Caractérisation fonctionnelle de Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Echangeurs de intracellulaire Compartiments utilisant la sélection Proton-tuant les exprimer à la membrane plasmique

Résumé

La première partie de cet article montre comment sélectionner des lignées cellulaires mutantes exprimant des échangeurs vésiculaires Na⁺/H⁺ au niveau de leur membrane plasmique. La deuxième partie fournit des protocoles basés sur des mesures de pH intracellulaires et d’absorption rapide d’ions, qui sont utilisés pour déterminer la sélectivité ionique et les paramètres cinétiques de ces échangeurs.

Résumé

L'acidification des endosomes est essentiel pour un large éventail de processus, tels que le recyclage des protéines et de la dégradation, désensibilisation des récepteurs, et neurotransmetteur chargement dans les vésicules synaptiques. Cette acidification est décrite être médiée par ATPases de protons, couplés à des transporteurs de chlorure ClC. Hautement conservé protons électroneutres transporteurs, le Na ⁺ / H ⁺ (NHE) échangeurs 6, 7 et 9 sont également exprimés dans ces compartiments. Des mutations dans leurs gènes ont été liés à des maladies cognitives et neurodégénératives humaines. Paradoxalement, leurs rôles demeurent insaisissables, que leur localisation intracellulaire a empêché la caractérisation fonctionnelle détaillée. Ce manuscrit montre une méthode pour résoudre ce problème. Il se agit de la sélection de lignées cellulaires mutantes, capables de survivre acidification cytosolique aigu en conservant NHE intracellulaires à la membrane plasmique. Il décrit ensuite deux protocoles complémentaires pour mesurer la sélectivité et l'activité d'ionsde ces échangeurs: (i) une basés sur des mesures de pH intracellulaire par microscopie de fluorescence vidéo, et (ii) une base sur la cinétique de l'absorption rapide de lithium. Ces protocoles peuvent être extrapolés à mesurer d'autres transporteurs non-électrogènes. De plus, la procédure de sélection présentés ici génère des cellules avec un phénotype défectueux rétention intracellulaire. Par conséquent, ces cellules vont aussi exprimer d'autres protéines de la membrane vésiculaire dans la membrane plasmique. La stratégie expérimentale représenté ici peut donc constituer un outil potentiellement puissant pour étudier d'autres protéines intracellulaires qui seront ensuite exprimés à la membrane plasmique avec le vésiculaire Na ⁺ / H ⁺ échangeurs utilisés pour la sélection.

Introduction

La plupart des compartiments intracellulaires afficher un luminale pH acide, qui est un paramètre clé pour la maturation, le trafic, le recyclage des protéines ou des hormones et des neurotransmetteurs chargement. Il a été montré que le gradient de pH entre le cytosol et vésiculaire contenu est généré par vacuolaire H ⁺ ATPases ^1, couplé transporteurs vésiculaires de chlorure ClC ^2. Tant dans knock-out (KO) chez la souris et des patients humains, l'importance de ces transporteurs a été soulignée par les phénotypes lourds causés par des mutations dans leurs gènes ^3-6.

Les membres de la famille de SLC9A échangeurs sodium-hydrogène, aussi appelés NHE pour Na ⁺ / H ⁺ échangeurs, ont été montré pour être effecteurs clés du pH intracellulaire et la régulation du volume cellulaire, ainsi que dans le transport vectoriel d'équivalents acide-base à travers l'épithélium . Outre les NHE de la membrane plasmique, trois hautement conservée Na ⁺ / H ⁺ échangeurs NHE 6, 7et 9 sont exprimés dans le réseau trans-Golgi et les endosomes précoces ^7. Des mutations dans leurs gènes ont été associés à Angelman-like ou Christianson Syndromes ^8-9, l'autisme en milieu familial et ¹⁰ Attention Deficit Hyperactivity Disorder ^11-12. Ces échangeurs ont également été impliqués dans des problèmes neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer ¹³ et la susceptibilité des gènes contigus retard mental lié à l'X syndromes ^14. Pris ensemble, ces études mettent en évidence l'importance de ces NHE intracellulaires dans le développement et / ou le fonctionnement du cerveau.

