Poisson zèbre kératocyte explants d'étudier la migration cellulaire collective et réépithélialisation dans la cicatrisation cutanée plaies

Résumé

Kératocytes poisson zèbre migrent en feuilles de cellules à partir d'explants et fournissent un modèle in vitro pour l'étude des mécanismes de la migration cellulaire collective dans le contexte de la guérison de la plaie épithéliale. Ces protocoles détail un moyen efficace de mettre en place des cultures d'explants primaires pour une utilisation dans des essais collectifs de migration cellulaire.

Résumé

En raison de leurs propriétés uniques mobiles, kératocytes de poissons dissociées des cultures d'explants ont longtemps été utilisés pour étudier les mécanismes de la migration d'une cellule unique. Toutefois, lorsque explants sont établis, ces cellules se déplacent également collectivement, le maintien de nombreuses fonctionnalités qui rendent individuelle kératocytes un modèle attrayant pour étudier la migration: les taux rapides de la motilité, vaste lamelles d'actine riche avec un câble d'actine perpendiculaire, et la vitesse relativement constante et direction de la migration. Au début des explants, l'interconversion rapide des cellules qui migrent individuellement avec ceux qui émigrent collectivement permet l'étude du rôle des adhérences cellule-cellule pour déterminer le mode de la migration, et souligne les liens moléculaires entre les deux modes de migration. Les cellules dans les explants ultérieures perdent leur capacité à migrer rapidement et collectivement en tant que transition épithélio-mésenchymateuse se produit et les gènes associés à la guérison de la plaie et l'inflammation sont exprimés différentiellement. Ainsi, kératocytes explants peuvent servir comme un modèle in vitro pour la réépithélialisation qui se produit lors de la cicatrisation des plaies cutanées et peuvent représenter un système unique d'étudier les mécanismes de la migration cellulaire collective dans le cadre d'un programme défini de changements dans l'expression génique. Une variété de lignes de poisson zèbre mutantes et transgéniques sont disponibles, ce qui permet explants à établir à partir de poissons avec différents fonds génétiques. Ceci permet le rôle des protéines différentes à l'intérieur de ces processus à traiter de manière unique. Les protocoles décrits ici décrivent une méthode simple et efficace pour l'établissement de ces cultures d'explants pour une utilisation dans une variété d'essais liés à la migration cellulaire collective.

Introduction

Les études de motilité cellulaire sont traditionnellement concentrées sur cellules en migration individuellement. Kératinocytes cultivées à partir de poissons et d'amphibiens explants se sont révélés être un système modèle puissant pour étudier les mécanismes de la motilité cellulaire utilisant la modélisation expérimentale et mathématique approches ^1-6. Les travaux expérimentaux sur les cellules migrent individuellement est aidée par le mouvement de glisse rapide, lisse des cellules, tout en maintenant un uniforme forme, la vitesse, et la direction. Cependant, in vivo, les cellules se déplacent collectivement fréquemment, tout en maintenant les jonctions cellule-cellule, en particulier au cours de l'embryogenèse, la cicatrisation des plaies, et les métastases. Ainsi, la migration cellulaire collective est une zone de croissance et de plus en plus important de la recherche dans le domaine de la migration cellulaire. La migration collective de ces cellules a été récemment décrit ⁷ et il a de nombreuses caractéristiques uniques qui en font un système puissant pour étudier la migration cellulaire collective dans un modèle de cicatrisation.

ove_content "> Lorsque échelles sont cueillies à partir d'un poisson zèbre adulte anesthésié, certains tissu épithélial reste attaché à la face inférieure de l'échelle. Lorsque milieu de culture cellulaire est ajouté, ces cellules épithéliales, ou kératinocytes, migrent rapidement une unité collective de l'échelle. La culture d'expiant peut être considérée comme un modèle de cicatrisation de l'épithélium de la plaie, dans lequel les cellules migrent loin de l'explant comme ils le feraient à travers la matrice provisoire d'un lit de la plaie pour rétablir un epithelium intact. Des données récentes suggèrent que cette ex vivo imite de culture de nombreuses caractéristiques de in vivo la cicatrisation chez le poisson zèbre adulte. Les taux de fermeture de plaies ⁸ traduisent par une vitesse de migration similaire à celle observée dans l'ex vivo système ^7. En outre, dans une plaie modèle in vivo de guérison, le traitement par warfarine suggère que l'hémostase n'a aucun effet sur ​​le taux de guérison, tandis que le traitement par hydrocortisone pour diminuer la réponse immunitaire ne tardez pas réépithélialisation ⁸ . Comme le poisson zèbre ne saigne pas lorsque l'échelle est retiré de l'animal, l'hémostase ne est pas un acteur majeur. Bien que nous avons trouvé des cellules immunitaires dans les explants, nous ne avons pas étudié les effets qu'ils pourraient avoir sur la migration cellulaire collective.

