Génération de tissu adipeux humain cellules souches par dédifférenciation des adipocytes matures dans les cultures de plafond

Résumé

Les adipocytes matures peuvent représenter une source abondante de cellules souches par dédifférenciation, ce qui conduit à une population homogène de cellules de type fibroblaste. La digestion par la collagénase est utilisée pour isoler les adipocytes matures de la graisse humaine. L’objectif de notre protocole est d’obtenir des cellules graisseuses multipotentes et dédifférenciées à partir d’adipocytes matures humains.

Résumé

Il a été démontré que la classe

Les adipocytes matures inversent leur phénotype en cellules de type fibroblaste in vitro grâce à une technique appelée culture de plafond. Les adipocytes matures peuvent également être isolés à partir de tissu adipeux frais pour une caractérisation spécifique à la date limite de leur fonction et de leurs propriétés métaboliques. Ici, nous décrivons un protocole bien établi pour isoler les adipocytes matures des tissus adipeux en utilisant la digestion de la collagénase, et les étapes ultérieures pour effectuer des cultures de plafond. En bref, les tissus adipeux sont incubés dans un tampon Krebs-Ringer-Henseleit contenant de la collagénase pour perturber la matrice tissulaire. Les adipocytes matures flottants sont collectés sur la surface supérieure du tampon. Les cellules matures sont plaquées dans un ballon T25 entièrement rempli de milieu et incubées à l’envers pendant une semaine. Une approche alternative de culture sur plaque à 6 puits permet de caractériser les adipocytes en cours de dédifférenciation. La morphologie des adipocytes change radicalement au cours de la culture. L’immunofluorescence peut être facilement réalisée sur des lames cultivées dans des plaques à 6 puits, comme le démontre la coloration par immunofluorescence FABP4. La protéine FABP4 est présente dans les adipocytes matures mais régulée à la baisse par la dédifférenciation des cellules graisseuses. La dédifférenciation des adipocytes matures peut représenter une nouvelle voie pour la thérapie cellulaire et l’ingénierie tissulaire.

Introduction

La dédifférenciation in vitro des adipocytes matures est réalisée par une technique appelée culture au plafond¹. En raison de leur tendance naturelle à flotter dans les solutions aqueuses, les adipocytes matures isolés adhèrent à la surface d’un ballon renversé entièrement rempli de milieu de culture. En quelques jours, les cellules modifient leur morphologie sphérique et deviennent des cellules de type fibroblaste. Les cellules résultantes, appelées cellules adipeuses dédifférenciées (DFAT), sont multipotentes². Les articles de recherche sur la dédifférenciation des adipocytes, en particulier sur les cellules humaines, sont limités. Cependant, ils ont déjà fourni des informations intéressantes concernant la multipotence, le phénotype cellulaire et la capacité de réplication des cellules DFAT². Les adipocytes matures provenant de divers compartiments adipeux ont été dédifférenciés avec succès, y compris ceux provenant des tissus adipeux viscéraux et^{sous-cutanés humains 2-4}. En plus de ces dépôts, Kishimoto et ses collaborateurs ont échantillonné du tissu adipeux des coussinets adipeux buccaux et des adipocytes dédifférenciés en cellules DFAT⁵. Matsumoto et ses collaborateurs ont réussi à générer des cellules DFAT sous-cutanées de patients couvrant un large éventail d’âges, et la majorité des cellules avaient un taux de prolifération élevé et moins de 6 % de sénescence même après 10 passages en culture².

Les cellules DFAT ont été redifférenciées avec succès en plusieurs lignées, y compris les lignées adipogènes, ostéogéniques, chondrogènes et neurogènes^2,3,6. Ces cellules expriment plusieurs marqueurs de cellules souches embryonnaires tels que Nanog et les quatre facteurs pluripotents identifiés Oct4, c-myc, Klf4 et Sox2³. Ils expriment également des marqueurs spécifiques à chacune des trois couches germinales⁷. De plus, les cellules DFAT sont similaires aux cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse (CSM dérivées de BM) en fonction de leur signature épigénétique³. En exploitant la capacité des cellules souches des cellules DFAT, de nombreux groupes ont étudié leur potentiel pour traiter ou améliorer diverses maladies^8,9. Des améliorations des conditions pathologiques, telles que l’infraction du tissu cardiaque, les lésions de la moelle épinière et le dysfonctionnement du sphincter urétral, ont été observées avec des injections de cellules DFAT dans des modèles de rat de la maladie^10-12.