La localisation intracellulaire de ces échangeurs empêche des mesures précises de leur sélectivité d'ions, la direction de transport, les paramètres cinétiques et la réglementation. Comme ce est le cas pour tous les transporteurs exprimées dans des compartiments intracellulaires, il est extrêmement difficile d'évaluer leurs activités biochimiques et donc de comprendre pleinement leurs rôles physiologiques et l'Mechanismes qui sous-tend leurs implications pathologiques. Basé sur la concentration élevée K ⁺ cytosolique, l'hypothèse la plus communément admise était-qu'ils travaillaient comme K ⁺ couplés protons transporteurs d'efflux. L'existence d'une telle fuite de protons a été émis l'hypothèse, car il peut contrebalancer protons pompage par les V-ATPases afin de maintenir un pH vésiculaire état stable. Le but de cet article visuelle est (i) de démontrer une méthode qui permet la sélection génétique de lignées cellulaires qui expriment ces transporteurs vésiculaires à leur membrane plasmique, et (ii) montrent deux approches indépendantes pour mesurer les fonctions de ces transporteurs.

Il ya trois décennies, Pouyssegur et Franchi ont mis au point une approche génétique qui a permis le clonage moléculaire et la caractérisation des membres de la famille NHE ^15. Cela était basé sur la toxicité des protons intracellulaires en tant que procédé de criblage. La première étape a consisté à obtenir des lignées cellulaires déficientesdans ne importe quel / H échange ^de Na ^{+ +} exprimé à la membrane de plasma, en utilisant la réversibilité de ce transporteur. Les fibroblastes (lignée cellulaire de CCL39) ont été préchargées avec Na ⁺ ou Li ⁺ et ensuite placées dans un milieu extracellulaire acide (pH 6,5) pendant 2 heures. Cela a conduit à la mort des cellules exprimant un Na ⁺ / H ⁺ échange fonctionnel et à la sélection des cellules déficientes en antiport (lignée cellulaire de ¹⁶ PS120). Lorsque cultivées dans un milieu sans bicarbonate, ces cellules sont très sensibles à l'acidification intracellulaire aiguë. Par conséquent, l'expression de tout mécanisme d'efflux de protons fonctionnelle à la membrane plasmique sera sélectionné positive (voir ¹⁷⁾ si ces cellules sont soumises à acidifications intracellulaires aigus. De telles techniques d'acidification peuvent être utilisées pour isoler des lignées de cellules de trafic de défauts permettant l'expression forcée de NHE intracellulaires WT à la membrane plasmique.

Comme eucaryote Na ⁺ / H⁺ Échangeurs sont électroneutre, ils ne sont pas mesurables par les approches électrophysiologiques qui ont été utilisés avec succès pour mesurer canaux. Ce manuscrit montre donc comment mesurer l'activité de cet échangeur par des mesures de pH intracellulaires et une cinétique rapide de l'absorption de lithium. Comme les concepts sous-jacents sont les mêmes, il est intéressant de remarquer que la plupart des procédés mis au point pour la section de sélection sont également utilisés directement pour les mesures fonctionnelles.

Chose intéressante, nous avons observé que le défaut de traite présent dans les lignées cellulaires sélectionnées en utilisant l'approche décrite dans ce manuscrit conduit à une plus grande expression d'autres protéines vésiculaires à la membrane plasmique, comme le canal potassique ¹⁸ TWIK1 vésiculaire. Ceci souligne vers la sélection d'un mécanisme général de défauts de conservation des protéines transmembranaires vésiculaires. Ce est pourquoi cette procédure de sélection et les cellules qu'elle génère maiconstituent un outil prometteur pour la communauté scientifique travaillant sur les protéines membranaires de compartiments intracellulaires. Ainsi les techniques de mesure présentées ici pourraient être applicables pour l'étude d'autres transporteurs non-électrogènes.

