Évaluation expérimentale de la souris Sociabilité L'utilisation d'un traitement automatisé Approche d'image

Résumé

Ce protocole décrit un procédé pour quantifier la sociabilité de la souris. Les souris sont filmés comme ils se déplacent et interagissent dans une cage spéciale. traitement de film permet la quantification automatique de sociabilité avec une excellente précision et de fiabilité.

Résumé

La souris est l'organisme modèle préféré pour tester des médicaments visant à accroître la sociabilité. Nous présentons une méthode pour quantifier la sociabilité de la souris dans lequel la souris d'essai est placé dans un appareil standardisé et les comportements pertinents sont évalués en trois sessions différentes (appelée session de I, II et III).

L'appareil comporte trois compartiments (voir figure 1), les compartiments gauche et droit contiennent une coupe inversée qui peut loger une souris (appelé "souris de stimulation»).

Dans la session I, la souris d'essai est placé dans la cage et sa mobilité est caractérisée par le nombre de transitions effectuées entre les compartiments. Dans la session II, une souris de relance est placé sous l' une des tasses inversées et la sociabilité de la souris de test est quantifiée par les quantités de temps qu'il consacre près de la coupe contenant la souris de relance fermée par rapport à la coupe renversée vide. Dans la session III, les tasses inversées sont enlevés une d les deux souris interagissent librement. La sociabilité de la souris d'essai en session III est quantifiée par le nombre d'approches sociales qu'il fait vers la souris de relance et par le nombre de fois où il évite une approche sociale par la souris de relance.

L'évaluation automatisée du film détecte le nez de la souris de test, ce qui permet la détermination de toutes les mesures de sociabilité décrites dans la session I et II (en session III, les approches sont identifiés automatiquement, mais classés manuellement). Pour trouver le nez, l'image d'une cage vide est numériquement soustraite de chaque image du film et l'image résultante est binarisée d'identifier les pixels de la souris. La queue de la souris est automatiquement supprimé et les deux points les plus éloignés de la souris restante sont déterminés; ce sont près du nez et de base de la queue. En analysant le mouvement de la souris et en utilisant des arguments de continuité, le nez est identifié.

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Figure 1. Évaluation de Sociabilité Au cours de 3 sessions Session I ( en haut):.. Acclimatation de souris d'essai à la cage Session II (milieu):. Test de la souris se déplacer librement dans la cage alors que la souris de relance est enfermée dans une coupelle inversée Session III (en bas): Les deux souris de test et relance la souris sont autorisés à se déplacer librement et d'interagir les uns avec les autres.

Introduction

Sociabilités avec facultés affaiblies est l' un des domaines de symptômes primaires dans une gamme de troubles neurodéveloppementaux, y compris les troubles du spectre autistique (TSA) ^1,2. Il limite sévèrement la capacité des patients à développer des relations et affecte grandement les patients, les familles et les soignants ^2,3.

Dans un effort pour mieux comprendre le mécanisme sous - jacent avec facultés affaiblies sociabilité et développer des traitements, plusieurs modèles de souris ont été étudiés ^1,4-9. Une telle souche est la souris BALB / c, une souche consanguine qui présente étonnamment faible sociabilité, les caractéristiques observées chez les patients avec ASD5 ^8-12 ressemblant. Par exemple, la souris BALB / c affiche une fréquence plus basse des approches sociales et une réponse généralement négative aux approches sociales par une souris de stimulation (par exemple, la prévention sociale) que la souche comparateur Swiss Webster ^10.

Pour tester si un traitement proposé est effective dans l'augmentation de la sociabilité, des mesures objectives sont nécessaires. Un cadre largement accepté est d'analyser la sociabilité dans un appareil standardisé qui a trois compartiments (voir Figure 1).

Les compartiments gauche et droite contiennent chacun une coupe de fil inversé qui abrite une souris de relance socialement saillant. La souris d'essai est libéré dans l'appareil pendant trois intervalles de 10 min (sessions I-III); Session I évalue l'activité locomotrice de la souris de test, alors que les sessions II et III évaluer les différents aspects de la sociabilité de la souris d'essai.