En plus des propriétés des cellules souches des cellules DFAT, elles peuvent représenter un nouveau modèle cellulaire pour les études de physiologie des adipocytes. La lignée cellulaire 3T3-L1 est souvent utilisée à cette fin, car ces cellules se différencient en adipocytes adhérents qui stockent les lipides sous l’effet d’une stimulation adipogénique¹³. Cependant, ces cellules proviennent de tissus embryonnaires de souris¹³. De plus, la spécificité du dépôt ne peut pas être étudiée avec ce modèle et il peut ne pas refléter pleinement la physiologie adipocytaire humaine¹⁴. D’autres laboratoires travaillent avec des cellules adipeuses isolées provenant de dépôts de graisse murine, mais la distribution de la graisse n’est pas dimorphe chez la souris et la configuration anatomique de la cavité abdominale du rongeur empêche d’extrapoler directement à l’homme¹⁵. Afin d’étudier les adipocytes dans le contexte de la physiopathologie de l’obésité humaine, la prise en compte de la distribution de la graisse corporelle et des différences spécifiques au dépôt de graisse est devenue essentielle¹⁶. Certaines limites des cultures primaires de préadipocytes, notamment les quantités de cellules obtenues à partir d’échantillons de biopsie de tissu adipeux et leur sénescence après quelques passages en culture, ont créé le besoin de modèles alternatifs. Perrini et ses collaborateurs ont étudié la spécificité du dépôt dans l’expression génique des cellules DFAT provenant de la graisse viscérale et sous-cutanée et les ont comparées à des cellules souches dérivées du tissu adipeux (ASC) du même dépôt de graisse. Ils ont démontré que les différences dans l’expression et la fonction des gènes se trouvaient principalement entre les dépôts plutôt qu’entre les types de cellules, ce qui suggère que les cellules DFAT sont physiologiquement proches de l’ASC du même dépôt. Les cellules DFAT peuvent représenter une alternative intéressante aux modèles disponibles pour les études sur la distribution des graisses dans la physiopathologie de l’obésité humaine. De plus, la culture au plafond est une méthode prometteuse pour obtenir des cellules souches adultes à des fins d’ingénierie tissulaire.

Ici, nous décrivons la digestion par collagénase, une technique largement utilisée pour isoler les adipocytes matures des échantillons de graisse sous-cutanée et/ou viscérale¹⁷, et les étapes ultérieures pour effectuer une culture au plafond et dédifférencier ces cellules en cellules multipotentes, semblables à des fibroblastes.

Protocole

Déclaration éthique: Le projet a été approuvé par le Comité éthique de la recherche de IUCPQ avant le recrutement des patients. Aux fins de cet article / vidéo, nous avons obtenu deux tissus de patients: 1) un patient de 62 ans avec un IMC de 50,7 kg / m ² et 2) à 35 ans, patiente avec un IMC de 57 kg / m ^2. Des expériences peuvent être réalisées avec les deux compartiments de graisse, mais ont été limitées à un compartiment graisse aux fins de cette vidéo. Les aspects techniques de la vidéo ont été réalisées avec le patient 1 et FABP4 immunofluorescence a été effectuée avec des cellules dédifférenciées du patient 2.

Traitement de l'échantillon 1.

