacon pré-pesé collecte pendant une période de 10 min. Déterminer le volume d'urine par gravimétrie avec une échelle numérique. Un volume d'urine pendant une période adéquate de collecte de 10 min est de 0,2 ml. Continuer à prélever des échantillons d'urine jusqu'à ce que deux collections consécutives indiquent un taux de 20 pi / m d'écoulement d'urineou plus.
- Échantillons de pré-drogues
- Prélever un échantillon d'urine pendant une période de 20 min. Prélever un échantillon de sang (0,5 ml) à partir du cathéter artériel au point milieu de la période de collecte d'urine. Soyez prudent pour dégager complètement le cathéter artériel de solution saline avant de recueillir un échantillon de sang dans un flacon de collection contenant 1 U héparine. Utiliser les flacons de collecte avec des marques de volume pour faciliter la collecte de 0,5 ml de sang artériel.
- Rincer le cathéter artériel avec une solution saline à l'héparine (20 U / ml) pour effacer le cathéter de sang (env. 0,1 ml). La longueur du cathéter artériel doit être aussi court que possible afin de limiter le volume de solution saline à l'héparine requis pour rincer.
Remarque: des échantillons de sang dilué produisent des calculs inexacts de DFG et l'excrétion fractionnaire de Na et K. - Attendre 10 min, et répéter la collecte de l'urine une seconde pré-médicament et de l'échantillon de sang.
- Après la collecte de deux échantillons de pré-drogue, administrer un diurétique drug, furosémide (10 mg / kg), par l'intermédiaire du cathéter artériel. Rincer le cathéter artériel avec une solution saline héparinée pour effacer le cathéter de médicament. Faire attention à empêcher l'injection d'air à travers le cathéter artériel. Notez l'heure de l'injection de furosémide.
- Les échantillons post-médicaments: A chacun des points dans le temps 3 ci-dessous, de recueillir un échantillon d'urine pendant une période de collecte de 10 min, et un échantillon de sang (0,5 ml) au milieu de la période de collecte d'urine.
- Pour l'échantillon post-Drug 1 - recueillir cinq minutes après le furosémide.
- Pour l'échantillon post-Drug 2 - recueillir dix minutes après le furosémide.
- Pour l'échantillon post-Drug 3 - recueillir quinze minutes après le furosémide.
- Lorsque tous les échantillons ont été collectés, euthanasier le rat conformément aux procédures institutionnelles par thoracotomie et l'ablation du cœur. Retirez les deux reins. Décapsuler (retirer la membrane entourant) et efface les reins à éliminer l'excès de sang. Peser les reins.
4. Analyse des échantillons
- Mesurer tous les volumes d'échantillon d'urine par gravimétrie avec une balance numérique, et des poids records.
- Centrifugeuse échantillons de sang entier avec une centrifugeuse de table (1800 xg) pour séparer le plasma. Transférer des échantillons de plasma de petits flacons étiquetés.
- Analyser concentrations de Na et K dans les échantillons d'urine et de plasma avec un analyseur de sodium / potassium.
- Mesure de FITC-inuline dans le plasma et l'urine
- Diluer l'urine pré-drogue (de 1: 200 à 1: 400), et l'urine post-drogue (1:10) avec un tampon HEPES (500 mM, pH 7,4).
- Ajouter 40 pi de pi étalon ou d'échantillon et 60 de tampon HEPES dans une plaque de 96 puits (un échantillon par puits) et de permettre à mélanger pendant 10 min tout recouvert d'une feuille d'aluminium.
- Générer une courbe d'étalonnage pour FITC-inuline pour des concentrations de 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 ug / ml (Figure 1). Déterminer FITC-inuline fluorescence dans les échantillons et les normes en utilisant un lecteur de microplaques avec son excitations et d'émission des longueurs d'onde de 485 nm et 538, respectivement.
