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Article de méthode

Chitosane / ARN interférant nanoparticules Mediated Gene Silencing dans la maladie vectorielle larves de moustiques

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DOI :

10.3791/52523

⸱

25 mars 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biology, Kansas State University, 2Department of Medical and Molecular Genetics, Indiana University School of Medicine, 3Eck Institute for Global Health, University of Notre Dame, 4Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 5Department of Entomology, Kansas State University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons ici une procédure pour inhiber la fonction des gènes chez les moustiques vecteurs de la maladie grâce à l'utilisation de chitosane / interférer nanoparticules d'ARN qui sont ingérés par les larves.

Résumé

moustiques vecteurs infligent des souffrances plus humain que ne importe quel autre organisme - et tuent plus d'un million de personnes chaque année. Les projets sur le génome de moustiques ont facilité la recherche dans de nouvelles facettes de la biologie des moustiques, y compris les études génétiques fonctionnels dans le principal vecteur africaine du paludisme Anopheles gambiae et de la dengue et le vecteur de la fièvre jaune Aedes aegypti. ARN de (RNAi-) le silençage génique médiation a été utilisée pour cibler des gènes d'intérêt dans ces deux espèces de moustiques vecteurs de maladies. Ici, nous décrivons une procédure pour la préparation de chitosane / ARN interférant nanoparticules qui sont combinés avec de la nourriture et ingérés par les larves. Ceci, à haut débit techniquement simple et relativement peu coûteux méthodologie, qui est compatible avec de longs ARN double brin (ARNdb) ou de petits ARN interférents (siARN) de molécules, a été utilisé pour le knock-down réussi d'un certain nombre de différents gènes dans A. gambiae et A. aegyptilarves. Après tétées larvaires, démontable, qui est vérifiée par qRT-PCR ou hybridation in situ, peuvent persister au moins jusqu'à la fin du stade de pupe. Cette méthode peut se appliquer à une grande variété de moustique et d'autres espèces d'insectes, y compris les parasites agricoles, ainsi que d'autres organismes non-modèles. En plus de son utilité dans le laboratoire de recherche, à l'avenir, le chitosane, un polymère peu coûteux, non toxique et biodégradable, susceptibles d'être utilisés dans le domaine.

Introduction

moustiques vecteurs de l'alimentation sanguine des genres anophèles et Aedine transmettent agents responsables de plusieurs des pires fléaux de l'humanité pathogènes. On estime que 3,4 milliards de personnes sont à risque de contracter le paludisme, qui est responsable de plus d'un demi-million de décès chaque année dans le monde entier. les résultats de la lutte contre le paludisme de l'infection par Plasmodium sp., des parasites qui sont transmis à l'homme par les piqûres de moustiques infectés du genre Anopheles, y compris le principal vecteur africain Anopheles gambiae ( http://www.who.int/topics/malaria/en/ , 2014) 1. Aedes aegypti est le moustique vecteur principal de virus de la dengue, qui provoque de la fièvre de la dengue, une maladie fébrile non spécifique qui est l'arbovirose la plus répandue et importante dans le monde. virus de la dengue est actuellement une menace pour> 2,5 milliards de personnes dans les tropiques, avec une façon fortuite annuelleCE d'environ 50 millions de cas résultant en ~ 24 000 décès par an ( http://www.cdc.gov/dengue/ , 2014) 2. Malgré l'impact mondial dévastateur de maladies transmises par les moustiques sur la santé humaine, des moyens efficaces de prévention et de traitement de ces maladies font défaut. lutte contre les moustiques est actuellement la meilleure méthode de prévention de la maladie.

Le potentiel de lutte contre les maladies transmises par les arthropodes par la manipulation génétique des insectes vecteurs a été reconnue depuis plus de quatre décennies 3. Souches transgéniques de A. aegypti conçu pour avoir un phénotype spécifique de voler-femme répressible ont récemment fait la possibilité d'utiliser des stratégies de lutte antivectorielle transgéniques une réalité 4-6. Ces progrès ont contesté les chercheurs à identifier les cibles génétiques nouvelles pour la lutte antivectorielle et des moyens supplémentaires de manipuler la fonction des gènes chez les moustiques vecteurs. Altération de l'expression des gènes ddéveloppement ors, comme ce était le cas chez les moustiques femelles de 4-voler, peut promouvoir l'élucidation des stratégies de lutte antivectorielle nouveaux. Cependant, en grande partie en raison de problèmes techniques, les fonctions de très peu de gènes ont été caractérisées au cours du développement de A. gambiae, A. aegypti, ou d'autres espèces de moustiques.

