Examen de Rapid Dopamine Dynamics avec Numérisation rapide voltampérométrie cyclique cours intra-orale administration exhausteur de goût chez les rats Awake

Résumé

Les fluctuations rapides de la dopamine extracellulaire (DA) interviennent à la fois dans le traitement de la récompense et le comportement motivé chez les mammifères. Ce manuscrit décrit l’utilisation combinée de la voltampérométrie cyclique à balayage rapide (FSCV) et de l’administration intra-orale de tastant pour déterminer comment les tastants modifient la libération rapide de dopamine chez les rats éveillés et se déplaçant librement.

Résumé

La libération rapide de dopamine (DA) phasique dans le cerveau des mammifères joue un rôle essentiel dans le traitement de la récompense, l’apprentissage par renforcement et le contrôle motivationnel. La voltampérométrie cyclique à balayage rapide (FSCV) est une technique électrochimique à haute résolution spatiale et temporelle (inférieure à la seconde) qui a été utilisée pour examiner la libération de DA phasique dans plusieurs types de préparations. Des expériences in vitro sur des cellules uniques et des coupes de cerveau, ainsi que des expériences in vivo sur des rongeurs anesthésiés, ont été utilisées pour identifier les mécanismes qui interviennent dans la libération et l’absorption de la dopamine dans des conditions normales et dans des modèles de maladies. Au cours des 20 dernières années, des expériences in vivo de FSCV chez des rongeurs éveillés et se déplaçant librement ont également permis de mieux comprendre les mécanismes dopaminergiques dans le traitement et l’apprentissage de la récompense. L’un des principaux avantages de la préparation éveillée et libre est la capacité d’examiner les fluctuations rapides de l’AD qui sont verrouillées dans le temps sur des événements comportementaux spécifiques ou sur la présentation d’une récompense ou d’un indice. Cependant, l’une des limites des expériences combinées de comportement et de voltampérométrie est la difficulté de dissocier les effets DA spécifiques aux stimuli primaires gratifiants ou aversifs des fluctuations concomitantes de DA qui médient les comportements dirigés vers la récompense ou d’autres comportements moteurs. Ici, nous décrivons une méthode combinée utilisant le FSCV in vivo et la perfusion intra-orale chez un rat éveillé pour étudier directement les réponses DA aux dégustations orales. Dans ces expériences, des arômes oraux sont infusés directement dans le palais du rat – en contournant le comportement dirigé vers la récompense et le comportement de consommation volontaire – permettant un examen direct des réponses DA aux stimuli de dégustation.

Introduction

La libération de DA phasique joue un rôle important dans la médiation du comportement dirigé vers la récompense ^[1-3]. Cependant, l’isolement et l’étude de la façon dont une récompense primaire modifie la libération de DA phasique sont souvent compliqués par des processus comportementaux ou cognitifs concomitants qui sont également capables de modifier la libération de DA phasique - tels que les processus de prise de décision ou le comportement moteur dirigé par la récompense pour acquérir la récompense. Dans le travail actuel, nous isolons les réponses DA phasiques aux tastants par l’utilisation de la voltampérométrie cyclique à balayage rapide (FSCV) in vivo combinée à l’administration de tastant par des canules intra-orales. Cette technique contourne le choix et l’action et nous permet d’examiner la libération extracellulaire de DA lors de la perfusion directe d’un savourant dans le palais d’un rat.

FSCV est une technique électrochimique à haute résolution temporelle et spatiale, permettant de mesurer la libération de DA dans une zone locale discrète (environ 100 μm) sur une échelle inférieure à la seconde (résolution de 10 Hz). La combinaison de l’administration intra-orale et du FSCV offre l’avantage d’observer rapidement et « en temps réel » les réponses DA à un goûtant, qui ne peuvent pas être examinées à l’aide des méthodes de microdialyse conventionnelles. De plus, la libération de DA phasique en réponse à des récompenses ou à des indices associés à des récompenses se produit à des concentrations comprises entre 20 et 100 nM, ce qui est supérieur au seuil de détection de 10 à 20 nM pour le FSCV ^[4]. La haute résolution spatiale du FSCV permet également d’enregistrer à partir de sous-régions de petites zones cérébrales, telles que le noyau accumbens (NAc). Ainsi, le FSCV combiné à des perfusions intraorales de savourants est un modèle idéal pour étudier comment les goûts ou d’autres stimuli modifient la libération phasique de DA chez un animal éveillé et au comportement comportemental. En effet, ces techniques ont permis des expériences sur la façon dont les goûts gratifiants et aversifs modifient la libération extracellulaire de DA ^[5].