Protocole

1. H ⁺ Sélection Tuer

1. Les lignées cellulaires
   1. Transfecter des cellules de manière stable NHE-déficients (par exemple, le PS120 lignée de cellules dérivées ¹⁶ CCL39) à l'aide d'une combinaison du vecteur d'expression de mammifère et un procédé de transfection qui produira des rendements de transfection efficace et sélection dans une lignée cellulaire de fibroblastes.
      REMARQUE: Pendant de nombreuses années phosphate de calcium précipitations ¹⁹ a été utilisé avec de bons rendements de transfection. Cela a été remplacé par plus récemment réactifs commerciaux tels que Lipofectamine2000, les transfections étant effectuées suivant les instructions du fabricant.
2. Solutions
   1. Préparer trois solutions stériles décrites ci-dessous. Stériliser ces solutions par filtration (0,22 um).
      1. Préparer une solution de ₄ ⁺ NH chargement (pH 7,4) composé de 50 mM de NH ₄ Cl, 70 mM de chlorure de choline, KCl 5 mM, _MgCl2 1 mM, CaCl2 ₂ mM, 5 mM glucose et 15 mM MOPS à pH 7,4.
      2. Préparer une solution de rinçage (pH 7,0), composé de 120 mM de chlorure de choline, KCl 5 mM, _MgCl2 1 mM, CaCl2 ₂ mM, 5 mM de glucose et 15 mM de HEPES à pH 7,0.
      3. Préparer une solution de récupération (pH 7,4) constitué de NaCl 120 mM, KCl 5 mM, _MgCl2 1 mM, CaCl2 ₂ mM, glucose 5 mM et HEPES 15 mM à pH 7,4.
3. Avant de commencer la sélection, l'obtention d'un incubateur de culture de cellules qui peut être utilisé à 37 ° C sans CO supplémentaire ₂ du réservoir externe (appelé CO ₂ - incubateur «libre»), tel que 5% de CO ₂ entraînera tampon qui peut nuire à la acidification. Amplifier la lignée cellulaire exprimant le NHE d'intérêt jusqu'à environ 2 x 10 ⁸ cellules (typiquement d'environ 20 100 plaques confluentes mm).
4. H ⁺ tuant procédure:
   1. Incuber les cellules exprimant le NHE intracellulaire d'intérêt pendant 1 heure dans la solution de charge, à 37 ° C dans l'incubateur à _CO2 exempt.
   2. Aspirer la solution de chargement, puis les rincer deux fois dans la solution décrite ci-dessus rinçage. Effectuez cette étape efficace pour éliminer le résidu extracellulaire NH ₄ Cl qui porterait atteinte à la création d'un NH ₄ ⁺ forte pente qui va générer l'acidification.
   3. Eliminer le milieu de rinçage par aspiration et on incube les cellules pendant une heure dans une solution de récupération de nouveau à 37 ° C dans l'incubateur CO ₂ libre.
   4. Remplacer le moyen de récupération du milieu de culture ordinaire (typiquement du DMEM avec 7,5% de FCS) et faire croître les cellules dans des conditions standard de culture (37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO ₂ et 95% d'air).
5. Répétez ce cycle de la sélection deux fois par semaine jusqu'à ce que des clones stables émergent.
   NOTE: Faites attention concernant la culture de cellules et les conditions de sélection. Mois de travail peuvent être ruinés par toute contamination qui est plus enclin à oCCur après une longue période de culture et de manipulations répétées de cellules.
   1. Ici, choisir d'amplifier les clones et de caractériser individuellement comme décrit dans la dans les sections 2-3, ou les réunir pour générer une population cellulaire avant caractérisation.
6. Appliquer la sélection occasionnelle (environ une fois toutes les deux semaines) pour conserver les cellules d'acidification résistant par contre-sélection de ceux qui peuvent être revenu au phénotype sensible à l'acide parentale (figure 1B).