Depuis sa découverte en C. elegans 7, l'ARN interférence (ARNi), qui est conservé chez les animaux, les plantes et les micro-organismes, a été largement utilisé pour des études génétiques fonctionnelles dans une grande variété d'organismes, y compris les insectes 8,9. La voie ARNi est initiée par Dicer, qui clive à long ARN double brin en courts 20-25 siRNA nucléotidiques de long qui fonctionnent comme des ARN interférents séquence-spécifique. gènes de silence siRNA qui sont complémentaires dans l'ordre par la promotion de chiffre d'affaires de la transcription, le clivage et la perturbation de la traduction 9. Longues molécules ARN double brin (typiquement 300-600 pb) ou personnalisés siRNA ciblant un particulièremenr séquence peut être utilisée dans le laboratoire de recherche pour faire taire ne importe quel gène d'intérêt. En gérant lorsque ARN interférent est livré, les chercheurs peuvent contrôler l'heure à laquelle silençage génique initiés. Cet avantage est utile car elle peut être utilisée pour surmonter des défis tels que la létalité de développement ou de stérilité, ce qui peut entraver la production et l'entretien des souches portant des mutations héréditaires, un processus coûteux et de main-d'œuvre qui ne est pas encore disponible dans toutes les espèces d'insectes. Bien que le degré de silençage génique par ARNi peut varier de gène à gène, un tissu à tissu, et un animal à l'ARNi est largement utilisé pour l'analyse fonctionnelle des gènes dans les moustiques et autres insectes 8,9.

Trois stratégies d'interférence de livraison d'ARN ont été utilisés dans les moustiques: micro-injection, l'application trempage / topique, et ingestion. Pour une histoire détaillée et une comparaison de l'utilisation de ces trois techniques chez les insectes, se il vous plaît se référer à Yu et al 8. We ont utilisé avec succès la micro-injection 10 comme un moyen de fournir des siRNA pour cibler les gènes du développement chez A. aegypti embryons, larves, pupes et 11-14. Cependant, cette stratégie de prestation de main-d'œuvre exige à la fois une installation de micro-injection et une main habile. En outre, la micro-injection est stressant pour l'organisme, un facteur de confusion, en particulier lorsque phénotypes comportementaux seront évalués. Enfin, la livraison de micro-injection ne peut pas être étendu au domaine de la lutte antivectorielle. Comme alternative, le trempage l'organisme en interférant solution d'ARN est également devenu un moyen populaire d'induire le silençage génique, car il est pratique et nécessite peu d'équipement ou la main-d'œuvre. Le trempage a surtout été appliquée dans la lignée cellulaire d'insectes étudie 8, mais dans une étude récente, knockdown a été atteint en A. larves de aegypti immergé dans une solution de 15 l'ARN double brin, où les animaux semblaient être ingéré. Cependant, les études portant sur l'analyse de plusieurs experimentagroupes de L ou phénotypes, le trempage est assez coûteux. Lopez-Martinez et al. 16 décrit réhydratation entraîné ARNi, une nouvelle approche pour la livraison de l'ARN interférant qui implique la déshydratation dans une solution saline et la réhydratation avec une seule goutte d'eau contenant de l'ARN interférant. Cette approche ne coupe les coûts associés à l'immersion de l'animal entier, mais est plus cher que la micro-injection et peut être limitée dans son application aux espèces qui peuvent tolérer fortes pressions osmotiques. En outre, il est difficile d'imaginer comment l'immersion ou la méthode d'immersion / de réhydratation de déshydratation pourraient être adaptées pour la lutte antivectorielle dans le domaine. Pour ces raisons, pour les études post-embryonnaires, la livraison des ARN interférant avec de la nourriture ingérée est une stratégie alternative viable.

