Nous décrivons ici une procédure pour inhiber la fonction des gènes chez les moustiques vecteurs de la maladie grâce à l'utilisation de chitosane / interférer nanoparticules d'ARN qui sont ingérés par les larves.
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Article de méthode
Chitosane / ARN interférant nanoparticules Mediated Gene Silencing dans la maladie vectorielle larves de moustiques
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
moustiques vecteurs infligent des souffrances plus humain que ne importe quel autre organisme - et tuent plus d'un million de personnes chaque année. Les projets sur le génome de moustiques ont facilité la recherche dans de nouvelles facettes de la biologie des moustiques, y compris les études génétiques fonctionnels dans le principal vecteur africaine du paludisme Anopheles gambiae et de la dengue et le vecteur de la fièvre jaune Aedes aegypti. ARN de (RNAi-) le silençage génique médiation a été utilisée pour cibler des gènes d'intérêt dans ces deux espèces de moustiques vecteurs de maladies. Ici, nous décrivons une procédure pour la préparation de chitosane / ARN interférant nanoparticules qui sont combinés avec de la nourriture et ingérés par les larves. Ceci, à haut débit techniquement simple et relativement peu coûteux méthodologie, qui est compatible avec de longs ARN double brin (ARNdb) ou de petits ARN interférents (siARN) de molécules, a été utilisé pour le knock-down réussi d'un certain nombre de différents gènes dans A. gambiae et A. aegyptilarves. Après tétées larvaires, démontable, qui est vérifiée par qRT-PCR ou hybridation in situ, peuvent persister au moins jusqu'à la fin du stade de pupe. Cette méthode peut se appliquer à une grande variété de moustique et d'autres espèces d'insectes, y compris les parasites agricoles, ainsi que d'autres organismes non-modèles. En plus de son utilité dans le laboratoire de recherche, à l'avenir, le chitosane, un polymère peu coûteux, non toxique et biodégradable, susceptibles d'être utilisés dans le domaine.
Introduction
moustiques vecteurs de l'alimentation sanguine des genres anophèles et Aedine transmettent agents responsables de plusieurs des pires fléaux de l'humanité pathogènes. On estime que 3,4 milliards de personnes sont à risque de contracter le paludisme, qui est responsable de plus d'un demi-million de décès chaque année dans le monde entier. les résultats de la lutte contre le paludisme de l'infection par Plasmodium sp., des parasites qui sont transmis à l'homme par les piqûres de moustiques infectés du genre Anopheles, y compris le principal vecteur africain Anopheles gambiae (
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Protocole
1. Mosquito espèces et l'élevage
- Maintenir A. gambiae G3 et A. souches aegypti Liverpool IB12 (utilisés dans les études représentatives ci-dessous) ou d'autres souches d'intérêt conformément à la pratique de laboratoire standard ou comme décrit précédemment 23,24.
2. ARNdb et siRNA Conception et production
- Concevoir des amorces pour construire des modèles de longs ARNdb spécifiques du gène d'intérêt. Utilisez l'outil E-ARNi 25. Produire ARNdb selon la méthode de choix ou 19 comme décrit précédemment.
- Pour un témoin négatif,....
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Résultats
A. gambiae:
Des nanoparticules de chitosan / ARNdb sont formées grâce à l'interaction électrostatique entre les groupes amino du chitosane et les groupements phosphate de l'ARN double brin. L'efficacité de l'incorporation dans l'ARN double brin nanoparticules est généralement supérieure à 90% telle que mesurée par l'appauvrissement de l'ARN double brin à partir de la solution. Atomiques images de microscopie de force montrent que le.......