Au cours de la dernière décennie, les analyses FSCV ont été combinées avec succès avec des paradigmes d’administration de drogues par voie intraveineuse ^[6] et d’auto-administration chez le rat ^{[7, 8]} pour identifier le rôle des mécanismes de DA phasiques dans les modèles de toxicomanie. De plus, l’administration intraorale combinée avec le FSCV a été utilisée pour examiner comment les signaux de goût associés à la disponibilité de la cocaïne modulent la libération phasique de DA et les réponses comportementales qui reflètent l’affect émotionnel ^[3]. Cette méthodologie combinée intra-orale et FSCV peut également être utilisée avec force pour examiner les réponses phasiques DA aux arômes, tels que le menthol et les édulcorants oraux, qui sont ajoutés aux cigarettes et aux produits du tabac solubles ^[9-11]. Bien que de nombreux arômes ajoutés aux produits du tabac soient appétitifs ^[9-11], on ne sait pas si ces arômes augmentent la libération de DA phasique d’une manière compatible avec une valence hédonique gratifiante. En effet, les arômes ajoutés aux cigarettes et aux produits du tabac solubles peuvent avoir des effets directs sur le système de récompense de l’AD et peuvent agir par le biais de mécanismes dopaminergiques pour influencer la valence de récompense des cigarettes et autres produits du tabac. Ainsi, l’administration intraorale combinée au FSCV peut fournir une nouvelle compréhension de la façon dont les arômes modulent la libération rapide de DA. L’utilisation de la méthodologie combinée de la FSCV intra-orale et in vivo, et les données obtenues à partir de ces études, peuvent également faciliter les études futures visant à déterminer comment les arômes et la nicotine interagissent pour modifier la signalisation DA et potentiellement moduler le renforcement de la nicotine. De plus, les données obtenues à partir de ces études peuvent être utilisées pour éclairer les décisions réglementaires concernant les arômes de produits du tabac.

Protocole

Toutes les expériences ont été menées selon les National Institutes of Health (NIH) Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvés par l'institutionnel soin et l'utilisation des animaux Comité l'Université de Yale (IACUC).