Bien que des stratégies fondées sur l'ingestion-ne fonctionnent pas chez toutes les espèces d'insectes, peut-être surtout Drosophila melanogaster, l'administration orale d'ARN interférents mélangé avec de la nourriture a favorisé si géniquelencing dans une variété d'insectes 8,17, y compris A. aegypti adultes 18. Nous avons décrit des nanoparticules de chitosan à médiation par ARNi dans A. gambiae larves 19 et ont appliqué avec succès cette approche pour la réduction de l'expression génique dans A. aegypti larves 20,21. Ici, la méthodologie pour cette procédure ARNi, qui consiste à piéger des ARN interférents par le chitosane de polymère, est détaillée. Chitosan / ARN interférents nanoparticules sont formées par auto-assemblage de polycations avec des ARN interférent par les forces électrostatiques entre les charges positives des groupes amino dans le chitosane et les charges négatives portées par les groupes phosphate sur le squelette de 19 l'ARN interférent. La procédure décrite est compatible avec les molécules d'ARNdb longs (ci-après dénommée ARN double brin) ou double brin siRNA (ci-après dénommé siRNA). Après la synthèse, le chitosane / interférents nanoparticules d'ARN sont mélangés avec de la nourriture des larves et livrés àlarves à l'ingestion. Cette méthodologie est relativement peu coûteux, nécessite peu de matériel et la main-d'œuvre 19, et facilite l'analyse à haut débit de plusieurs phénotypes, incluant l'analyse des comportements 20,21. Cette méthode, qui peut être adaptée pour les études d'inactivation de gène dans d'autres insectes, y compris d'autres vecteurs de maladies et les insectes nuisibles agricoles, pourrait être utilisée pour le silençage génique dans une variété d'autres espèces animales. En outre, le chitosane, un polymère peu coûteux, non toxique et biodégradable 22, pourrait être utilisée dans le domaine de lutte contre les moustiques spécifique de l'espèce.

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Protocole

1. Mosquito espèces et l'élevage

  1. Maintenir A. gambiae G3 et A. souches aegypti Liverpool IB12 (utilisés dans les études représentatives ci-dessous) ou d'autres souches d'intérêt conformément à la pratique de laboratoire standard ou comme décrit précédemment 23,24.

2. ARNdb et siRNA Conception et production

  1. Concevoir des amorces pour construire des modèles de longs ARNdb spécifiques du gène d'intérêt. Utilisez l'outil E-ARNi 25. Produire ARNdb selon la méthode de choix ou 19 comme décrit précédemment.
    1. Pour un témoin négatif, 19 synthétiser l'ARN double brin correspondant à la séquence de la protéine fluorescente verte (GFP), la β-galactosidase (β-gal) ou un autre gène non exprimé chez les moustiques. Si on le souhaite, 19 l'ARNdb utilisé pour générer les résultats représentatifs sont résumées ci-dessous peut être utilisé comme témoin positif. Magasin ARNdb dissous dans l'eau sans RNAse à -80 °; C jusqu'à utilisation.
  2. Alternativement, la conception siRNA spécifique du gène selon la pratique de laboratoire standard ou comme décrit précédemment 10. Brouiller la séquence d'un effet de choc pour concevoir siRNA siRNA contrôle négatif qui ne correspond pas à ne importe quel gène de moustique. Achetez les siRNA personnalisés, qui sont disponibles à travers un certain nombre de vendeurs de bonne réputation.
    1. Si on le souhaite, des siRNA 20,21 utilisée pour obtenir des résultats représentatifs sont résumées ci-dessous peuvent être utilisés comme témoins positifs. Magasin siRNA dissous dans l'eau sans RNase à -80 ° C jusqu'à utilisation.