Je en session, la souris de test est autorisé à acclimater à l'appareil. Dans cette session, le nombre de transitions que la souris d'essai fait entre les différents compartiments est mesurée. Fait important, les mesures de sociabilité obtenus dans l'appareil à trois compartiments standards sont dépendant de l'activité locomotrice et l'activité locomotrice réduite peuvent fausser l'interprétation des socidonnées de capacité.

Dans la session II, la souris d'essai se déplace librement et une souris de relance est placé sous l'une des tasses inversées (compensée). Les souris de relance sont de 4 semaines vieux consanguine ICR mâles souris, âge et le sexe appariés à des souris d'essai. La souris de stimulation est enfermée dans une coupe inversée dans la partie désignée comme le compartiment social et une coupelle inversée vide est placé dans la partie désignée comme le compartiment nonsocial. Dans la session II, la sociabilité de la souris de test est quantifiée en comparant le temps qu'il passe près de la tasse "social" inversé (moins de 2 cm) par rapport au temps qu'il passe près de la coupe inversée "nonsocial", et par le temps il passe dans le compartiment sociale par rapport au temps qu'il passe dans le compartiment nonsocial. souris comparateur Swiss Webster passent beaucoup plus de temps dans le compartiment social et près de la coupe inversée sociale par rapport à souris BALB / c qui ne montrent aucune préférence significative pour le développement socialcoupe inversée ou le compartiment sociale ^12.

Dans la session III, les souris de test et de relance sont autorisés à interagir librement (tasses inversées sont enlevés). Mesures de sociabilité, des comportements stéréotypés et les transitions entre les compartiments sont obtenus de manière fiable à la troisième session de 10 min d'interactions entre le test et les souris de relance et analysé. Dans ce rapport, la sociabilité de la souris de test est quantifiée par deux mesures: 1) le nombre d'approches sociales, il fait vers la souris de relance, où une approche sociale est définie comme aller de l'avant (nez en premier) vers la souris de stimulation de sorte que la le nez est inférieure à 2 cm de la souris de relance; 2) le nombre d'évitements des approches sociales par la souris de relance. La souris de test est considéré comme évitant l'approche si elle tourne ou se déplace loin de la souris de relance, ou si elle arrête temporairement le déplacement ( «gel comportement») après que la souris de relance a approché la souris d'essai. BALB /souris c montrent une diminution du nombre d'approches sociales faites à la souris de relance et une augmentation du nombre de réponses négatives aux approches sociales par la souris de relance, par rapport à la souche de comparaison Swiss Webster ^10.

L'évaluation des films de comportement a toujours été fait manuellement, à savoir, en regardant le film avec précaution (éventuellement à vitesse réduite) et l' activation de chronomètres pour le temps de la souris passe dans un certain compartiment ou à proximité de l' une des tasses inversées ^10. Cette méthode nécessite en regardant du film de manière répétée et est donc beaucoup de temps. En outre, la précision est limitée par le temps de réaction de l'évaluateur pour les mesures du chronomètre et la capacité à percevoir si la souris est à moins de 2 cm de la coupe inversée. Dans des travaux récents, deux composés, (D-sérine et la D-cyclosérine) se sont avérés efficaces dans le rétablissement de la sociabilité souris BALB / c ^9,10,12. Il est connu que les deux composants modula fin du récepteur NMDA, qui est connu pour jouer un rôle central dans le comportement social ^2,12. Une large gamme de composés est connue pour moduler l'activité des récepteurs NMDA dans une variété de façons bien définies, et le risque d'une percée dans le traitement TSA rend l'évaluation accélérée de ces composés, une priorité et une méthode rapide et automatique pour une évaluation hautement souhaitable.

Décrite ci-dessous est un procédé d'analyse automatique mis au point pour l'évaluation de la sociabilité de la souris. Il utilise des méthodes de traitement d'image sur toutes les images des films de souris pour identifier la position de la souris ou la souris. Dans les sessions I et II, il détecte encore la position du nez et l'utilise pour calculer des mesures de sociabilité. Dans la session III, il détecte automatiquement toutes les approches, mais la classification manuelle (approche sociale, évitement social, ou autre) est nécessaire.