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Discussion
Le / interférer méthodologie de nanoparticules d'ARN de chitosane décrit ici a été utilisé pour cibler efficacement les gènes au cours du développement larvaire dans A. gambiae (figures 2, 3) et A. aegypti (figures 4, 5, 6 et aux tableaux 1, 2). Des nanoparticules de chitosan peuvent être préparées avec soit longue ou siRNA ARN double brin, qui ont tous deux été utilisés avec succès dans les moustiques comme en témoignent les résultats représentatifs décrits ici. S.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Le financement de la station d’expérimentation agricole du Kansas et du K-State Arthropod Genomics Center à KYZ a soutenu le développement original du silençage génique médié par le chitosan/dsRNA chez A. gambiae19. Les travaux sur A. gambiae décrits ici ont été soutenus en partie par le R01-AI095842 du NIH/NIAID à KM. Le développement du silençage génique médié par le chitosan/siRNA chez A. aegypti20,21 a été soutenu par le NIH/NIAID Award R01-AI081795 à MDS. Le contenu de cette étude relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les points de vue officiels du NIH.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Rainin | PR20 | de 0,02 ml | pour la remise en suspension d’ARN interférent |
| Pipette Rainin | PR200 | 0,2 ml | pour la remise en suspension d’ARN interférent et la préparation d’ARN/nanoparticules interférents |
| Tube gradué de 0,5 ml. | Fischer Scientific | 05-408-120 | pour l’aliquotage de l’ARN interférent en suspension |
| 1 ml pipette | Rainin | PR1000 | pour la remise en suspension de l’ARN interférent et la préparation d’ARN/nanoparticules interférents |
| 1,5 ml tube gradué. | Fischer Scientific | 05-408-046 | pour la préparation d’ARN/nanoparticules interférentes |
| 1M Acétate de sodium, pH 4,5 | TEKnova | S0299 | pour préparer un tampon d’acétate |
| de sodium Acide acétique, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade | BDH | VWR BDH3092-500MLP | pour préparer le tampon d’acétate de sodium |
| Agarose Genetic Technology Grade | MP Biomedicals LLC. | 800668 | pour enrober d’ARN/nanoparticules interférents préparés |
| Centrifugeuse | Eppendorf AG | 5415D | pour granuler ARN/nanoparticules interférents |
| Chitosane, à partir de carapaces de crevettes | Sigma-Aldrich | C3646-25G | à combiner avec de l’ARN interférent pour la préparation d’ARN/nanoparticules interférents |
| Levure sèche | Universal Food Corp | NA | pour préparer de la nourriture pour larves de moustiques avec de l’ARN interférent/ nanoparticules |
| Outil E-RNAi | Centre allemand de recherche sur le cancer | NA | pour la conception de l’ARNdb ; nourriture pour poissons rouges http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3// |
| Wardley | Goldfish FLAKE FOOD | pour préparer de la nourriture pour larves de moustiques avec des ARN/nanoparticules interférents | |
| Bain-marie chauffé Thermo | Scientific | 51221048 | pour chauffer les ARN/nanoparticules interférents à 55oC |
| Glace | non applicable | ne s’applique pas à la | décongélation de l’ARN interférent et à la préparation d’ARN/nanoparticules |
| [en-tête] | |||
| Seau à glace | Fisher Scientific | 02-591-44 | pour le stockage de la glace utilisée pendant la procédure poudre de |
| foie | MP Biomedicals LLC. | 900396 | pour nourrir les larves de moustiques après un traitement ARN/nanoparticules interférents |
| Four à micro-ondes | Une variété de fournisseurs | non applicables | pour préparer une solution d’agarose à 2 % |
| pétride (100 x 15 mm) | Fischer Scientific | 875713 | chambre d’alimentation en ARN/nanoparticules interférents pour les larves |
| PH-mètre | Mettler Toledo | S220 | pour la préparation de tampons |
| Lame de rasoir | Fischer Scientific | 12-640 | pour diviser la pastille d’ARN/nanoparticules interférente pour l’alimentation |
| siRNA | Thermo Scientific/Dharmacon | custom | pour la préparation de siRNA/nanoparticules |
| Sodium Sulfate, anhydre (Na2SO4) | BDH/distribué par VWR | VWR BDH0302-500G | pour préparer une solution de sulfate de sodium de 50 mM dans laquelle l’ARN interférent sera remise en suspension |
| Thermomètre | VWR | 61066-046 | pour mesurer la température du bain-marie |
| Pics | à dents VWR | 470146-908 | pour agiter pendant la préparation et la coupe des aliments ARN/nanoparticules interférentes Gel de préparation et de coupe des aliments |
| Congélateur ultra-bas | Une variété de fournisseurs | non applicables | pour le stockage des aliquotes d’ARN interférents et des ARN/nanoparticules interférents à -80oC |
| Mélangeur vortex | Fischer Scientific | 02-216-108 | pour la préparation de chitosane/ARN interférent |
| Poids papier | Fischer Scientific | NC9798735 | pour diviser l’ARN/nanoparticules interférents pour l’alimentation |
Références
- Malaria. , World Health Organization. http://www.who.int/topics/malaria/en (2014).
- Dengue. , Malaria Centers for Disease Control and Prevention. http://www.cdc.gov/dengue/ (2014).
- Knipling, E. F., et al. Genetic control of insects of public health importance. Bulletin of the World Health Organizat....
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Réimpressions et autorisations