2. Mesures pH intracellulaire

2.1) Fluorescence Imaging pH

1. Utilisez le ratiométrique sensible au pH colorant fluorescent BCECF / AM, qui est sensible au pH lorsqu'il est excité à 490 nm et possède un point isosbestique nm 445, en suivant les protocoles du fabricant.
   1. Vous pouvez également utiliser d'autres sondes sensibles au pH, en suivant les protocoles du fabricant.
2. Utilisez une imagerie mis conune superficie d 'un microscope inversé couplé à une caméra vidéo à haute sensibilité. Équipé cet ensemble avec 450 nm et 490 filtres d'interférence à bande étroite nm jumelé avec quartz appropriée des filtres de densité neutre pour l'excitation.
   1. Si possible, utilisez l'ensemble approprié des filtres et des conditions d'éclairage de configuration valeurs de fluorescence comparables pour λ1 et λ2 de sorte que le ratio se rapproche de 1. Evitez également les valeurs de fluorescence de base qui sont définies soit saturer ou trop faible, tant pour λ1 et / ou λ2. Cela peut donner des artefacts importants que le ratio peut pas détectable bien pH intracellulaire est en train de changer.
      NOTE: Ce système doit permettre la perfusion rapide, time-lapse excitation à deux longueurs d'onde mentionnées ci-dessus et l'acquisition à la longueur d'onde d'émission appropriée (535 nm pour BCECF). Équipé du système avec un logiciel permettant l'acquisition automatique des données et le stockage.

2.2) Mesure de l'activité NHE Forward (Extrusion duLes protons du cytosol)

1. Acidifier cellules par une incubation de 1 h dans la solution NH ₄ ⁺ chargement (voir l'étape 1.4) en l'absence de CO _2.
2. Ajouter BCECF-AM (5 uM de concentration finale) à la solution pour les cinq dernières minutes, puis rincer avec de NH ₄ ⁺ solution de charge pour éliminer la sonde extracellulaire.
3. Monter les cellules sur le microscope et prendre plusieurs images pour enregistrer une ligne de base stable. Perfuser la solution de rinçage (voir ci-dessus). Il en résulte une chute de la fluorescence correspondant à l'acidification.
4. Après stabilisation du pH, perfuser l'une des solutions ci-dessous pour mesurer les taux de récupération de pH médiées par Li ⁺ / H ^+, Na ⁺ / H ⁺ ou K ⁺ / H ⁺ échange. Chaque solution contient un cation de couplage pourrait être testé pour l'échange de H ^+. Si l'un de ceux qui est transporté, cela se traduira par une augmentation de la fluorescence à 495 nm qui correspond à une augmentation du pH intracellulaire:
   120 mM de LiCl, KCl 5 mM, _MgCl2 1 mM, CaCl2 ₂ mM, glucose 5 mM et HEPES 15 mM à pH 7,4
   NaCl 120 mM, KCl 5 mM, _MgCl2 1 mM, CaCl2 ₂ mM, glucose 5 mM et HEPES 15 mM à pH 7,4
   125 mM de KCl, 1 mM de _MgCl2, CaCl2 ₂ mM, glucose 5 mM et HEPES 15 mM à pH 7,4

2.3) Mesure de NHE inverse Activité

NOTE: Le principe ici est d'inverser les gradients ioniques transmembranaires.