Préparatifs 1) Pré-chirurgicales

1. Préparation de la solution orale
   1. Créer des solutions de 10% de saccharose et 0,005% de L-menthol dans de l'eau désionisée (pH 7,4). Conservez ces solutions dans des récipients fermés, à température ambiante, et refaire toutes les 2 semaines, pour éviter la dégradation.
2. solutions d'étalonnage de l'électrode
   1. Assurez-tampon Tris (pH 7,4) à tout moment avant l'étalonnage. La solution se compose de 12,0 mM de Tris-HCl, 140 mM de NaCl, KCl 3,25 mM, CaCl2 1,20 mM, 1,25 mM NaH2PO4, 1,20 mM de _MgCl2, et 2,00 mM de Na ₂ SO _4.
   2. Créer une solution de réserve de la dopamine 10 mM (DA; chlorhydrate de dopamine) dans l'acide perchlorique 0,1 M. L'acide perchlorique prévient l'oxydation de la dopaminee. Conserver cette solution de stock à -20 ° C et utiliser jusqu'à 6 mois. Faire plusieurs aliquotes de la solution stock de DA pour le stockage à utiliser chaque aliquote qu'une seule fois.
   3. À partir du stock mM DA 10, des solutions diluées dans un tampon Tris à des concentrations de 1 uM, 500 nM, 250 nM, 125 nM, 62,5 nM, et 31,25 nM.
   4. Pour l'étalonnage de pH, préparer des solutions de tampon Tris avec le pH de 7,2, 7,3, 7,5, et 7,6. Cela permettra de fournir des solutions qui imitent des variations de pH qui peuvent survenir au cours de l'expérience in vivo.
3. Fabrication de l'électrode
   1. Par aspiration sous vide, aspirer une fibre T-650 carbone (7 um de diamètre) dans un capillaire en verre de borosilicate (longueur 10 mm, diamètre extérieur 0,6 mm, diamètre intérieur 0,4 mm).
   2. Passer capillaire en verre rempli de fibres de carbone dans un extracteur électrode verticale. Pour les paramètres initiaux, mettre le chauffage à 55,0 et désactiver l'aimant. Cependant, outre l'optimisation peut être nécessaire à la fois de chauffage et les paramètres magnétiques varient from laboratoire à.
      Remarque: L'électrode doit être d'au moins 5,5 cm de long (y compris cône) de sorte qu'il peut facilement se glisser dans le micromanipulateur et être inséré au moins 6,9 mm en dessous de la dure-mère dans le cerveau de rat. Si l'électrode est trop court, les enregistrements de partie ventrale du noyau accumbens ne seront pas réalisables. D'autre part, la longueur de l'électrode totale ne doit pas dépasser 6,5 cm sinon il sera trop long pour tenir dans le micromanipulateur.
   3. L'utilisation d'un microscope optique, couper la liaison carbone-fibre exposée afin qu'elle se prolonge au-delà de 75 à 100 um de l'extrémité de la vitre. Vérifiez que l'électrode a une très serré, à peine perceptible, l'étanchéité entre l'électrode de verre et fibre de carbone, qui va produire un minimum de bruit pendant l'enregistrement ultérieur. Jeter l'électrode si il ya des fissures visibles dans le verre ou si le sceau est lâche, ce qui est indicatif d'un joint pauvres. Pour des instructions plus détaillées, voir [12] et [13].
4. Assemblage de l'électrode dans le microromanipulator
   1. Obtenir un 3, fil de 30G qui est isolé sur la moitié de la longueur du fil et utiliser une petite brosse pour appliquer une fine couche d'argent peindre directement sur le fil. Immédiatement après l'application de peinture argentée, insérer le fil dans le trou sur le dessus de l'électrode pour fournir une connexion physique et électrique avec la fibre de carbone. Sous un microscope, veiller à ce que le fil d'argent en contact avec la fibre de carbone.
   2. Fixez le fil d'argent et électrode à l'aide micromanipulateur thermorétractable.
   3. Placer l'électrode en fibre de carbone préparé dans l'alcool isopropylique purifié (IPA) pendant au moins 10 minutes pour nettoyer la surface de l'électrode et pour augmenter la sensibilité à la suite de la dopamine. Après le trempage dans de l'IPA, rincer la fibre de carbone avec de l'eau du robinet pour enlever l'IPA.
5. Référence fabrication de l'électrode
   1. Prenez un fil de 13 mm contenant de l'argent une participation d'environ 6 mm Ag / Ag Cl maille (7 mm fil d'argent seul, 6 mm mesh, 0,4 mm de diamètre),couper la partie d'argent vers le bas pour environ la moitié de sa longueur d'origine et souder la partie de l'argent du fil à une épinglette en or.
   2. Appliquez l'époxy sur la soudure sur la broche.
   3. Tremper l'Ag / Ag Cl mesh extrémité dans un copolymère de polytétrafluoroéthylène et de 5% de perfluoro-3,6-dioxa-4-méthyl-7octene-sulfonique 5 fois, avec des périodes de séchage par air 30 min entre chaque immersion.
   4. Permettre à l'enduit Ag / Ag Cl maille sécher à l'air O / N.
   5. Cure au four à 120 ° C pendant 1 h.