3. Préparation de chitosane / ARN interférent nanoparticules

  1. Recueillir le sulfate de sodium 100 mM RT pré-fabriqué (100 mM de Na 2 SO 4 dans H 2 O déminéralisée) et de l'acétate de sodium 0,1 M (0,1 M NaCl 2 H 3 O 2 -0,1 M d'acide acétique, pH 4,5 dans désionisée H 2 O) tampons.
  2. Dissoudre chitosane (≥75%désacétylée) dans du tampon acétate de sodium 0,1 M pour faire 0,02% (p / v) de solution de travail et maintenir la solution à la température ambiante avant utilisation.
  3. Dissoudre ARNdb ou siRNA dans 50 ul de H 2 O déminéralisée et l'ajouter au tampon de sulfate de sodium 100 mM pour obtenir une solution de 100 ul de 32 ug d'ARN double brin / siRNA pour 100 ul de sulfate de sodium à 50 mM.
  4. Ajouter 100 ul de solution de chitosane dans la solution ARNdb / siRNA, puis chauffer le mélange dans un bain d'eau à 55 ° C pendant 1 min. Mettre en place un contrôle par addition de 100 ul de sulfate de sodium à 50 mM à 100 pi de solution de chitosane et suivre la même procédure.
  5. Mélanger les solutions immédiatement pendant 30 secondes au vortex à grande vitesse à la température ambiante pour faciliter la formation de nanoparticules.
  6. Centrifuger le mélange à 13 000 xg pendant 10 min à température ambiante, temps au bout duquel une pastille doit être visible. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml. Air-sécher le culot pour ≈10 min à température ambiante avant de l'utiliser pour préparer la nourriture de moustique.
  7. Mesure la concentration de l'ARN double brin / siRNA dans le surnageant en utilisant le surnageant de la commande (voir 3.5) comme un blanc pour calculer le montant total de l'ARN double brin / siRNA qui restait dans le surnageant. Utiliser la différence entre les montants de départ de l'ARN double brin / siRNA et les montants restants dans les surnageants pour calculer le pourcentage d'ARNdb / siRNA piégé dans les nanoparticules. Cette efficacité de chargement est normalement plus de 90%.
  8. Répétez la même procédure si plus de nanoparticules sont nécessaires. Utiliser immédiatement les nanoparticules séchées. L'impact de l'entreposage frigorifique des particules avant l'utilisation n'a pas été évaluée.

4. Préparation des aliments contenant du chitosane Mosquito / ARN interférent nanoparticules

  1. Préparer 1 ml d'une solution d'agarose à 2% (p / v) dans de l'eau déminéralisée, faire fondre l'agarose, et de garder solution d'agarose fondu dans un bain de 55 ° C de l'eau avant utilisation.
  2. Mélangez les flocons de nourriture pour les poissons (47% de protéines brutes, min. Matières grasses brutes 10%, max. Cellulose brute de 3%) et la levure sèche à unerapport de 2: 1 (p / p). Broyer le mélange à de petites particules avec un mortier et un pilon (passer à travers n ° 50 USA tamis standard). Utilisez la nourriture au sol, qui devrait être de couleur brunâtre, soit immédiatement, soit le stocker dans un récipient étanche à 4 ° C pendant plusieurs semaines.
  3. Dans un tube de 1,5 ml, mélanger 6 mg de nourriture au sol avec les nanoparticules séchées de la section 3.7 avec un cure-dent.
  4. Ajouter 30 ul d'une solution à 2% de pré-gel d'agarose fondu au mélange alimentaire nanoparticules; remuer immédiatement et abondamment à l'aide d'une pointe de cure-dent ou pipette.
  5. Utiliser le gel contenant de la nourriture et des nanoparticules pour alimenter les larves de moustiques immédiatement. En variante, une fois que le gel est complètement solidifié à la température ambiante, le gel stocker à 4 ° C et en utilisant le lendemain, ou à -80 ° C pour une utilisation ultérieure.

