Détermination Membrane Protein topologie utilisant la fluorescence protection protéase (FPP)

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour déterminer l’orientation et la topologie des protéines membranaires intégrales dans les cellules vivantes. Ce protocole simple repose sur la sensibilité sélective de la protéase des chimères entre la protéine d’intérêt et la GFP.

Résumé

La topologie et l’orientation correctes des protéines membranaires intégrales sont essentielles à leur bon fonctionnement, mais une telle information n’a pas été établie pour de nombreuses protéines membranaires. Une technique simple appelée protection par protéase par fluorescence (FPP) est présentée, qui permet de déterminer la topologie des protéines membranaires dans les cellules vivantes. Cette technique présente de nombreux avantages par rapport aux autres méthodes de détermination de la topologie des protéines, en ce sens qu’elle ne nécessite pas la disponibilité de plusieurs anticorps contre divers domaines de la protéine membranaire, ne nécessite pas de grandes quantités de protéines et peut être réalisée sur des cellules vivantes. La méthode FPP utilise les actions spatialement confinées des protéases sur la dégradation des protéines membranaires marquées à la protéine fluorescente verte (GFP) pour déterminer leur topologie et leur orientation membranaires. Cette approche simple est applicable à une grande variété de types de cellules et peut être utilisée pour déterminer l’orientation des protéines membranaires dans divers organites subcellulaires tels que les mitochondries, le Golgi, le réticulum endoplasmique et les composants du système endosomal/recyclage. Les protéines membranaires, marquées sur les extrémités N-terminales ou C-terminales avec une fusion GFP, sont exprimées dans une cellule d’intérêt, qui est soumise à une perméabilisation sélective à l’aide de la digitonine détergente. La digoninine a la capacité de perméabiliser la membrane plasmique, tout en laissant les organites intracellulaires intacts. Les fractions GFP exposées au cytosol peuvent être dégradées de manière sélective par l’application de protéase, tandis que les fractions GFP présentes dans la lumière des organites sont protégées de la protéase et restent intactes. Le dosage FPP est simple et les résultats peuvent être obtenus rapidement.

Introduction

Les membranes de plasma, ainsi que les nombreuses membranes intracellulaires, servent de barrières séparant deux compartiments aqueux. Dans le cas de la membrane plasmique, la séparation entre l'extérieur et l'intérieur de la cellule; pour organites intracellulaires elle est comprise entre le cytoplasme et la lumière des organites. Par exemple, la membrane du réticulum endoplasmique (RE) sépare un environnement oxydant dans la lumière du RE à partir d'un environnement en réduisant ^une cytosolique. Les protéines membranaires sont synthétisées sur les ribosomes ER-associé, et d'atteindre leur topologie finale dans la membrane du RE ^2.

Protocole

1. Génération et validation des chimères de protéine fluorescente

1. Ajouter protéine fluorescente verte (GFP) à l'extrémité amino ou carboxy-terminales de la protéine d'intérêt en utilisant des stratégies d'ADN recombinant ^13.
   REMARQUE: Bien que nous ayons utilisé GFP largement, d'autres variantes telles que la protéine fluorescente cyan (CFP), la protéine fluorescente jaune (YFP), DsRed et mCherry peuvent être utilisés. L'amélioration de l'efficacité fluorophore pliage, la luminosité et photostabilité sont constamment faits, et les enquêteurs devraient se prévaloir des dernières constructions de génération.
   1. ....

Résultats

Plasma Membrane perméabilisation

Efficient perméabilisation de la membrane plasmique est déterminée par l'utilisation de protéines fluorescentes solubles (par exemple, GFP, DsRed) (étape 4). Ces protéines, lorsqu'elle est exprimée dans des cellules, sont libres de diffuser dans le cytosol, et sont perdus lors de la membrane plasmique est perméabilisées à l'aide de la digitonine (figure 2). Une disparition complète du signal fluorescent doit avoi.......

Discussion

L'orientation correcte et la topologie des protéines de la membrane sont essentielles pour leur bon fonctionnement. Malgré l'importance de comprendre protéine membranaire topologie, il ya beaucoup de protéines pour lesquelles ces données sont complètement défaut. FPP fournit un moyen facile et efficace de détermination de protéine membranaire topologie, et qui peut être effectuée par la plupart des laboratoires. L'approche FPP offre des avantages significatifs par rapport aux méthodes précédentes pour déterm.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Digitonin	Calbiochem	300410
Proteinase K	Sigma	P2308
Trypsin	Sigma	T3924
Cav1-GFP	Addgene	44433
pAcGFP-1 Golgi	Clontech	632464
Polylysine	Sigma	P4707
Média de montage	Dako	cS704