Le protocole présenté ici décrit comment établir cultures kératocyte d'explants de poisson zèbre qui assurent la cohérence et la reproductibilité pour une utilisation dans de nombreux dosages biologiques. Ces cultures d'explants sont particulièrement convaincante modèle in vitro pour la migration cellulaire collective pour plusieurs raisons. Tout d'abord, les kératinocytes de poisson zèbre sont des cellules primaires utilisées dans les heures d'établir cultures d'explants. Par conséquent, ces cellules ne ont pas subi les changements morphologiques et génétiques expression associée à passage de cellules primaires ^9-13. D'autre part, ce système constitue un modèle pour l'étude de réépithélialisation en réponse à blessant ¹⁴ et, dans le cadre de la réponse à une blessure, un épithéliale mésenchymateuses à transition (EMT) processus est lancé comme en témoignent les changements dans l'expression des gènes et des réarrangements du cytosquelette ^14,15. Ainsi, les modifications de fond de l'expression génique et la motilité qui se produisent dans les cellules non traitées ont été caractérisés et fournir un contexte pour interpréter les changements avec le traitement. En outre, le kératocytes du poisson et le kératinocyte humain sont fonctionnellement équivalents; les deux sont des cellules épithéliales primaires de leurs espèces respectives et jouent un rôle clé dans la cicatrisation epitheliale. Troisièmement, le poisson zèbre adulte sont plus en plus reconnue comme un système modèle pour une variété de maladies humaines ^16-18 y compris le mélanome et d'autres cancers ^19-21, plaies cutanées guérison ^8,14 et la régénération des tissus ^22-24.

Les avantages techniques de ce système de modèle sont tout aussi convaincants. Un nombre croissant de lignées mutantes et transgéniques sont disponibles auprès but non lucratif, des installations centralisées. Plus précisément, le projet Mutation poisson zèbre (ZMP) Au Wellcome Trust Sanger Institute vise à créer un allèle de KO dans chaque codant pour la protéine gène dans le génome du poisson zèbre. Actuellement, ils ont muté 11.892 gènes, environ 45% du génome, avec 24 088 alleles caractérisés. En outre, ZMP accepte les propositions et générera gratuitement knock-out. Des méthodes récentes de knockdown de gènes dans des larves et des adultes poisson zèbre ^25-28 offrent une flexibilité pour étudier la fonction des gènes importants pour le développement pour lesquels des approches transgéniques sont problématiques ou impraticable.

En raison de leurs taux extrêmement rapides de la motilité de ~ 145 um / h peu après l'établissement de cultures ^29, les essais peuvent être achevées rapidement (généralement en 24 heures ou moins). Comme les expériences peuvent être achevées rapidement et les cultures poussent bien à la température ambiante, plusieurs des obstacles techniques associés à des mammifères essais de migration cellulaire impliquant la microscopie vidéo sont évités. En outre, à l'ère de resserrement des budgets de recherche, zebrafish sont facilement et économiquement maintenue.

La structure et le comportement de l'explant est complexe. Comme les poissons ne saignent pas lorsque l'échelle est supprimé, il est peu probable que beaucoup plus que les couches superficielles de l'épiderme sont retirés avec l'échelle. Kératocytes semblent être le type cellulaire prédominant dans l'expiant lorsque les échelles sont d'abord retirés du poisson comme la grande majorité des cellules apparaissent pour colorer avec un anticorps anti-E-cadhérine ^14. En outre, il ne existe aucune preuve de fibroblastes dans la culture initiale en juger par l'absence de coloration par immunofluorescence de la vimentine ^14. Cependant, avec suppression répétée à grande échelle, il semble y avoir de nombreux neutrophiles dans l'expiant (voir vidéo 1). Nous avons déterminé que ces cellules neutrophiles à partir d'observations morphologiques de leur taille, la motilité rapidement, et leur migration hors de la feuille de cellules quand ils sont exposés au LPS (données non présentées). En outre, ces cellules se colorent brillamment l'esprith un anticorps au facteur cytosolique des neutrophiles ainsi que d'une variété d'anticorps IgG secondaires, ce qui indique qu'ils ont FcR abondants sur leur surface (données non présentées). Plusieurs couches de cellules sont présentes dans l'expiant. La microscopie confocale révèle la présence d'une seule couche à proximité du bord d'attaque de plus de deux couches de kératinocytes à proximité de l'échelle avec les neutrophiles visibles ci-dessus, en dessous et entre les feuilles de kératocytes cellulaire.