Protocole

Le protocole pour la facilité d'explication a été divisée en 2 parties: 1) Procédure expérimentale et 2) Analyse automatisée. Tous les animaux ont été traités selon le Guide pour les soins et l' utilisation des animaux de laboratoire ^15, et toutes les procédures ont été approuvées par le Comité soin et l' utilisation des animaux institutionnels.

1. Procédure expérimentale

1. Mettre en place la cage, qui est une boîte rectangulaire en plexiglas non réfléchissants en noir (52 x 25 x 23 cm ³⁾ divisé en trois compartiments: social, non sociales, et un compartiment central neutre (figure 1). Placer des gobelets en fil inversées dans chacun des compartiments d'extrémité au cours des sessions I et II (voir ci-dessous) et loger la souris de stimulation pendant la session II.
2. Configurer l'appareil de telle sorte que la cage remplit le champ de vision. Etant donné que l'éclairage peut interférer avec le comportement de la souris, conserver une luminance de pas plus de 3,5 lux à l'intérieur de la cage, en provenance de la lumière indirecte à partir deune ampoule à incandescence, mesurée sur le plancher de la cage dans la direction vers le haut. Également utiliser une source de lumière infrarouge, qui souris ne peut pas sentir, mais la caméra peut détecter. Enregistrez tous les films en 720 x 480 définition standard.
3. Enregistrer un seul cadre d'une cage vide pour le traitement d'image plus tard (appelé le "cadre de référence") et enregistrer comme une image en niveaux de gris.
4. Session I: Introduire la souris d'essai dans la cage et agite la main sur la cage, indiquant le début de la session (comparer Analyse automatisée). film d'enregistrement pendant 10 min. Au bout de 10 min, placer la souris de nouveau dans sa cage d'origine.
5. Session II: Mettez la souris de relance sous l'une des tasses inversées (compensée).
6. Utilisez le bouton «gauche sociale» ou «droit social» pour sélectionner si la souris de relance est dans la coupe inversée à gauche ou dans la coupe renversée sur la droite.
   REMARQUE: La coupe inversée avec la souris de relance est appelé la «coupe sociale», tandis que l'autretasse le "tasse nonsocial". Le compartiment dans lequel la coupe sociale se trouve est appelé le compartiment social, le compartiment avec la coupe nonsocial est le compartiment nonsocial, et le compartiment du milieu est le «compartiment neutre».
7. Introduire la souris d'essai dans la cage. Vague main sur la cage pour indiquer le début de la session. film d'enregistrement pendant 10 min. Surtout, gardez la souris dans l'appareil de sociabilités avant de retirer les tasses inversées pour commencer Session III.
8. Session III: Retirez les tasses inversées, relâchez les deux souris et permettent aux souris d'essai et de relance d'interagir librement entre eux. Vague main sur la cage pour indiquer le début de la session. film d'enregistrement pendant 10 min. Au bout de 10 min, de mettre les souris dans leurs cages respectives.

2. Analyse automatisée

REMARQUE: Les commandes à l' article 2 sont émis via une interface utilisateur graphique (voir la figure 2) qui conTrols notre logiciel. Nous expliquons ici le traitement étape par étape que notre logiciel permet; Le logiciel est également capable d'effectuer l'analyse en mode discontinu, sans intervention de l'utilisateur.