2) Chirurgie combinée intra et chirurgie intracrânienne Canulation (environ 75 min)

1. Oral fabrication de cathéter
   1. Ajouter le cathéter par voie orale, et stériliser par stérilisation à l'oxyde d'éthylène, au moins 10 jours avant la chirurgie.
   2. Couper PE 100 tube dans 6 cm de long segments.
   3. L'utilisation d'un fer à souder, faire fondre une extrémité du tube de PE et immédiatement presser contre une surface solide pour refroidir le tuyau en PE. Le résultat devrait créerun petit disque plat à une extrémité de la tubulure PE et ne doit pas être bridé. Utiliser une aiguille (18 G) ou pousser la broche pour créer un trou dans le centre de ce disque.
   4. À l'autre extrémité du tube de PE, insérer confortablement l'extrémité émoussée d'une aiguille G 18 dans le tube.
   5. Utiliser une perforatrice de papier standard, punch plusieurs pièces circulaires d'une feuille de polytétrafluoroéthylène (3,18 mm d'épaisseur, 6 mm de diamètre) pour créer les rondelles de polytétrafluoroéthylène.
   6. Créer un trou dans le centre de la rondelle. Prenez l'aiguille fixée sur le tube PE et poussez-le à travers la rondelle. Une fois que l'aiguille est à travers, faire glisser la rondelle vers le bas du tube de PE de sorte qu'il soit à plat contre la rondelle.
2. Chirurgie buccale
   1. Après la stérilisation des outils chirurgicaux, la canule (coupé à 2,5 mm en dessous du socle avant stérilisation), et l'électrode de référence, anesthésier le rat par une injection intraperitoneale de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg).
      1. After 5 min, appliquer un test de stimulus nociceptif (de pied ou pincement de la queue) pour évaluer le niveau de l'anesthésie. Si le sujet montre aucune réaction physique à l'épreuve de stimulus nociceptif (flancher réponse, augmentation de la fréquence respiratoire ou cardiaque), administrer un coup de pouce de la kétamine de 10% à 15% de la dose initiale et répétez le protocole de stimulus nociceptif ci-dessus.
   2. Après le rat est totalement anesthésié et ne montre aucune réaction au test de stimulus nociceptif, utiliser tondeuses animales de se raser la fourrure du rat des yeux à environ 2 mm derrière les oreilles. Ensuite, placez le rat sur un coussin chauffant de recirculation de l'eau mince pour maintenir la température du corps pendant la chirurgie. Appliquer un lubrifiant oculaire. Administrer le médicament non stéroïdien anti-inflammatoire non stéroïdien (AINS), carprofène (5 mg / kg), par injection intraperitoneale avant d'effectuer des incisions et avant l'insertion de canules intra-orales. Utiliser une technique aseptique en tout temps.
   3. Appliquer la bétadine suivie par 70% d'éthanol pour nettoyer la peau. Répétez 3 fois.
   4. PlaCE du rat sur son dos, et d'ouvrir la bouche en utilisant un coton-tige stérile. Trouver la première molaire supérieure.
   5. Insérez l'aiguille dans le tissu entre la joue et la première molaire supérieure jusqu'à ce que l'aiguille sort juste derrière et médiale pour les oreilles.
   6. Pierce l'aiguille à travers la peau jusqu'à ce que le tube de PE sort de la peau et est accessible.
   7. Tirez sur la canule (préhension par la canule elle-même et non de l'aiguille) et fixer la rondelle de polytétrafluoroéthylène dans les molaires sorte que le cathéter reste en place.