Aux points de temps précoces, les cellules sur le bord de la multi-couche explant polariser, initiant la migration collective des kératinocytes de l'explant à des taux initiaux de ~ 145 um / h. La zone couverte par l'explant augmente rapidement, ce qui conduit à la propagation cellulaire, la tension à l'intérieur de la feuille, et une diminution du taux de l'avance du bord d'attaque. Interconversions rapides entre les cellules de leader et suiveur sont observés à la pointe lors de la formation et de la fermeture de trous formés spontanément au sein de la feuille ^7. Comme leEMT processus initié avec l'expiant continue, les fragments de feuilles et les kératinocytes perdent leur spécialisé, la motilité rapide. L'expression des gènes et des changements morphologiques compatibles avec EMT, la cicatrisation des plaies, et les réponses inflammatoires se produisent dans les 7 jours de culture avec des explants étant considérées comme viables pendant environ 10 jours ^14.

Protocole

Ce protocole est conforme aux principes de bien-être des animaux AVMA pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et a été approuvé par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) à l'Université du Midwest.

1. Préparation d'anesthésie, équipement, et médias

1. Déchlorer environ 1,5 L d'eau du robinet en utilisant soit un agent commercial de déchloration (disponible dans les magasins pour animaux de compagnie) ou en laissant reposer l'eau pendant 24 heures. Obtenez trois béchers 1 L et remplir chacune avec 500 ml d'eau déchlorés. Label One pour la tenue de poissons avant toute procédure et l'autre pour la récupération. Pour la troisième bêcher, ajouter 100 pg / ml de méthanesulfonate de tricaïne; cela devient le bécher dans laquelle les poissons seront anesthésiés.
2. Remplir un plateau peu profond avec de la glace, chauffer le milieu de culture (RPMI 1640, 10% de FBS (sérum fœtal bovin), 50 ug / ml de gentamycine, 100 ug / ml de kanamycine, HEPES 25 mM) à la température ambiante, et recueillir les pincettes de bijoutier propre. Pinces propres par immerchanter les conseils dans 70% d'éthanol et passer à travers un bec Bunsen, permettant à l'éthanol pour brûler.
3. Décider si la procédure sera effectuée sans grossissement, avec un, table éclairée loupe commercial avec 2 - grossissement 10X, ou binoculaire (entièrement dépendante de préférence personnelle).

2. Établir cultures d'explants

1. Attrapez le nombre désiré de poissons et le placer dans un bécher de maintien. Transférer un seul poisson dans le bécher d'anesthésie; il est préférable pour anesthésier les poissons individuellement.
2. Surveiller les effets de l'anesthésie en observant la piscine et les branchies mouvement du poisson. Comme l'anesthésie progresse, le mouvement des branchies ralentit et le poisson nagera erratique et souvent la tête en bas; envisager de poissons anesthésiés dès qu'un mouvement maillant cesse. Ne laissez pas le poisson pendant de longues périodes dans le bain de l'anesthésie car cela peut entraîner la mort des poissons.
3. Retirer le poisson du bécher d'anesthésie et de transfertà la glace, plaçant le poisson horizontalement avec la queue en face de la tenue des pincettes main. Si l'expérience avec la technique et si plusieurs poissons doivent être utilisés pour faire des explants, envisager de placer le poisson prochaine dans le bécher d'anesthésie à ce moment.
4. Pour enlever les écailles, pincettes de position parallèle au poisson avec pointe à bord de l'échelle. Appuyer sur le côté plat de la pince légèrement sur le côté du poisson pour amener l'échelle d'élever à partir du corps du poisson. Saisissez échelle avec des pincettes, arrache, et le lieu (sans inversion) en boîte de culture de tissu. Répétez la procédure, la suppression d'un maximum de 12 échelles d'un adulte de grande taille (six de chaque côté), en évitant la région des branchies, la ligne latérale, et les nageoires.
5. Placer le poisson dans le bécher de récupération et de surveiller pour se assurer qu'il se remet des effets de l'anesthésie. A cette époque, les poissons peuvent être transférés à un réservoir individuel. Laisser le poisson pour récupérer pendant au moins 21 jours pour permettre une régénération complète de l'échelle.
6. En fonction de laconception expérimentale, placer jusqu'à 20 échelles par boîte de culture de tissu traité 35 mm en plastique ou 4-6 échelles par verre plat en bas. Échelles permettent d'adhérer à l'antenne avant d'ajouter doucement les médias afin de ne pas détacher échelles de le plat.
   NOTE: Avec l'expérience, plusieurs poissons peuvent être traitées avant que le média est ajouté au premier plat.
7. Ajouter 1,2 ml de milieu complet (voir 1.2 ci-dessus) dans chaque boîte de 35 mm.
8. De préférence incuber les cultures d'explants à 28 ° C dans 5% _de CO2 pendant la période de temps désirée avec ou sans traitement supplémentaire. En variante, incuber les cultures sur une platine de microscope ou chauffé dans une chambre de culture de cellules vivantes pour la microscopie vidéo.