1. Pour chaque film, exécuter les étapes de traitement suivantes:
   1. film de charge (cliquez sur le bouton Load).
   2. Sélectionnez la configuration de la cage, ce qui indique au programme d'analyse de l'emplacement des cages limites, les limites du compartiment, et les emplacements de coupe. Sélectionnez l'une des quatre configurations enregistrées ou ajuster manuellement toutes les coordonnées.
      REMARQUE: la configuration ne change généralement pas d'une expérience à l'autre et peut donc être réutilisé.
   3. Pour chaque image de la vidéo, suivez les étapes de traitement suivantes (2.1.3.1-2.1.3.6).
      1. Convertir le cadre en niveaux de gris en cliquant sur le bouton "Grayscale".
      2. soustraire numériquement le cadre de référence en niveaux de gris (voir étape 1.3) en cliquant sur le bouton "Soustraire". NOTE: Le but de cette étape est de faire les va de pixelsLues du cadre très proche de zéro partout, sauf pour la position de la souris.
      3. Binariser le cadre en réglant tous les pixels en dessous d'un certain niveau de seuil au noir, tous les pixels au-dessus de ce niveau au blanc (cliquez sur le bouton "Binariser").
         Remarque: L'idée est que, puisque les pixels de souris ont généralement des valeurs plus élevées que les pixels restants, les pixels de la souris deviendra blanc et tous les autres pixels noirs. Le niveau de seuil optimal dépend de la condition d'éclairage et peut être déterminée en évaluant la forme de la souris à travers un film. Si le seuil est choisie trop faible, la souris semble trop importante, et les pixels qui ne font pas partie de la souris peut être de couleur blanche. Si le seuil est trop élevé, la souris devient petit et peut se désintégrer en morceaux déconnectés. Dans les films enregistrés, le seuil optimal était toujours entre 20 et 35 (sur une échelle de 0 à 255).
      4. Erode ¹³ les temps image e binarisées, puis dilatent ¹³ 2e fois, puis erode temps à nouveau e, en appuyant sur le bouton "Erod / Dil".
         Remarque: Le but de cette procédure est d'enlever la queue. Pour la résolution (720 x 480), qui a été utilisé, e = 3 travaillé dans toutes les circonstances.
         Remarque: Le logiciel vérifie automatiquement la présence d'une main dans l'image (pendant l'enregistrement de films, les mains sont agités à travers l'image pour indiquer le début d'une session). Si une main est présent, il y aura inhabituellement nombreux pixels blancs dans le cadre binarisée parce que la main est beaucoup plus grand qu'une souris. La condition de la présence d'une main est qu'il ya plus de 10.000 pixels blancs dans le cadre binarisée. Le logiciel détermine le début des sessions I, II et III, en détectant la gamme de trames dans lesquelles se produisent les mouvements de la main.
2. Dans les sessions I et II, continuer comme suit:
   1. Détecter la plus grande composante connexe de l'ensemble des pixels blancs (Cliquez sur "LComp"). Remarque: Le but of cette étape est d'éliminer les pixels blancs qui ne font pas partie de la souris, par exemple, causée par le mouvement de la souris de stimulation en session II. La plus grande composante connexe est dans presque tous les cadres de la souris.
   2. Déterminer les deux pixels blancs les plus éloignés (appelés les "extrémités" de la souris) en cliquant sur "Trouver Ends".
      Remarque: Le logiciel établit la continuité des deux extrémités, à savoir, pour chacune des extrémités de la première trame à laquelle des extrémités dans les trames ultérieures ils appartiennent. L'idée générale est que, puisque les cadres sont comptabilisées au taux élevé, les extrémités ne peuvent pas voyager loin d'une image à l'autre, de sorte que pour la poursuite correcte des extrémités d'une image à l'autre est celle qui minimise la somme des distances les extrémités se déplacent. Voir la discussion pour plus de détails.
   3. Déterminer quelle extrémité de la souris est le nez.
      1. Déterminer la direction dans laquelle une souris se déplace en observant la façon dont le centre de gravité (COG)changements de cadre à cadre (mouvement de la COG est le mouvement de la somme de tous les pixels de la souris).
         Note: Le COG d'un ensemble de pixels p _1, ..., p _n avec les coordonnées x _1, .., x _n est défini par:
         