5. Nourrir larves de moustiques avec les aliments contenant du chitosane / ARN interférent nanoparticules

  1. Alimentation A. gambiae larves de moustiques:
    1. Suppression d'un SIngle granulés de gel du tube de 1,5 ml en utilisant un cure-dent et le couper en six tranches égales en utilisant une lame de rasoir propre ou un cure-dent.
    2. 20 Transfert de troisième stade larvaire dans une boîte de Petri de 500 ml contenant 100 ml d'eau désionisée.
    3. Nourrir les larves de moustiques en ajoutant une tranche de la pastille de gel (finement haché en petits morceaux) par boîte de Pétri une fois par jour pendant quatre jours. Veillez à respecter les larves se nourrissent de la pastille, qui devrait être considérablement réduite en taille ou complètement absent le lendemain. Après un temps, les moustiques se développeront en fin de quatrième stade larvaire.
    4. Enregistrez les modifications phénotypiques visibles pendant l'expérience. Examiner les niveaux de transcription et d'autres changements phénotypiques comme indiqué dans l'article 6 à la fin de la période de quatre jours.
  2. Alimentation A. aegypti larves de moustiques:
    1. Couper la pastille de gel en tranches égales 6 en utilisant une lame de rasoir propre ou cure-dent.
    2. Placez 50 ans synchronisé 24 heures après l'éclosion des œufs fipremier stade larvaire dans une boîte de Pétri en ≈40 ml d'eau déminéralisée.
    3. Les larves se nourrissent une tranche par boîte de Pétri pendant 4 heures / jour, puis de transférer les larves de retour à l'alimentation des larves régulière de 2: 1 sol flocons de nourriture pour les poissons et la levure sèche pour le reste de la journée. Répéter l'opération tous les jours pendant les quatre stades larvaires.
    4. Examiner les niveaux de transcription et d'autres changements phénotypiques comme indiqué dans l'article 6 sur les points souhaités de temps de développement.

6. Confirmation de Gene Knockdown

  1. Transcription relative quantification par qRT-PCR dans A. aegypti et A. larves gambiae.
    1. Effectuer et analyser des essais qRT-PCR avec trois répétitions biologiques sur au moins 10 commande groupée vs larves expérimentale comme décrit 11,19,20, ou selon la procédure de laboratoire standard. Les résultats représentatifs sont incluses ci-dessous.
    2. Pour l'analyse d'une partie notamment le type de tissu / corps (ie., Le cerveau ou antenne), perform qRT-PCR comme décrit dans 6.1.1 dissection suivante pour récupérer le tissu d'intérêt (par exemple, voir Mysore et al. 21).
  2. Confirmation de l'effet de choc par hybridation in situ
    1. Synthétiser antisens digoxygénine marqué et le sens ribosondes de contrôle conformément à la pratique de laboratoire standard ou comme décrit 26.
    2. Exécuter une hybridation in situ par le protocole Haugen et al. 27 pour la confirmation d'effet de choc, comme décrit précédemment dans 11,20 et discuté dans la section des résultats représentatifs ci-dessous.
  3. Confirmation de l'effet de choc par immunohistochimie
    1. Si des anticorps contre le produit protéique du gène ciblé sont disponibles, effectuer l'immunohistochimie comme décrit précédemment 28, ce qui facilite l'identification des personnes ayant les plus grands niveaux de knock-down pour l'analyse du phénotype 20 comme illustré dans la representative section des résultats ci-dessous.

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Résultats

A. gambiae:

Des nanoparticules de chitosan / ARNdb sont formées grâce à l'interaction électrostatique entre les groupes amino du chitosane et les groupements phosphate de l'ARN double brin. L'efficacité de l'incorporation dans l'ARN double brin nanoparticules est généralement supérieure à 90% telle que mesurée par l'appauvrissement de l'ARN double brin à partir de la solution. Atomiques images de microscopie de force montrent que le...