3. Brightfield et vidéo microscopie

1. plats de position contenant feuilles de cellules sur la platine du microscope et initialement mise au point avec l'objectif 4X.
   NOTE: Supérieur grossissements peuvent être utilisées, en fonction de l'expérience. Marquer l'emplacementchaque feuille et / ou l'orientation de l'antenne sur la scène cellule faciliteront la prise d'images au cours du temps avec les feuilles à peu près la même orientation.
2. Retirez les plats de l'incubateur et la photographie à divers points de temps, en fonction de chaque protocole expérimental et remettez-le dans l'incubateur si seulement les images fixes sont nécessaires sur la période expérimentale.
3. En effectuant la microscopie vidéo, faites attention à ce qui suit:
   1. Positionner la feuille de cellules échelle / émergeant à l'intérieur du champ de vision de telle sorte que la feuille de cellules migration reste dans le champ de vue pour la durée de la vidéo.
      NOTE: Cela peut prendre une certaine expérience en observant la façon dont les cellules migrent sous l'échelle. Pour de courtes vidéos, ce est moins préoccupante que pour des vidéos plus longues.
   2. Pour des délais plus courts, incuber à RT. Pour des délais plus longs (18+ RH), utiliser un stade chauffé ou une chambre d'incubation pour maintenir la température, l'équilibre du pH, et de minimiser l'évaporation de la culture moyen.

4. Fixation pour immunofluorescence Microscopie

1. Préparer et pré-chaudes toutes les solutions à 28 ° C. Pour voir kératocytes sous fluorescence, développer les cultures d'explants comme décrit ci-dessus en utilisant 35 mm boîtes de culture de tissus à fond de verre. Vous pouvez également utiliser les diapositives de la chambre de verre.
2. Ajouter 0,8 ml de 4% de paraformaldehyde dans PBS 1,1x à chaque plat. Ne pas retirer d'abord le milieu de culture. Incuber à température ambiante pendant 5 min, puis aspirer pour éliminer la solution.
3. Ajouter 0,8 ml de 4% de paraformaldehyde dans PBS 1,1x à chaque plat. Incuber à température ambiante pendant 5 min, puis aspirer pour éliminer la solution.
4. A moins d'utiliser des ligands externes ou extérieures, des epitopes des cellules perméabiliser par addition de 0,5 ml de 0,2% de Triton X-100 dans du PBS 1X. Incuber à température ambiante pendant 5 min, puis aspirer pour éliminer la solution.
5. Ajouter 0,5 ml de BSA à 1% dans du PBS 1x et incuber pendant 1 heure (à température ambiante) ou O / N (à 4 ° C).
   REMARQUE: Selon les conditions expérimentales, phalloidin peut être ajouté à cette étape.
6. Après incubation, aspirer la solution pour supprimer et procéder à la coloration des anticorps. Alternativement, stocker les boîtes de culture en ajoutant au moins 1-2 ml de 1% de BSA dans PBS 1x pour 3-4 semaines à 4 ° C.