      REMARQUE: La coupe de la rondelle en forme de trapèze et la sécurisation contre les molaires avec le côté plat vers la joue rend cette étape plus facile.
   8. Prenez un autre polytétrafluoroéthylène rondelle et faites-le glisser sur l'aiguille exposée, sur le tube en plastique, et buter contre l'incision.
   9. Pour sécuriser la rondelle de polytétrafluoroéthylène, utilisez du ruban stérilisé pour créer un "drapeau" triangulaire sorte que la rondelle ne glisse pas. Fixez le lavageer contre la peau du rat et de la bande stérilisée.
   10. Couper le cathéter exposé pour permettre à 2-4 cm de tube d'être exposée au-dessus de la tête du rat.
   11. Répétez les étapes 2.2.1 à 2.2.10 pour l'autre côté de la bouche.
3. La chirurgie intracrânienne pour voltammetry
   1. Placez le rat dans le cadre stéréotaxique et nettoyer le cuir chevelu de l'animal à l'aide d'un gommage deux de scène (un gommage de la bétadine suivi d'un gommage d'éthanol à 70%, jouer avec une répétition 3 du cycle).
   2. Utilisez stérilisés aiguilles pinces de nez et des ciseaux chirurgicaux pour couper une section de 15 x 15 mm de tissu cuir chevelu.
   3. Nettoyez délicatement la surface du crâne à l'aide stérilisés applicateurs de pointe de coton. En outre nettoyer le crâne en appliquant 2 à 3 gouttes de 3% de peroxyde d'hydrogène.
   4. Utilisez une perceuse stéréotaxique de faire 3 petits (1 mm de diamètre) trous dans le crâne pour l'insertion ultérieure de vis, 1 trou pour la canule de guidage, 1 trou pour l'électrode de stimulation, et 1 trou pour les élus de référencerode.
   5. Pour les enregistrements dans le noyau NAc, positionner la canule de guidage à 1,2 mm et 1,4 mm antérieure latérale Bregma. Abaisser le dispositif de canule jusqu'à ce que la base en plastique est aligné avec le crâne.
   6. Placer l'électrode de référence stérilisé dans l'hémisphère controlatéral à la canule de guidage. Abaissez la référence d'environ 2 mm sous la dure-mère.
   7. Placez le électrode de stimulation à 5,2 mm et 1,0 mm postérieure latérale Bregma et réduit 8,0 mm au-dessous dure pour cibler l'aire tegmentale ventrale (ATV).
   8. Utilisez un petit tournevis chirurgical stérilisé pour fixer les vis sur le crâne. Ensuite, insérez l'électrode de référence, électrode de stimulation, et de guider la canule. Enfin, fixez tous les composants en utilisant du ciment Cranioplastic.
   9. Pour les premières 48 heures de soins post-opératoires, administrer le non-stéroïdiens anti-inflammatoire non stéroïdien (AINS) Carprofène par injection sous-cutanée (5 mg / kg). Prévoyez au moins 1 semaine pour la récupération chirurgicale complète avant d'effectuer Voltamenregistrement métrie.
      1. Au cours de soins post-opératoires, cathéters orale quotidienne Rincer avec de l'eau. Fournir de la nourriture saturée en eau pendant 2 jours pour aider l'animal à mâcher et à manger. Assurer le suivi quotidiennement les signes potentiels de stress de la douleur (due à une infection bénigne ou déshydratation) et offrir des interventions appropriées qui sont nécessaires (y compris l'administration de fluides, l'administration topique des antiseptiques, et ou l'administration AINS Carprofène à 5 mg / kg).