1. Avant la mesure, charger les cellules avec le cation intracellulaire d'intérêt (voir ci-dessous).
2. Incuber pendant 5 min avec BCECF / AM (voir l'étape 2.2.2); rincez-les, montez-les sur le microscope vidéo.
3. Perfuser la solution de chargement et de prendre plusieurs images pour enregistrer une ligne de base stable.
4. Après la stabilisation de base, l'image les variations de pH lorsque les cellules sont perfusées avec un milieu acide extracellulaire contenant 120 mM de chlorure de choline, 5 mM de KCl, 1 mM de _MgCl2, CaCl2 ₂ mM, glucose 5 mM et 15 mM de MES à pH 6,5.
5. Pour LiCl chargement, incuber les cellules pendant 2 heures dans une solution composée de 120 mM de LiCl, KCl 5 mM, _MgCl2 1 mM, CaCl2 ₂ mM, glucose 5 mM et HEPES 15 mM à pH 7,4. Lithium intracellulaire mesuré par spectroscopie d'absorption atomique donne une valeur d'environ 60 mM.
6. Pour le chargement Na ^+, les cellules incuber pendant deux heures dans une solution composée de 120 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de _MgCl2, 2 mM de _CaCl2, 5 mM de glucose et 15 mM de HEPES à pH 7,4 en présence de 1 mM d'ouabaïne de bloquer la Na / K ATPase. Dans ces conditions, la concentration intracellulaire de Na ⁺ est de l'ordre de 40 mM.
   REMARQUE: K ⁺ chargement ne est pas nécessaire que K ⁺ cytosolique concentration est dans la gamme de 140 mM et un gradient K + dirigée vers l'extérieur est donc facile à réaliser.

2.4) Le traitement des données et d'étalonnage:

NOTE: Cette étape se applique à la fois pour les mesures avant et arrière.

1. A la fin de chaque expérience, perfuser les cellules avec une solution de KCl 140 mM, HEPES 20 mM et 5 uM nigéricine ajustée à des valeurs de pH entre 6,5 et 7,4.
2. Recueillir des données que des mesures de fluorescence à partir des images (niveaux de gris représentant niveaux d'intensité) et l'exportation sous format texte et traiter comme il est expliqué ci-dessous à l'aide d'un tableur.
3. Calculer les valeurs de pH intracellulaire pour chaque cellule ou d'une région d'intérêt en utilisant l'équation suivante individuelle:
   pH = pKa + (Log (R-Rmin) / (R _max -R)) x F _{min (λ2)} / F _{max (λ2)}
4. Utiliser le F _{min (de λ2)} / F _{x MA (λ2)} se il existe rapport blanchiment de sonde ou de fuite, ce qui entraîne une diminution de la fluorescence de 450 nm tout au long des expériences. Ce ne est cependant très rarement observée dans les conditions utilisées dans le DEScribed expériences.
5. Comme les données d'étalonnage sont présents à la fin de chaque mesure de pH, de vérifier si les valeurs calculées correspondantes diffèrent des valeurs de pH utilisées pour l'étalonnage. Si ce est le cas, puis réglez toutes les valeurs de pH déterminé de manière expérimentale à l'étalonnage en utilisant la procédure suivante:
   1. Calculer le quotient suivante (Q, la différence entre la valeurs mesurées / Différence entre les valeurs d'étalonnage). Multipliez l'ensemble des données par Q. Faire l'ajustement final par addition ou soustraction de sorte que les valeurs calculées seront égales les valeurs d'étalonnage correspondantes.