         Les souris se déplacent habituellement vers l' avant ( à savoir, vers leur nez). Dans une section de plusieurs centaines de cadres, il est toujours très grande confiance dans la détection de tête / queue.
         Remarque: Le logiciel détermine automatiquement vers lequel des extrémités détectée la souris se déplace; cette fin est identifié comme le nez et marqué d'un cercle rouge dans le film. Lorsque le nez détecté est marqué d'un cercle rouge dans chaque image, l'utilisateur peut vérifier la qualité de la détection.
3. Dans la session III, continuer comme suit:
   1. Détecter les deux plus grandes composantes de pixels blancs.
      1. Si les deux sont de taille acceptable pour amouse et leurs centres de gravité (COGS) sont compatibles avec les COG de souris de la trame précédente, considérer ces deux composantes les deux souris.
      2. Considérez la souris tailles acceptables si elles n'ont pas changé de plus de 20% depuis l'image précédente, et envisager COG de deux trames consécutives comme compatibles si leur différence ne soit pas supérieure à la distance d'une souris peut voyager dans le temps entre les images (cette distance suit à partir de la vitesse de la souris maximale, qui peut être déterminé dans le cadre de la préparation d'une série d'essais en analysant le mouvement de plusieurs souris individuelles (comme dans les sessions I et II).
         Remarque: Si les deux principaux composants sont des tailles pas acceptables pour une souris, ou les engrenages sont trop différentes de celles de la trame précédente, le logiciel augmente automatiquement le seuil de binarisation jusqu'à ce que les deux principaux composants sont de taille acceptable et leurs COG sont compatibles avec ceux de la trame précédente.
   2. Cliquez sur la souris de test dansla première image. Utilisez l'analyse 2.3.1 à identifier à la fois l'essai et relance la souris dans chaque image de la session III.
   3. Identifier les cadres en session III dans laquelle une souris approches socialement l'autre. Remarque: le logiciel met en oeuvre cette étape en contrôlant automatiquement la distance entre la souris est inférieure à la distance typique d'interaction de souris (on utilise 2 cm).
   4. Lorsque le logiciel joue un court segment du film avec l'approche détectée à l'utilisateur, cliquez sur un bouton pour indiquer si cette approche se qualifie comme une approche sociale par la souris de test, évitement social par la souris de test, ou aucune.
      Remarque: l'étape 2.3.4 peut être automatisée si l'on sait que la souris est la souris de test. Puisque cette information se perd lorsque les souris deviennent trop proches les uns des autres (ou grimper sur le dessus de l'autre), et puisque nous avons pas encore trouvé un moyen d'étiqueter les souris d'une manière qui peut être détectée de manière fiable par notre logiciel et ne pas d'incidence sur leur comportement, nous sommes revenus àclassification manuelle pour le moment.
4. Pour évaluer les films transformés, film de charge en utilisant le bouton Charger.
   1. Cliquez sur Démarrer Session 1 pour afficher la première image de la session 1 (ou Démarrer Session 2 pour afficher la première image de la session 2).
   2. Cliquez sur Play / Stop pour jouer et arrêter les films.
      Remarque: Les films transformés affichent la souris avec la tête et la queue marquée avec des cercles de différentes couleurs. Toutes les mesures de sociabilité sont affichés sur l'écran et mis à jour que le film joue.
   3. Exporter des données sociabilités au format Excel en cliquant sur "Exporter".
   4. Cliquez sur "Data Compiler" pour compiler toutes les données de tous les films dans un dossier en un seul fichier excel.

Résultats

La figure 3 montre un cadre de couleur d'un film de comportement avec une cage vide. La souris n'a pas été introduit dans la cage encore. La position des tasses, (sociales et non sociales) et les limites du compartiment sont superposées. La trame de couleur de la cage vide est convertie en échelle de gris de 8 bits , comme illustré sur la figure 4 et utilisé comme trame de référence. Le cadre de référence est soustrait de chaque autre trame du film capturé.

...

Discussion

En combinant souris enregistrement vidéo et analyse automatique de film, nous avons créé une technique abordable, fiable criblage à haut débit.

La précision de l'analyse automatisée a été comparée avec les résultats de l'analyse manuelle pour plus de 100 films. Dans l'écrasante majorité des cadres (> 99%) des cadres, le nez de la souris est identifié avec une bonne précision. La plupart des (rares) misdetections ont aucun effet sur les mesures de sociabilité, de sorte que près de 80% des ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cage en plexiglas	Norva Plastics, Norfolk, VA	sur mesure Les	dimensions et la disposition décrites dans le manuscrit, peuvent être ajustées en fonction des besoins. Utilisez du plexiglas non réfléchissant pour faciliter le traitement de l’image
Tasses en fil de fer	Cuisine plus	315	Utilisez-en une pour loger la souris stimulus, une
caméra vidéo	vide SONY	HDR-PJ790	Peut être remplacé par n’importe quel appareil photo avec Spécifications comparables
OpenCV (Bibliothèque de traitement d’images)	Willow Garage	N/A N/A	Toute bibliothèque de traitement d’images moderne peut être utilisée.