3) Voltammetric Recordings dans Awake, se déplacer librement Rat

1. Abaisser l'électrode et l'acquisition d'un ensemble d'apprentissage DA.
   1. Le jour de l'expérience, vérifier la perméabilité de la canule orale en infusant 200 pi d'eau et en observant les réponses oro-faciales (pour vérifier que le rat est goûtant l'eau).
   2. Attacher le FSCV headstage chez le rat par l'insertion, l'électrode de stimulation (sur la headstage) dans la stimulation bipolaire électrode Cannula (sur le rat). Ainsi, la headstage (miniaturisé convertisseur courant-tension) se connecte directement à la stimulation de l'électrode bipolaire.
   3. Retirer la canule factice à partir de l'appareil de canule et appliquer deux gouttes d'une solution d'héparine à 50% dans la canule. Ensuite, insérer doucement une canule factice (un peu plus longue que la canule fictive qui a été précédemment retiré) pour effacer les caillots de sang ou de la cicatrisation gliale qui se sont produites, qui briseront électrodes en fibre de carbone qui seront ensuite insérées pendant l'expérience. Elargir la canule utilisée pour dédouaner caillots 3-4 mm en dessous du crâne (au moins 2 mm au-dessus du site d'enregistrement).
   4. Insérez le micromanipulateur, avec l'électrode, dans la canule de guidage et de placer la bague oméga dans une position "verrouillée".
   5. Connectez le fil de l'électrode de référence de la headstage à la broche appropriée. Ensuite connecter le fil de travail de l'électrode du micromanipulateur au fil approprié sur le headstage.
   6. Abaisser les electrode à environ 4-4,5 mm en dessous de crâne.
   7. Utilisez un potentiostat pour appliquer une forme d'onde triangulaire (400 V / s, de -0,4 à 1,3 V). Appliquer la forme d'onde à l'électrode à 60 Hz pendant au moins 10 min, puis modifiez la fréquence d'application de forme d'onde à 10 Hz pour les enregistrements expérimentaux ultérieurs.
      Remarque: L'application de forme d'onde étape 60 Hz produit une surface de fibre de carbone stable et aidera à prévenir la dérive électrique
   8. Appliquer une stimulation électrique au VTA utilisant des fréquences différentes (de 10 à 60 Hz) des impulsions (10 à 30 impulsions) et des courants (50 à 150 uA), toutes avec une largeur d'impulsion de 2 ms / phase d'évoquer différentes concentrations de la libération de DA et le pH changements. Acquérir au moins 5 concentrations différentes de la libération de DA et 5 variations de pH différentes. Attendre (2 - 3 min minimum) entre les stimulations pour permettre le rechargement vésiculaire [14].
      Remarque: Il est important d'obtenir des stimulations qui produisent des concentrations DA sur toute la gamme qui seront recueillies au cours de la suiteexpérience, car ils seront utilisés comme un ensemble de formation pour l'analyse en composante principale (voir rubrique 5.1).
   9. Abaisser l'électrode dans le noyau NAc (6,3 mm ventral Dura). Par la suite abaisser l'électrode à 100 um incréments au sein du noyau jusqu'à ce que NAc DA événements de relâchement transitoire sont observées à des fréquences d'au moins 1 par minute.
   10. Connecter le tube (diamètre intérieur 1/32 ', diamètre extérieur 3/32 ") pour une seringue de 20 ml, relié à une pompe à seringue. À l'autre extrémité du tube, en utilisant une aiguille 23 G biseauté pour raccorder le tube à la canule du rat. Assurez-vous que le tube est complètement rempli de l'exhausteur de goût désiré et vérifier qu'aucune bulle existent dans le tube.
       Remarque: En règle générale, d'administrer une petite quantité d'exhausteur de goût dans la bouche du rat avant l'enregistrement de sorte que le premier enregistrement pour perfusion délivre la totalité de perfusion et pas d'eau ou de l'air résiduel dans le tube. En outre, cela permet à l'animal de l'esprit d'avoir une certaine expérience préalableh l'exhausteur de goût depuis nouveaux sapides, même ceux appétitives, peut être aversif d'abord en raison de sa nouveauté.
   11. Pour la collecte des données, infuser 200 pi d'exhausteur de goût (6,5 sec à l'aide d'une pompe et de tubes décrit précédemment). Infuser l'exhausteur de goût tous les 1-3 min. Infuser un total de 25 fois par exhausteur de goût. Chaque perfusion délivre 200 pi de solution.
   12. Si plusieurs sapides sont livrés en une seule expérience, rincer le cathéter par voie orale avec de l'eau après la collecte de données pour une exhausteur de goût et d'attendre au moins 20 minutes avant la perfusion de la nouvelle exhausteur de goût.
   13. Après la session d'enregistrement DA, se préparer à la vérification histologique par la création d'une petite lésion au niveau du site d'enregistrement. Afin de préserver l'électrode en fibre de carbone pour l'étalonnage ultérieur, rétracter la première électrode et retirer le micromanipulateur. Ensuite, utilisez une nouvelle micromanipulateur avec une micro-électrode de verre et un fil de tungstène (étendant 100 um au-delà de la pointe de verre) à la même profondeur (ci-dessous dure) que le f de carbone d'originemicroélectrodes iber.
   14. Pour la vérification histologique, créer une petite lésion en appliquant 3 V au fil de tungstène et l'augmentation de la tension à 1 V par incréments, toutes les 10 secondes, jusqu'à ce que le paramètre 10 V soit atteinte.
   15. Si une courbe de concentration standard a déjà été créé en utilisant de multiples électrodes en fibres de carbone, effectuer l'étape de lésion ci-dessus (03/01/14) en appliquant directement le potentiel de l'électrode en fibre de carbone.
       Remarque: Cette méthode de lésion peut endommager la fibre de carbone et empêcher étalonnage ultérieur avec cette électrode spécifique.
   16. Euthanasier l'animal en utilisant une injection létale de pentobarbital (150 mg / kg, ip).
   17. Déloger la coiffe de la canule en utilisant une pince en tirant vers le haut directement sur la coiffe. Ne tordez pas la coiffe car cela provoquera des dommages inutiles au cerveau et rendre difficile pour identifier l'emplacement de l'électrode lors de l'histologie.
       1. Retirez le cerveau et dans 4% de formol pendant 3 jours, suivie par 30% suCROSE pour 1 semaine. Créer 30 um tranches en utilisant un cryostat, monter sur des lamelles et d'examiner les tranches sous un microscope optique pour identifier l'emplacement de la fibre de carbone ou d'une lésion de tungstène.
          Remarque: Perfusion est facultative pour 3.1.17.