3. Mesures de taux initiaux de NHE7 par Fast Li ⁺ Absorption

1. cellules de semences sur des plaques à puits multiples (6 à 24 puits) et acidifier les utiliser soit la technique NH ₄ ⁺ de chargement décrit ci-dessus ou alternativement le nigéricine / sérum albumine bovine (BSA) acidification décrite dans ^20.
2. Rincer les plaques deux fois rapidement en utilisant la solution de rinçage décrit ci-dessus et ensuite incuber les cellules dans des solutions contenant de 1 à 10 mM absorption lithium (légèrement en dessous de valeurs de Km) et les concentrations désirées de cations et / ou des inhibiteurs d'intérêt pour la quantité souhaitée de temps.
3. Maintenir courtes et cohérentes durées d'absorption (généralement une minute ou ci-dessous) afin de se assurer que le transport fonctionne dans des conditions de taux initiaux. Assurez-vous également que toutes les solutions utilisées pour l'absorption sont isotoniques.
4. A la fin du temps d'absorption, éliminer soigneusement le milieu d'absorption et laver les cellules à quatre reprises avec une solution saline phosphate glacée tamponnée (PBS). Effectuez ces lavages aussi vite que possible (moins de 10 secondes pour les quatre d'entre eux est idéal) pour empêcher lithium efflux.
5. Lyse des cellules dans 25% d'acide nitrique. Appliquer 250 pi par puits de 25% d'acide nitrique et laisser reposer pendant au moins 1 h, puis la ferraille chaque puits avec l'extrémité de la pointe de la pipette et transférer la suspension de l'ensemble ainsi dans une nouvelle kmTube crocentrifuge.
6. Transférer le lysat dans 1,5 ml microtubes, centrifuger les pendant 5 minutes à 15 000 xg (à température ambiante) pour éliminer les débris cellulaires.
7. Mesurer la teneur en lithium des surnageants par spectroscopie d'absorption atomique ^21.
   NOTE: Différentes entreprises offrent spectromètres d'absorption atomique, qui doivent être équipé d'une lampe à cathode creuse au lithium. Suivez les instructions du fabricant, car ces machines sont très précises mais aussi très délicate.

Résultats

Sélection:

La sélection ⁺ H tuant est basé sur la diffusion de l'ammonium base faible, telle que représentée sur la figure 1A. L'effet des bases faibles et acides diffusion sur le pH intracellulaire a été mis au point par Walter bore et ses collaborateurs ^22. L'idée élégante d'utiliser ce phénomène pour produire une acidification mortelle pour la sélection génétique positive a été ensuite développé par Jacques Pouyssegur ^17. D...

Discussion

Ce protocole décrit la manière de sélectionner les cellules exprimant intracellulaire de Na ⁺ / H ⁺ échangeurs à la membrane plasmique sans modification de leur séquence primaire par mutagenèse dirigée. Ces échangeurs peuvent maintenant être caractérisés.

Cette méthode est basée sur la toxicité cellulaire des protons intracellulaires pour sélectionner des lignées cellulaires qui expriment vésiculeuse Na ⁺ / H ⁺ échangeurs à la membrane plasmique. I...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Equipement			Utilisé pour la sélection de destruction H+ composé de nombreux appareils avec différents numéros de catalogue
Incubateur avec CO2	Sanyo	MCO15A
Incubateur sans CO2	Heraeus Instrument	BB6220
Hotte à flux laminaire PSM1200NF	Fisher  ;
DMEM medium	sigma	D5796
FBS gold	GE Healthcare	A15-151
Péniciline/streptomycine	PAA	P11-010
Trypsine 10x	PAA	L11-003
Spectromètre d’absorption atomique avec système de four Zeeman	Thermo Scientific	ICE 3500 GFZ
LiCl	sigma	L4408
Acide nitrique	sigma	438073
Kit de vidéomicroscopie à fluorescence	Leica		Composé de nombreux appareils avec différents numéros de catalogue
Microscope automatisé inversé	Leica	DMI6000B
support de microscope	leica	11888906
		11888911
		11888377
fluorescence incidente	Leica	11888901
		11504166
support moteur	Leica	11888379
		11505234
		11521505
		11522106
Feu de transmission LED  ;	Leica	8097321
		8102034
		11521580
plaque motorisée	Leica	11522068
		11521734
		11521719
		11888423
sortie de l’appareil photo	Leica	11888373
		11507807
		11888393
		11888259
		11888258
		11541510
Logiciel d’acquisition/analyse d’images	Leica	11888375
optique	leica	11506507
		11506243 11506203
fluorescence Lampe au xénon	Leica	DMI6000
caméra	Hamamatsu	8100601
		métafluor/Mmfluor
sonde sensible au pH, BCECF-AM	technologies de la vie	B1170
Nigericin	Sigma	N7143