Criblage à semi-haute de la sécheresse de tolérance potentiel dans la laitue ( Lactuca sativa) de matériel génétique dans les collections

Résumé

Ce protocole a été développé pour cribler une grande collection de matériel génétique de laitue légumineuse à feuilles (Lactuca sativa L.) pour la tolérance à la sécheresse, afin d’identifier un petit groupe de laitues candidates à utiliser dans des études physiologiques, moléculaires et génétiques afin d’identifier les traits de tolérance à la sécheresse sous-jacents ainsi que les programmes de sélection.

Résumé

Ce protocole décrit une méthode par laquelle une grande collection de matériel génétique de laitue légumineuse verte à feuilles (Lactuca sativa L.) a été criblée pour déterminer les caractères probables de tolérance à la sécheresse. La disponibilité de l’eau douce à usage agricole est une préoccupation croissante aux États-Unis ainsi que dans de nombreuses régions du monde. Les épisodes de sécheresse à court terme, ainsi que l’intervention réglementaire dans la régulation de la disponibilité de l’eau, associés à la menace imminente de changements climatiques à long terme pouvant entraîner une réduction des précipitations dans de nombreuses régions agricoles importantes, ont accru la nécessité d’accélérer le développement de cultures adaptées pour une meilleure utilisation de l’eau afin de maintenir ou d’augmenter la production dans les années à venir. Ce protocole n’est pas conçu comme un guide étape par étape pour identifier au niveau physiologique ou moléculaire les traits de tolérance à la sécheresse de la laitue, mais plutôt une méthode développée et affinée par le criblage de milliers de variétés de laitue différentes. La nature de cet écran est basée en partie sur les mesures simplifiées axées uniquement sur trois indicateurs de stress hydrique : la teneur en eau relative des feuilles, le flétrissement et la croissance différentielle des plantes après un stress hydrique. L’objectif du criblage rapide d’une grande collection de matériel génétique est de réduire le nombre de candidats à un point où des méthodes physiologiques, moléculaires et génétiques plus intensives peuvent être appliquées pour identifier des traits spécifiques de tolérance à la sécheresse en laboratoire ou sur le terrain. Les candidats peuvent également être directement incorporés dans les programmes de sélection en tant que source de caractères de tolérance à la sécheresse.

Introduction

La disponibilité de l’eau pour l’irrigation est une préoccupation dans une grande partie des États-Unis et dans le monde depuis des décennies, mais la recherche sur la réponse au stress hydrique, ainsi que d’autres stress abiotiques, a pris du retard par rapport aux travaux dans les domaines de la résistance aux maladies et aux insectes, aux niveaux industriel, universitaire et gouvernemental, en grande partie en raison d’un manque de financement. La disponibilité de l’eau pour l’agriculture n’a toujours été qu’une réflexion après coup au niveau des décideurs. Récemment, en raison de plusieurs sécheresses sévères dans d’importantes régions de production agricole aux États-Unis et^{en Australie,} la disponibilité de l’eau douce a été mise en lumière aux niveaux national et international, ce qui a conduit à consacrer beaucoup plus de ressources à la recherche sur le développement de cultivars tolérants à la sécheresse des principales cultures céréalières. Bien que ce changement d’orientation vers le développement de cultures principales tolérantes à la sécheresse soit bénéfique, comme de nombreux domaines de recherche sur les plantes, les cultures spéciales ont été largement laissées pour compte.

Une grave sécheresse limite actuellement la production de légumes en Californie, la plus grande région de production de laitue (Lactuca sativa L.) aux États-Unis³. Ces conditions météorologiques à court terme, associées à des mesures législatives et judiciaires ainsi qu’à des changements climatiques à long^terme4,5, se sont combinées pour réduire la disponibilité de l’eau pour l’agriculture dans de nombreuses régions parmi les plus productives de Californie. La production de laitue en Californie représente une industrie de 1,5 milliard de dollars représentant près de 80 % de la production de laitue aux États-Unis³. Les légumes-feuilles ont une teneur élevée en eau foliaire et la laitue, en particulier, a un système racinaire peu profond^6,7 qui rend la culture vulnérable au stress hydrique. Dans le cas de la laitue, comme dans toutes les cultures, le développement de variétés résistantes à la sécheresse deviendra de plus en plus important à mesure que les réserves d’eau douce pour l’irrigation deviendront plus limitées⁸.