4) Calibrage des électrodes

1. Utilisation de la cellule d'écoulement pour créer un facteur de conversion courant-concentration.
   1. Afin de déterminer la sensibilité de l'électrode, calibrer électrodes après chaque expérience en utilisant un flux appareil "t-cellule». Abaisser l'électrode dans le "t-cellule», tandis que le tampon Tris, de pH des solutions, ou des solutions DA sont lavés sur la surface de l'électrode (à un taux de 2 ml / min). Utiliser un à six positions solénoïde d'air actionneur pour basculer entre le tampon et le pH ou la solution DA.
   2. Pour chaque étalonnage, recueillir des données voltamétriques pendant 5 sec application de tampon Tris (de base), suivie par 5 application sec de pH ou une solution DA, suivi par un 20 secpplication de tampon Tris (fichier totale de 30 sec). Répétez chaque course 3 fois pour chaque concentration étalon, contrebalançant entre les différentes concentrations de chaque norme.
   3. Pour chaque prélèvement d'échantillons, de mesurer le pic DA ou le courant de pH-évoquée. La moyenne du courant de crête dans chaque essai pour obtenir une concentration en fonction du rapport de courant de crête. Pour des instructions plus détaillées, voir [12] et [13].

5) Analyse de données

1. L'utilisation d'un ensemble d'apprentissage en analyse en composantes principales (ACP)
   Remarque: Au cours d'une expérience de voltamétrie, est produit en tant que sortie de courant, qui est le résultat de l'oxydation et de la réduction de la dopamine, des changements de pH, et le bruit électrochimique. PCA permet la séparation de ces facteurs de sorte que l'on peut isoler les composants souhaités (DA et pH) et supprimer des composants supplémentaires qui pourraient fausser les signaux souhaités (pour une description plus détaillée, voir ^{15, 16).}
   1. Attribuer un facteur d'étalonnage à THe courant de sortie (environ 5 à 10 nA / uM) pour permettre PCA après les valeurs de concentration des analytes à déterminer.
   2. Utilisez l'ensemble de la formation obtenue lors d'une expérience de «former» le modèle PCA de dissocier les DA, le pH et d'autres facteurs. PCA prend la formation mis voltammogrammes cycliques (recueillies dans la section 3.1.8) et détermine les caractéristiques essentielles du voltamogramme peuvent être utilisés pour identifier chaque analyte recueillies lors des enregistrements in vivo de voltampérométrie.
   3. Pour déterminer le nombre de composantes principales à garder, utiliser un test F Malinowski. Typiquement, ne garder que 2 ou 3 composantes principales qui expliquent normalement environ 95-99% de la variance dans les données. Pour plus de détails sur la mise en œuvre du test F Malinowski, voir ^17.
      Remarque: Une fois que le nombre de composants sont déterminées, l'analyse PCA sera effectivement projeter les voltammogrammes mesurées à partir de DA et de la formation de pH fixe sur les principaux éléments qui ont été retenus.Le résultat est un ensemble de données qui a été filtré de sorte que seule DA (ou pH) des données reste et les données résiduelle qui ne ressemble pas DA ou le pH est retirée (Voir résultats représentatifs pour la sortie attendue). Pour une explication plus détaillée et étape par étape instruction pour l'utilisation de l'APC pour l'analyse voltampérométrique voir fiche Matériaux et ^{16, 17.}