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Discussion

Le / interférer méthodologie de nanoparticules d'ARN de chitosane décrit ici a été utilisé pour cibler efficacement les gènes au cours du développement larvaire dans A. gambiae (figures 2, 3) et A. aegypti (figures 4, 5, 6 et aux tableaux 1, 2). Des nanoparticules de chitosan peuvent être préparées avec soit longue ou siRNA ARN double brin, qui ont tous deux été utilisés avec succès dans les moustiques comme en témoignent les résultats représentatifs décrits ici. S...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Le financement de la station d’expérimentation agricole du Kansas et du K-State Arthropod Genomics Center à KYZ a soutenu le développement original du silençage génique médié par le chitosan/dsRNA chez A. gambiae19. Les travaux sur A. gambiae décrits ici ont été soutenus en partie par le R01-AI095842 du NIH/NIAID à KM. Le développement du silençage génique médié par le chitosan/siRNA chez A. aegypti20,21 a été soutenu par le NIH/NIAID Award R01-AI081795 à MDS. Le contenu de cette étude relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les points de vue officiels du NIH.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
RaininPR20de 0,02 mlpour la remise en suspension d’ARN interférent
Pipette RaininPR2000,2 mlpour la remise en suspension d’ARN interférent et la préparation d’ARN/nanoparticules interférents
Tube gradué de 0,5 ml.Fischer Scientific05-408-120pour l’aliquotage de l’ARN interférent en suspension
1 ml pipetteRaininPR1000pour la remise en suspension de l’ARN interférent et la préparation d’ARN/nanoparticules interférents
1,5 ml tube gradué.Fischer Scientific05-408-046pour la préparation d’ARN/nanoparticules interférentes
1M Acétate de sodium, pH 4,5TEKnovaS0299pour préparer un tampon d’acétate
de sodium Acide acétique, AIRSTAR. ACS, USP, FCC GradeBDHVWR BDH3092-500MLPpour préparer le tampon d’acétate de sodium
Agarose Genetic Technology GradeMP Biomedicals LLC.800668pour enrober d’ARN/nanoparticules interférents préparés
CentrifugeuseEppendorf AG5415Dpour granuler ARN/nanoparticules interférents
Chitosane, à partir de carapaces de crevettesSigma-AldrichC3646-25Gà combiner avec de l’ARN interférent pour la préparation d’ARN/nanoparticules interférents
Levure sècheUniversal Food CorpNApour préparer de la nourriture pour larves de moustiques avec de l’ARN interférent/ nanoparticules
Outil E-RNAiCentre allemand de recherche sur le cancerNApour la conception de l’ARNdb ; nourriture pour poissons rouges http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//
WardleyGoldfish FLAKE FOODpour préparer de la nourriture pour larves de moustiques avec des ARN/nanoparticules interférents
Bain-marie chauffé ThermoScientific51221048pour chauffer les ARN/nanoparticules interférents à 55oC
Glacenon applicablene s’applique pas à ladécongélation de l’ARN interférent et à la préparation d’ARN/nanoparticules
[en-tête]
Seau à glaceFisher Scientific02-591-44pour le stockage de la glace utilisée pendant la procédure poudre de
foieMP Biomedicals LLC.900396pour nourrir les larves de moustiques après un traitement ARN/nanoparticules interférents
Four à micro-ondesUne variété de fournisseursnon applicablespour préparer une solution d’agarose à 2 %
pétride (100 x 15 mm)Fischer Scientific875713chambre d’alimentation en ARN/nanoparticules interférents pour les larves
PH-mètreMettler ToledoS220pour la préparation de tampons
Lame de rasoirFischer Scientific12-640pour diviser la pastille d’ARN/nanoparticules interférente pour l’alimentation
siRNAThermo Scientific/Dharmaconcustompour la préparation de siRNA/nanoparticules
Sodium Sulfate, anhydre (Na2SO4)BDH/distribué par VWRVWR BDH0302-500Gpour préparer une solution de sulfate de sodium de 50 mM dans laquelle l’ARN interférent sera remise en suspension
ThermomètreVWR61066-046pour mesurer la température du bain-marie
Picsà dents VWR470146-908pour agiter pendant la préparation et la coupe des aliments ARN/nanoparticules interférentes Gel de préparation et de coupe des aliments
Congélateur ultra-basUne variété de fournisseursnon applicablespour le stockage des aliquotes d’ARN interférents et des ARN/nanoparticules interférents à -80oC
Mélangeur vortexFischer Scientific02-216-108pour la préparation de chitosane/ARN interférent
Poids papierFischer ScientificNC9798735pour diviser l’ARN/nanoparticules interférents pour l’alimentation
Pipette de, interférents

Références

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