5. Protocole d'immunofluorescence

1. Préparation des solutions d'anticorps primaires et secondaires selon les recommandations du fabricant.
   REMARQUE: si les recommandations du fabricant ne sont pas disponibles, une bonne dilution de départ d'anticorps primaires (à 1% de BSA dans du PBS 1x) est de 1: 500 pour polyclonaux et 1: 1000 pour les anticorps monoclonaux; une bonne dilution de départ pour des anticorps secondaires est de 1: 1000. Régler ces dilutions du stock d'origine obtenu du fabricant plus élevé si le signal est faible, plus faible si le signal est fort et le fond est un problème.
2. Aspirer la BSA à 1% dans une solution PBS 1x. Ajouter 0,5 ml de solution d'anticorps primaire et incuber pendant 1 heure (à température ambiante) ou O / N (à 4 ° C).
3. Retirer la solution d'anticorps primaire, placer dans un récipient propre et étiqueté tube de 1,5 ml microcentrifugeuse, et congeler à -20 ° C.
   REMARQUE: Ceci permet la réutilisation de l'anticorps primaire, si nécessaire.
4. Laver la capsule 3-5 fois avec du PBS 1x, l'élimination et le rejet du PBS après chaque lavage.
5. Ajouter 0,5 ml de solution d'anticorps secondaire. Si désiré, ajouter phalloïdine marquée par fluorescence (suite à la concentration recommandée de ne importe quel fabricant) pendant cette étape. Incuber pendant 1 heure (à température ambiante) ou O / N (à 4 ° C).
   NOTE: L'utilisation de phalloïdine marquée par fluorescence permet la visualisation des filaments d'actine; nous avons constaté que 488 phalloïdine marquée fonctionne le mieux dans nos kératocytes poisson zèbre, mais d'autres fluorophores peut être utilisé.
6. Retirez et jetez la solution d'anticorps secondaire.
7. Laver la capsule 3-5 fois avec du PBS 1x, l'élimination et le rejet du PBS après chaque lavage.
   NOTE: Le plat peut être stocké, couverte de la lumière, à 4 ° C se il est incapable de rivaliserw immédiatement; assurez-vous que 1x PBS est ajouté dans le plat avant de le ranger pour assurer les cellules ne se dessèchent pas, mais réchauffer à température ambiante (20 à 30 min), puis retirer la PBS juste avant de passer à l'étape suivante.
8. Lorsque vous êtes prêt à observer, ajouter 2 à 3 gouttes d'un milieu de montage, avec ou sans DAPI, selon les besoins expérimentaux, dans le plat et laisser reposer pendant 10 min à température ambiante.
   NOTE: Nous utilisons, un milieu de montage à base de glycérol disponible dans le commerce avec DAPI, mais d'autres milieux de montage peut être utilisé. Permettre 10 min pour le milieu de montage de se asseoir dans le plat facilite le retrait facile de la lamelle de verre du fond du plat.
9. Après incubation, presser doucement sur les côtés du plat pour desserrer et retirer la lamelle. Ajouter une baisse supplémentaire de milieu de montage sur une lame de verre et placer la lamelle, cellules vers le bas, sur la lame.
   REMARQUE: Pensez à sceller la lamelle à la diapositive à l'aide du vernis à ongle clair si la lame doit être maintenu pendant plus de 1-2 jours.
10. Observer la lame sous un microscope à fluorescence.
    REMARQUE: La plupart de nos images ont été prises avec un objectif 40X ou 63X objectif sous huile, mais l'objectif spécifique utilisé dépendra du protocole expérimental.

Résultats

Comme illustré sur la figure 1, des feuilles de kératinocytes peuvent être observées migration de dessous de l'échelle dans les heures suivant l'établissement de la culture de l'explant. Occasionnellement, une kératocyte migration individuelle qui se est détaché de la feuille migration collectivement peut être observée. En outre, dans l'expiant a été établie à partir d'un poisson qui a été préalablement pincées, il existe abondantes neutrophiles migrent à travers la feuille. Pendant les périodes de cult...

Discussion

L'étape la plus critique pour le succès de la culture d'expiant kératocyte permet à l'échelle d'adhérer à la boîte de culture pendant environ 2-3 min avant l'addition du milieu de culture. Environ 75% des échelles va adhérer et de grandir feuilles (le nombre de cultures établies pour chaque expérience devra être ajustée en conséquence). les feuilles de kératocytes ne forment pas autour de chaque échelle présente dans le poisson et mis en culture pour plusieurs raisons. Tout d'abord, la coloration...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Boîtes de culture à fond en verre de 35 mm (revêtement Poly-D Lysine)	MatTek	P35GC-1.5-14-C	L’épaisseur de 1,5 mm est la meilleure pour l’élimination des lamelles. Le diamètre de 14 mm offre une plus grande surface de culture.
Pince de style bijoutier suisse, Integra, Miltex 17-303	VWR	21909-460	Nous trouvons que les pinces étroites et fines fonctionnent le mieux pour l’élimination des écailles.