- Monter les valeurs fluorescents pour les normes à une fonction logistique analyse de régression de 4 paramter. Les paramètres de la fonction de régression sont utilisés pour calculer la concentration FITC-inuline dans des échantillons de plasma et d'urine (tableau 1).
5. Analyse post-laboratoire des résultats: Calculs
- Calculer urine Débit (UV; ml / min): [volume d'urine recueillis (ml)] ÷ [moment de la collecte (min)]
- Calculer débit de filtration glomérulaire (GFR; ml / min): [concentration d'inuline urine (pg / ml) x UV (ml / min)] ÷ [Plasma inuline conc. (Ug / ml)]
- Calculer la charge filtrée de sodium (pmol / min): concentration en sodium du plasma (umoles / ml) x DFG (ml / min)
- Calculer l'excrétion de sodium Taux (U Na V; pmol / min): la concentration de sodium dans l'urine (pmol / ml) x UV (ml / min)
- Calculer fractionnaire excrétion de sodium (FE Na;%): [U Na V (pmol / min)] ÷ [Charge de sodium filtré (pmol / min)] x 100
- Calculer la charge filtrée potassium (pmol / min): Plasma concentration de potassium (umol / ml) x DFG (ml / min)
- Calculer excrétion de potassium Taux (U K V; pmol / min): la concentration de potassium dans l'urine (pmol / ml) x UV (ml / min)
- Calculer fractionnaire excrétion de potassium (K FE;%): [U K V (pmol / min)] ÷ [Charge de potassium filtrée (pmol / min)] x 100
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Résultats
Le diurétique utilisé dans la démonstration de laboratoire était furosémide qui inhibe très rapidement la réabsorption de Na et K filtré par le rein entraînant une augmentation de Na, K, et l'excrétion de l'eau dans les minutes suivant l'administration du médicament. Par son mécanisme primaire, furosémide devrait avoir des effets minimes sur GFR et la charge filtrée de Na et K, mais va augmenter le flux d'urine et l'excrétion fractionnaire de Na et K.
Les résultats représ...
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Discussion
Un marqueur approprié pour la mesure de GFR doit répondre à quatre critères: être filtré librement le glomérule, non liée aux protéines plasmatiques, et ni être absorbé ni sécrétée dans le néphron. L'inuline est un polymère de fructose qui satisfait à ces critères. En conséquence, la clairance rénale de l'inuline est considéré comme l'étalon-or pour mesurer GFR 7. La technique démontrée représente l'approche traditionnelle de la détermination de la clairance rénale de l'inuline à partir de...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrentes. Les opinions ou affirmations contenues dans ce document sont les opinions personnelles de l'auteur et ne doivent pas être interprétées comme fonctionnaire ou comme reflétant les vues du Département de l'armée ou du ministère de la Défense.