1. Poser chirurgiens de recueillir le tissu adipeux des compartiments de gras de coiffe et sous-cutanée au moment de la chirurgie bariatrique laparoscopique.
2. Vite, apportez des échantillons de tissu adipeux au laboratoire à température ambiante et traiter immédiatement.
3. Effectuer digestion en laboratoire, dans une atmosphère non stérile. Leles cellules seront finalement transférés à la chambre de culture et cultivés dans des conditions stériles. Pour éviter la contamination, préparer tampon KRH avec de l'eau distillée et filtrée et suivre par une filtration (filtre de 0,22 pm) avant la digestion. Nettoyer soigneusement les tubes avec de l'éthanol avant le transfert dans la hotte de culture cellulaire pour flacon et la préparation de la plaque.
4. Placez le tissu adipeux sur un plat pré-pondérée et le poids fiche. Correction d'un petit morceau de chaque échantillon de tissu (moins de 1 cm ²⁾ dans un tampon de formaline à 10% à température ambiante pendant au moins 24 h avant inclusion dans la paraffine. Utilisez cet exemple intégré pour les expériences d'immunohistochimie (technique non représenté).
5. Placez un autre morceau dans un tube de 50 ml et le flash-gel dans l'azote liquide avant de le ranger à -80 ° C pour de nouvelles études sur les tissus adipeux entiers (par exemple, l'expression des gènes - technique non représenté).

2. digestion à la collagénase

1. Placez le morceau de tissu adipeux restant dans un ml tu 50être pour la digestion.
2. Ajouter 4 ml de KRH-WB supplémenté avec de la collagénase (350 U / ml) par gramme d'échantillon dans le tube de digestion.
3. Émincer le tissu adipeux avec des ciseaux.
4. Placez suspension de tissu adipeux hachée dans un shaker, 37 ° C, 90 min au maximum, pour une incubation de 45 minutes (maximum 1 heure).

3. Purification des adipocytes et préadipocytes

1. Verser la solution translucide avec quelques morceaux de graisse à travers un nylon 400 uM maillage dans un bécher en plastique.
2. Avec des pincettes, frotter la préparation de cellules sur le filet de nylon et laver avec 5 ml de KRH-WB.
3. Délicatement transférer la suspension cellulaire filtré dans un tube de 50 ml avec le tube en plastique et dans une seringue de 60 cc attaché à l'extrémité de la tubulure.
4. Que la suspension avec adipocytes matures reposer pendant environ 10 min, ce qui permet aux cellules d'atteindre le sommet de la mémoire tampon par flottation.
5. Aspirer lentement le tampon au fond du tube en utilisant 60cc Syrinaspiration ge.
6. Ajouter 20 ml de KRH-WB pour se laver. Répétez l'étape 3.4 pour 2 lavages supplémentaires.
7. Recueillir le tampon pour amener la suspension d'adipocytes à un volume final de 5 ou 10 ml, selon la quantité de cellules. Poursuivre avec les étapes de la section 5.
8. Récupérer la fraction stroma-vasculaire de la mémoire tampon recueillies avec la seringue 60cc par centrifugation (3000 rpm, RT, 5 min) pour de plus amples culture de cellules primaires si désiré (technique non représenté).

4. adipocyte mature Cell Count

1. Charge 10 pi de suspension doucement secoué adipocytaire dans une chambre de comptage (hémocytomètre). Effectuer le nombre de cellules en quatre exemplaires.
2. Calculer le nombre de cellules matures isolés.

5. âge mûr adipocytes Dédifférenciation en flacon T-25

1. Remplir une 25 cm ² flacon de culture tissulaire à ¾ du volume avec du DMEM / F12-20% de sérum de veau.
2. Selon le nombre de cellules, verser 500 000 cellules matures dans le ballon.
3. Remplissez complètement le ballon en utilisant un tube de 50 ml avec un milieu et enlever autant de bulles que possible.
4. Visser le bouchon sur le flacon non ventilé.
5. Nettoyez le ballon avec de l'éthanol avant l'incubation pour éviter la contamination.
6. Incuber le flacon tête en bas pendant une semaine sans le toucher pour éviter tout mouvement dans la culture qui peut perturber l'adhésion cellulaire.
7. Avant d'inverser le ballon à 7 jours de culture inversé, manipuler délicatement le ballon et enlever tout milieu dans la fiole par aspiration, en évitant les mouvements brusques.
8. Ajouter 12 ml de DMEM-F12-20% de sérum de veau et cultiver des cellules avec des techniques standards. A, bouchon à évent filtré peut être introduit dans le ballon.