Ce protocole définit une méthode par laquelle un dépistage initial a été effectué sur une grande collection de matériel génétique de laitue afin d’identifier un ensemble de lignées candidates potentiellement tolérantes à la sécheresse pour utilisation dans des études physiologiques, moléculaires et génétiques afin d’identifier des traits spécifiques de tolérance à la sécheresse. Ces candidats peuvent également être utilisés directement comme sources de tolérance à la sécheresse dans les programmes de sélection afin d’améliorer l’efficacité de l’utilisation de l’eau dans les cultivars commerciaux. Ce protocole a été développé spécifiquement pour relever les défis qui se posent au cours de tout dépistage d’une vaste collection de matériel génétique, en particulier les problèmes de disponibilité de l’espace et de main-d’œuvre. De plus, le protocole tel qu’il a été présenté a été élaboré pour être utilisé dans la laitue, mais a été adapté avec succès pour être utilisé dans le criblage d’une collection de matériel génétique d’épinards (Spinacia oleracea) pour une tolérance potentielle à la sécheresse et pourrait être modifié simplement pour cribler n’importe quelle culture de légumes-feuilles.

Une considération importante avant de lancer un dépistage de tolérance à la sécheresse est de comprendre ce qu’est cette méthode et ce qu’elle n’est pas. Ce protocole se veut une méthode rapide permettant de réduire rapidement et efficacement un grand nombre de matériel génétique à un nombre gérable de matériel génétique candidat pour des études plus ciblées et approfondies visant à identifier les traits de tolérance individuels. Ce protocole soumet les plantes à un stress hydrique sévère rapidement induit, contrairement à un stress hydrique continu modéré induit plus naturellement, lentement induit, qui serait observé dans des conditions de terrain. Le type de réponse induite au sein de la plante lors de ces deux types d’événements de stress hydrique (déshydratation rapide versus sécheresse naturelle) n’est pas identique⁹ ce qui pourrait conduire à l’exclusion de certains matériaux des futurs essais. Ces deux événements de stress ne sont cependant pas sans chevauchement¹⁰ et ce protocole devrait servir de moyen efficace d’identifier le matériel génétique potentiellement tolérant à la sécheresse contenu dans une grande collection. Ce protocole à lui seul ne devrait pas être considéré comme suffisant pour identifier avec un degré élevé de certitude le matériel génétique qui contient une tolérance durable à la sécheresse dans des conditions de stress hydrique de terrain, mais il représente un pas en avant significatif dans le dépistage rapide des légumes-feuilles verts pour des caractéristiques potentielles de tolérance à la sécheresse.

Protocole

1. Plantation

1. Remplissez plateaux alvéolés (128 cellules; 28 x 54 cm avec des cellules 3 cm carrés et 5 cm de profondeur) avec un mélange de mini-mottes. Pour faciliter le remplissage uniforme des cellules comprimer sol dans chaque plateau à l'aide d'une fiche bac vide.
2. Plante graines de laitue ¼ de pouce de profondeur 2-3 graines par cellule. Toutes les lignes expérimentales dans des bacs répliquées usine pour fournir à la fois une sécheresse souligné et les plateaux de contrôle pour l'essai de la sécheresse.
3. Placez plateaux alvéolés dans un bac de base sans trous.
4. plateaux de l'eau et la couverture avec bac inversé ou dôme en plastique. La germination se produit normalement dans 48 à 72 h. Après la germination, enlever le couvercle et déplacer les plateaux en serre.
   NOTE: Ce protocole pourrait également être effectuée dans des chambres de croissance.

2. Croissance et entretien des plantes

1. plateaux de l'eau si nécessaire 1-4 semaines après la germination, normalement ce est 2-3 fois par semaine, en remplissant le bac inférieur et permettant sol pour devenir saturé (~ 1 h) rayons de se asseoir pendant une période prolongées dans l'eau, car cela pourrait avoir un impact négatif sur la santé des plantes et le développement des racines et peuvent affecter l'écran de la sécheresse.
2. Fertiliser plateaux une fois par semaine avec un engrais 20-20-20 soluble commerciale mélangé à un taux de 1,5 c / gal.
3. Plaques minces à une plante par cellules 1-2 semaines après la germination.

3. Initier stress hydrique

1. Lorsque les plantes sont de vieilles quatre semaines plateaux séparés en 2 groupes. Sous réserve d'un groupe à un stress hydrique sévère. Utilisez les autres magasins commandes bien arrosées. L'eau du groupe témoin comme dans l'étape 2.1 pendant toute l'expérience. Lors de l'ouverture de la contrainte de la sécheresse de suspendre la fertilisation tous les bacs pour le reste de l'expérience.
2. La période de sécheresse expérimentale se produit plus d'une semaine. Sur la première journée du procès de stress de la sécheresse (jour 0) remplir tous plateaux inférieurs avec de l'eau et laisser le sol dans les bacs à fiches afin de devenir complètement saturé puis égoutter l'eau de plateaux. Saturant le sol immédiatement avant le début de til période de stress aidera à minimiser toute variation de l'humidité du sol entre les cellules individuelles dans les plateaux alvéolés.