Remerciements
La source de financement pour la démonstration de laboratoire était NIGMS subvention: GM077119. Nous remercions le Dr Joseph R. Haywood et le Dr Peter Cobbett pour leur soutien de la Couse court intégrative et orgue Systems pharmacologie. Nous remercions également Mme Hannah Garver pour son soutien technique de la démonstration de laboratoire.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 5-0 Suture chirurgicale en soie tressée | Surgical Specialties Corp | SP1033 | |
| Plaque de dosage, 96 puits | Costar ; | 3922 | |
| Albumine sérique bovine | Sigma Chemical Co | A2934-25G | |
| Centrifugeuse | Beckman Coulter | MicroFuge 18, 357160 | |
| Tubes d’échantillonnage coniques | Dot Scientific Inc. ; | #711-FTG | |
| Applicateurs à pointe de coton | Solon Manufacturing Co | 56200 | |
| Logiciel d’acquisition de données | ADInstruments | LabChart Pro 7.0 | |
| Balance numérique ; | Denver Instrument | APX-4001 | |
| FITC-Inulin | Sigma Chemical Co | F3272-1G | |
| Éponges de gaze | Covidien | 2146 | |
| Lit chirurgical chauffé | EZ-Anesthesia | EZ-212 | |
| Héparine | Sagnet | NDC 25021-402-10 | |
| HEPES | Sigma Chemical Co | H3375 | |
| Isoflurane | Abbott Animal Health | IsoFlo, 5260-04-05 | |
| Vaporisateur d’isoflurane | EZ-Anesthesia | EZ-190F | |
| Micro Dissection | Forceps Biomedical Research Instruments Inc. | 70-1020 | |
| Lecteur de microplaques - Fluoroskan | ThermoScientific | Ascent FL, 5210460 | |
| Analyseur de sodium/potassium NOVA 5+ | NOVA BioMedical | 14156 | |
| Porte-aiguilles Olsen-Hegar avec ciseaux | Outils scientifiques fins | 12002-12 | |
| PE-190 (pour cathéter vésical) | BD Medical | 427435 | |
| Transducteur de pression& nbsp ; | ADInstruments | MLT1199 | |
| Pyrex Culture Tubes | Corning Inc. | 99445-12 | |
| Cathéter artériel conique fémoral de rat | Applications stratégiques Inc. | RFA-01 | |
| Salix Furosémide 5 % | Intervet | #34-478 | |
| Ciseaux pour strabisme | Outils scientifiques fins | 14075-11 | |
| Ciseaux chirurgicaux pour étudiants | Outils scientifiques fins | 91402-12 | |
| Gants chirurgicaux | Kimberly-Clark | Gants en nitrile sterling Pompe | |
| à seringue | Razel Scientific | R99-E | |
| Pince à tissus | Outils scientifiques fins | 91121-12 | |
| Ciseaux à tissus | George Tiemann ; Co | 105-420 | |
5-0 Suture chirurgicale en soie tressée Surgical Specialties Corp SP1033 Plaque d’essai, 96 puits Costar ; 3922 Albumine sérique bovine Sigma Chemical Co A2934-25G Centrifugeuse Beckman Coulter MicroFuge 18, 357160 Tubes d’échantillons coniques Dot Scientific Inc. ; #711-FTG Applicateurs à pointe de coton Solon Manufacturing Co 56200 Logiciel d’acquisition de données ADInstruments LabChart Pro 7.0 Numérique Échelle ; Denver Instrument APX-4001 FITC-Inulin Sigma Chemical Co F3272-1G Éponges de gaze Covidien 2146 Lit chirurgical chauffant EZ-Anesthesia EZ-212 Héparine Sagnet NDC 25021-402-10 HEPES Sigma Chemical Co H3375 Isoflurane Abbott Santé animale IsoFlo, 5260-04-05 Vaporisateur d’isoflurane EZ-Anesthesia EZ-190F Micro Dissection Forceps Biomedical Research Instruments Inc. 70-1020 Lecteur de microplaques - Fluoroskan ThermoScientific Ascent FL, 5210460 NOVA 5+ Analyseur sodium/potassium NOVA BioMedical 14156 Olsen-Hegar Porte-aiguilles avec ciseaux Outils scientifiques fins 12002-12 PE-190 (pour cathéter vésical) BD Medical 427435 Transducteur de pression ; ADInstruments MLT1199 Tubes de culture en pyrex Corning Inc. 99445-12 Cathéter artériel conique fémoral de rat Applications stratégiques Inc. RFA-01 Salix Furosémide 5 % Intervet #34-478 Ciseaux pour strabisme Outils de science fine 14075-11 Ciseaux chirurgicaux pour étudiants Outils de science fine 91402-12 Gants chirurgicaux Kimberly-Clark Gants en nitrile sterling Pompe à seringue Razel Scientific R99-E Pince à tissus Outils de science fine 91121-12 Ciseaux à tissus George Tiemann ; CO 105-420 |
Références
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Réimpressions et autorisations