6. âge mûr adipocytes Dédifférenciation dans une plaque à 6 puits

1. Déposer une lamelle couvre-objet sur le fond de chaque puits d'une plaque à 6 puits
2. Ajouter un ½ "bague en plastique sur le dessus de chaque lamelle.
3. Remplir les puits avec 8 ml de 20% de milieu DMEM-sérum de veau.
4. Mettez une lamelle sur chaque bague en plastique.
5. Insérer la pointe de la pipette entre la coulisse et le tube d'injecter des cellules sous la diapositive (50 000 cellules par puits).
6. Incuber les plaques dans un incubateur de culture cellulaire standard à 37 ° C avec 5% de CO ₂ pendant une semaine.
7. Lamelle inverse avec cellules attachées dans chaque puits de culture contenant 2 ml de milieux supplémentés avec du sérum de veau à 20% et de poursuivre.
8. Utilisation de cellules subissant une lamelle dédifférenciation à plusieurs fins, y compris immunofluorescence (technique non représenté).

Résultats

Changements morphologiques importants se produisent en adipocytes matures au cours dédifférenciation (Figure 1). Comme le montre la Figure 2, les cellules subissant une dédifférenciation ont été colorées avec un anticorps anti-FABP4 pour l'analyse de fluorescence. Les cellules avec une morphologie ronde ont exprimé la protéine FABP4 alors que la majorité des cellules de fibroblastes n'a pas fait. Après dédifférenciation, DFAT cellules peuvent être cultivées avec des procédures s...

Discussion

Dédifférenciation des adipocytes matures avec la technique de culture de plafond est une nouvelle approche pour obtenir des cellules souches du tissu adipeux d'un petit échantillon de tissu adipeux natif. Basé sur notre expérience et celle des autres ^deux, un gramme de tissu est suffisante à l'assiette ² flacon de 25 cm et d'obtenir une population de cellules DFAT pour lesquels l'homogénéité a été démontrée par Poloni et collaborateurs ^3. Adipocyte dédifférenciation sembl...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Albumine sérique bovine	Sigma	A7906
Adénosine	Sigma	A4036
Acide ascorbique	Sigma	A0278
NaCl			N’importe quelle marque peut être utilisée
KCl			N’importe quelle marque peut être utilisée
CaCl2			N’importe quelle marque peut être utilisée
MgCl2			Toute marque peut être utilisée
KH2PO4			N’importe quelle marque peut être utilisée
HEPES			N’importe quelle marque peut être utilisée
Glucose			N’importe quelle marque peut être utilisée
Collagène Type I	Worthington Biochemical Corp	LS-004196
DMEM/F-12, HEPES, sans rouge de phénol	Gibco-Life Technologies	11039-021	Ajouter au milieu : 20 % sérum de veau, gentamicine (50 µ ; g/ml) et Fungizone (2,5 & micro ; g/ml)
Sérum pour veaux, complété en fer, provenant de veaux nourris au lait maternisé	Sigma	C8056-500 ml 1
/2 en douille en plastique	Iberville	2704-CP	SKU :1000120918 (Home Depot)
Azote liquide	Linde
Formalin soluton, tamponné neutre, 10 %	SIGMA	HT501128
Pince à épiler
Ciseaux stériles
Seringues de 60 cc	Seringue
Tube
Tampon de stock Krebs-Ringer-Henseleit (KRH)			Préparez le tampon de stock comme suit : 25 mM HEPES pH 7,6, 125 mM NaCl, 3,73 mM KCl, 5 mM CaCl2.2H2O, 2,5 mM MgCl2.6H2O, 1 mM K2HPO4. Ajustez le pH à 7,4.
Tampon de travail Krebs-Ringer-Henseleit (KRH-WB)			Ajoutez les composants suivants fraîchement au tampon KRH : 4 % d’albumine sérique bovine, 5 mM de glucose, 0,1 & micro ; M adénosine, 560 & micro ; Acide ascorbique
M KRH-WB complété par de la collagénase			Ajouter 350 U/ml de collagénase de type I
T25 Flacon de culture tissulaire non ventilé	Sarsted ou autre marque
Plaque de culture tissulaire à 6 puits	BD Falcon ou autre marque
Verre de couverture de microscope 22x22	Fisherbrand	12-542-B
Béchers stériles

stérileBDen plastique de type I