Résultats

FSCV combinée avec l'implantation du cathéter intra-orale a été utilisé pour examiner comment le saccharose, un exhausteur de goût appétit, module la libération phasique DA dans le noyau du CNA. Avant la perfusion exhausteur de goût, la stimulation électrique (150 uA, 60 Hz, 24 impulsions; indiqué par la barre rouge) de l'ADV produit de fortes hausses dans la libération phasique DA dans le NAc (Figure 1) Figure 1 montre un tracé de couleur avec potentiel sur. l'axe des ordonnées, le temps sur l'axe des ...

Discussion

Livraison intra-orale combinée avec exhausteur de goût FSCV permet l'analyse du «temps réel» des réponses DA à aromatisants oraux. Il ya trois étapes critiques dans le protocole qui sont nécessaires pour les mesures DA succès. Tout d'abord, une bonne implantation du cathéter par voie orale est essentielle pour la réalisation des aromatisants. Veiller à ce que le cathéter est inséré derrière la première molaire et coincée en place empêche le cathéter de perdre la perméabilité et empêche le retrait accidentel par ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Électrode de stimulation	PlastiquesUn	MS303/2-A/SPC	lors de la commande, demandez une coupe de 22 mm sous le piédestal
Canule pour électrode	Systèmes bioanalytiques	MD-2251
capillaires en verre	A-M	624503
Fibre de carbone	Thornel	T650
Extracteur d’électrodes	Narishige International	PE-22
Isolateur de stimulus neurolog	Digitimer Ltd.	DS4
Thermorétractable	3M	FP-301
Fils isolés pour électrodes	Squires electronics	Custom	L 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU
Micromanipulateur	Univ. of Illinois at Chicago, Engineering Machine Shop
Epoxy	ITW Devcon	14250	"5 minute epoxy"
Copolymère d’acide perfluoro-3,6-dioxa-4-méthyl-7octène-sulfonique et de tétrafluoroéthylène	Ion Power	LQ-1105	i.e., Peinture Nafion
Silver	GC Electronics	22-023
Alimentation	BK Precision	9110
Tube pour cathéters intra-oraux	Intramedic	427426	PE 100, D.E. = 0,86 mm ; D.E. = 1,52 mm
Tube pour perfusion intra-orale	Fischer Scientific	02-587-1A	I.D. 1/32 » ; D.E. 3/32"
Pousse-seringue pour cellule d’écoulement	Pump Systems Inc.	NE 1000
Ciment chirurgical	Dentsply Calfeutrage	675571 et 675572
Actionneur d’air	VICI	A60	Interface de vanne numérique 6 positions
Interface de vanne numérique	VICI	DVI	230 VAC
Quad Headstage	Univ. de Caroline du Nord, Installation d’électronique Alimentation
UEI	Univ. de Caroline du Nord, Électronique Boîte
de dérivation UEI	Univ. of N. Carolina, Electronics Facility Alimentation
pour pousse-seringue tastant	Med Associates	SG-504
Pompe à seringue Tastant	Med Associates	PHM-107
Microélectrode de tungstène	MicroProbes	WE30030.5A3
Référence de fil d’argent avec AgCl	InVivo Métrique	E255A
Saccharose	Sigma	80497
Chlorure de magnésium	Sigma	M8266
Chlroide de sodium	Sigma	S7653
Acide perchlorique	Sigma	244252
Acide chlorhydrique (4 M)	Sigma	54435
Hydroxyde de soidum	Sigma	306576
Peroxyde d’hydrogène	Sigma	H1009
Chlorhydrate de dopamine	Sigma	H8502
TarHeel HDCV Software	Université de Caroline du Nord-Chapel Hill		Doit demander le logiciel : cliquez ici pour le lien vers la page de demande de logiciel