4. Conduite de l'écran de stress de base sécheresse avec les paramètres à mesurer

REMARQUE: Les étapes suivantes décrivent comment recueillir les trois mesures physiologiques qui seront enregistrés au cours de l'écran de la sécheresse alors que le tableau 1 fournit un calendrier des mesures prises sur chaque jour de la période d'essai sécheresse stress.

1. Mesurer la Feuille relative Teneur en eau (RWC) aux jours 0, 2, 4 du procès.
   1. Clips une plante de laitue dans le bac et retirez deux feuilles.
   2. Percez trois disques de chaque feuille en utilisant un perce-bouchon # 9 (~ 1,6 cm de diamètre). Combinez poinçons de feuilles comme un échantillon.
   3. Peser les disques de feuilles, ce est la valeur de poids frais (FW) utilisé pour le calcul RWC, puis placer les disques dans une boîte de Petri.
   4. Ajouter de l'eau distillée juste assez pour la plaque à tousow tous les disques de feuilles de flotter. Ce est bien hydrater les disques de feuilles de recueillir poids turgescents pour l'analyse RWC. Laisser les disques de feuilles de flotter pendant 24 heures à température ambiante.
   5. Retirez les disques de feuilles maintenant pleinement hydratés des plaques et doucement sécher l'extérieur des disques de feuilles avec du papier absorbant avant de peser les disques. Enregistrez ces poids que le poids turgescents (TW) pour le calcul RWC.
   6. Lieu disques de feuilles sur un laboratoire de papier essuyer ou un disque de papier filtre dans une boîte de Pétri ouverte et sec dans un incubateur à 55 ° C pendant 24 heures.
      NOTE: Le papier empêche les disques de feuille d'adhérer à la boîte de Pétri pendant le séchage.
   7. Peser disques de feuilles sèches et enregistrer les poids secs (DW) pour le calcul RWC.
   8. Calculez RWC utilisant la formule de Weatherley comme décrit par Smart et Bingham ^11,12.
      RWC = (FW-DW / TW-DW) * 100
      FW = poids frais, TW = poids turgescents, DW = poids sec
   9. Répétez l'étape 4.1 pour chaque matériel génétique et de traitement dans l'essai.
2. Enregistrer la plante veux début une fois par jour le jour 1 de l'essai de stress de la sécheresse et se terminant lorsque 100% des plantes sont fanées, normalement 4 ou 5 jours.
3. La phase de récupération et de différentiel de croissance
   1. Au jour 6, de conclure la période sécheresse stress et les plantes stressées entrent dans la phase de récupération du procès. Remplissez les plateaux inférieurs avec de l'eau et permettre aux plateaux victimes de la sécheresse à tremper pendant 24 heures avant de reprendre le programme d'arrosage standard, étape 2.1, que les plateaux de contrôle.
   2. Permettre à tous les plantes de récupérer pendant 10 jours.
   3. 10 jours après la sécheresse-stress récolter l'ensemble dessus de la portion de terrain de chaque plante et enregistrer le poids frais.

Résultats

Lors de l'exécution d'un grand écran afin de séparer une population par le trait expérimentale souhaitée, dans le cas de ce protocole réponse sécheresse stress, les données générées seront en conséquence être varié de très soulignent sensibles à susceptibles tolérant à la sécheresse et tous les points entre les deux. Figure 1 contient des graphiques représentant le type de résultats que l'on peut attendre de ce protocole. Cultivars représentatifs de trois types de laitue différentes (Romaine (cos), pomm...

Discussion

Considérations de numéro de l'échantillon pour l'écran.

Le nombre d'échantillons nécessaires devrait être basée sur l'utilisation souhaitée des données à partir de cet écran. Si les résultats de la qualité de la publication sont souhaitées il est recommandé de récolter trois plantes individuelles (3 réplicats biologiques) de chaque ligne et effectuer un minimum de deux répétitions expérimentales de donner des points adéquates pour l'analyse statistique de...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
plateau de prise 128	T.O. Plastics Hummert International	11-8595-1	N’importe quelle marque de plateau de prise fonctionnera, mais utilisez le même style de plateaux pour tous les essais.
plateau inférieur (plateau d’affichage)	T.O. Plastics Hummert International	11-3305-1
bouchon/mélange de plantation (Sunshine Mix #5)	Sunshine Hummert International	10-0467-1	Il peut être nécessaire de substituer un mélange différent si l’on adapte ce protocole à une autre culture. Le mélange Sunshine #4 a été utilisé dans des essais sur les épinards.
engrais (20-20-20)	Jack’s : Engrais hydrosoluble professionnel Hummert International	07-5915-1	N’importe quel engrais peut être utilisé, ajustez le type au besoin pour adapter ce protocole aux besoins spécifiques de la culture.