Poisson zèbre kératocyte explants d'étudier la migration cellulaire collective et réépithélialisation dans la cicatrisation cutanée plaies

Résumé

Kératocytes poisson zèbre migrent en feuilles de cellules à partir d'explants et fournissent un modèle in vitro pour l'étude des mécanismes de la migration cellulaire collective dans le contexte de la guérison de la plaie épithéliale. Ces protocoles détail un moyen efficace de mettre en place des cultures d'explants primaires pour une utilisation dans des essais collectifs de migration cellulaire.

Résumé

En raison de leurs propriétés uniques mobiles, kératocytes de poissons dissociées des cultures d'explants ont longtemps été utilisés pour étudier les mécanismes de la migration d'une cellule unique. Toutefois, lorsque explants sont établis, ces cellules se déplacent également collectivement, le maintien de nombreuses fonctionnalités qui rendent individuelle kératocytes un modèle attrayant pour étudier la migration: les taux rapides de la motilité, vaste lamelles d'actine riche avec un câble d'actine perpendiculaire, et la vitesse relativement constante et direction de la migration. Au début des explants, l'interconversion rapide des cellules qui migrent individuellement avec ceux qui émigrent collectivement permet l'étude du rôle des adhérences cellule-cellule pour déterminer le mode de la migration, et souligne les liens moléculaires entre les deux modes de migration. Les cellules dans les explants ultérieures perdent leur capacité à migrer rapidement et collectivement en tant que transition épithélio-mésenchymateuse se produit et les gènes associés à la guérison de la plaie et l'inflammation sont exprimés différentiellement. Ainsi, kératocytes explants peuvent servir comme un modèle in vitro pour la réépithélialisation qui se produit lors de la cicatrisation des plaies cutanées et peuvent représenter un système unique d'étudier les mécanismes de la migration cellulaire collective dans le cadre d'un programme défini de changements dans l'expression génique. Une variété de lignes de poisson zèbre mutantes et transgéniques sont disponibles, ce qui permet explants à établir à partir de poissons avec différents fonds génétiques. Ceci permet le rôle des protéines différentes à l'intérieur de ces processus à traiter de manière unique. Les protocoles décrits ici décrivent une méthode simple et efficace pour l'établissement de ces cultures d'explants pour une utilisation dans une variété d'essais liés à la migration cellulaire collective.

Introduction

Les études de motilité cellulaire sont traditionnellement concentrées sur cellules en migration individuellement. Kératinocytes cultivées à partir de poissons et d'amphibiens explants se sont révélés être un système modèle puissant pour étudier les mécanismes de la motilité cellulaire utilisant la modélisation expérimentale et mathématique approches ^1-6. Les travaux expérimentaux sur les cellules migrent individuellement est aidée par le mouvement de glisse rapide, lisse des cellules, tout en maintenant un uniforme forme, la vitesse, et la direction. Cependant, in vivo, les cellules se déplacent collectivement fréquemment, tout en mainte....

Protocole

Ce protocole est conforme aux principes de bien-être des animaux AVMA pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et a été approuvé par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) à l'Université du Midwest.

1. Préparation d'anesthésie, équipement, et médias

1. Déchlorer environ 1,5 L d'eau du robinet en utilisant soit un agent commercial de déchloration (disponible dans les magasins pour animaux de compagnie) ou en laissant reposer l'eau pendant 24 heures. Obtenez trois béchers 1 L et remplir chacune avec 500 ml d'eau déchlorés. Label One pour la tenue de poi....

Résultats

Comme illustré sur la figure 1, des feuilles de kératinocytes peuvent être observées migration de dessous de l'échelle dans les heures suivant l'établissement de la culture de l'explant. Occasionnellement, une kératocyte migration individuelle qui se est détaché de la feuille migration collectivement peut être observée. En outre, dans l'expiant a été établie à partir d'un poisson qui a été préalablement pincées, il existe abondantes neutrophiles migrent à travers la feuille. Pendant .......

Discussion

L'étape la plus critique pour le succès de la culture d'expiant kératocyte permet à l'échelle d'adhérer à la boîte de culture pendant environ 2-3 min avant l'addition du milieu de culture. Environ 75% des échelles va adhérer et de grandir feuilles (le nombre de cultures établies pour chaque expérience devra être ajustée en conséquence). les feuilles de kératocytes ne forment pas autour de chaque échelle présente dans le poisson et mis en culture pour plusieurs raisons. Tout d'abord, la coloration.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Boîtes de culture à fond en verre de 35 mm (revêtement Poly-D Lysine)	MatTek	P35GC-1.5-14-C	L’épaisseur de 1,5 mm est la meilleure pour l’élimination des lamelles. Le diamètre de 14 mm offre une plus grande surface de culture.
Pince de style bijoutier suisse, Integra, Miltex 17-303	VWR	21909-460	Nous trouvons que les pinces étroites et fines fonctionnent le mieux pour l’élimination des écailles.