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Article de méthode

Utilisation de la souris des cellules tumorales mammaires pour enseigner Biologie Concepts de base: un module de laboratoire simple

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DOI :

10.3791/52528

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18 juin 2015

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1Department of Natural Sciences, Marymount Manhattan College

Dans cet article

Résumé

Un module de laboratoire réalisable pour les étudiants de premier cycle en biologie qui explore des concepts cellulaires et moléculaires avancés à l’aide de la culture de cellules animales est décrit. Les étudiants cultivent, caractérisent et manipulent un modèle de cellules cancéreuses du sein en les exposant à des agents de chimiothérapie. La viabilité cellulaire est mesurée par comptage cellulaire à l’aide d’une méthode standard et d’une méthode nouvelle.

Résumé

Les étudiants de premier cycle en biologie doivent apprendre, comprendre et appliquer une variété de concepts et de techniques de biologie cellulaire et moléculaire en préparation à des programmes biomédicaux, supérieurs et professionnels ou à des carrières en sciences. Pour y remédier, un module de laboratoire simple a été conçu pour enseigner les concepts de division cellulaire, de communication cellulaire et de cancer par l’application de techniques de culture cellulaire animale. Ici, la lignée cellulaire de la tumeur mammaire de souris (MMT) est utilisée pour modéliser le cancer du sein. Les étudiants apprennent à cultiver et à caractériser ces cellules animales en culture et à tester les effets des agents de chimiothérapie traditionnels et non traditionnels sur la prolifération cellulaire. Plus précisément, les étudiants déterminent la concentration cellulaire optimale pour le placage et la croissance des cellules, apprennent à préparer et à diluer des solutions médicamenteuses, à identifier la meilleure posologie et le meilleur traitement des agents antiprolifératifs et à déterminer le taux de mort cellulaire en réponse à divers traitements. Le module utilise à la fois une technique standard de comptage cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre et une nouvelle méthode de comptage cellulaire à l’aide d’un logiciel de microscopie. La procédure expérimentale se prête à une enquête ouverte, car les étudiants peuvent modifier des étapes critiques du protocole, y compris l’essai d’agents homéopathiques et de médicaments en vente libre. En bref, ce module de laboratoire exige que les étudiants utilisent le processus scientifique pour appliquer leurs connaissances du cycle cellulaire, des voies de signalisation cellulaires, du cancer et des modes de traitement, tout en développant un éventail de compétences de laboratoire, y compris la culture cellulaire et l’analyse de données expérimentales qui ne sont pas couramment enseignées dans les cours de premier cycle.

Introduction

Souvent, dans les cours de biologie générale de premier cycle, les sujets de la régulation du cycle cellulaire et le cancer sont abordées mais pas examinés en détail parce que la portée du contenu de ces cours laisse peu de temps pour la profondeur. En outre, les étudiants en biologie de premier cycle ne sont pas généralement exposés aux techniques de pointe associés à la culture de cellules animales. Pour aider les élèves à développer une compréhension plus profonde de ces concepts, tout en appliquant et en analysant ce qu'ils ont appris, une activité de laboratoire a été développé comme une modification de l'Institut Walter Reed de l'armée de recherche (WRAIR) a étendu l'activité du laboratoire 1. Le module de laboratoire utilise une stratégie expérimentale par étapes qui comprend les voies de signalisation cellulaire aberrante croissance et la caractérisation d'un modèle de cellule cancéreuse, le développement et l'exécution de méthodes de comptage des cellules, en établissant cours et les dosages de temps optimal pour le traitement de cellules avec des agents anti-prolifératifs, et l'identification . L'expérience permet également ouverte-ended enquête.

La plupart des techniques nécessaires à cette activité peut être accompli dans un laboratoire typique de biologie-enseignement. L'activité commence par les étudiants caractérisant la vitesse de la morphologie et de croissance de la lignée cellulaire de tumeur mammaire de souris (MMT), un modèle de cancer du sein humain 2. Le cancer du sein a été choisi comme le cancer du modèle en raison de sa prévalence dans la population, de la connaissance des étudiants des collèges d'âge, et les données disponibles répandues. La lignée cellulaire MMT a été spécialement choisie parce qu'elle est facile à obtenir, bien caractérisé, a un temps de doublement est court et facile à cultiver. En outre, les cellules MMT sont oestrogéno-dépendante qui est compatible avec la plupart des cancers du sein féminin. Les élèves identifient ensuite les voies de signalisation cellulaires aberrantes dans les cellules MMT en traitant les cellules avec des médicaments de chimiothérapie dont le mécanisme d'action est bien établie.Procédé concentration des médicaments et de la durée des traitements sont variés permettant aux étudiantspour évaluer l'effet de ces variables sur le taux de division cellulaire. Le dosage de cette activité clé est la détermination de la viabilité cellulaire, ce qui nécessite simplement comptage de cellules, en utilisant l'une des deux méthodes. Chaque méthode dépend des compétences de microscopie fortes. Les élèves déterminent la viabilité des cellules en utilisant une norme, méthode de hémocytomètre et une méthode de photomicroscopie roman et proposent. Selon leurs constatations, ils peuvent proposer et tester des modifications à l'activité. Les étudiants représentent alors leurs données et interpréter les résultats d'affiner leur hypothèse et concevoir de nouvelles stratégies expérimentales.

Cette activité de laboratoire est adapté pour les première année ou de niveau de deuxième année les étudiants se spécialisant dans les sciences biologiques. Il est condensé dans un module de laboratoire d'une semaine qui peut être complété dans une première année, la biologie générale ou la deuxième année, cellulaire / moléculaire cours de biologie. Les compétences nécessaires pour le bon achèvement de l'activité comprennent l'arithmétique de base et de l'algèbre, la familiarité avec un tableau de ccompétences de laboratoire de minerai (par exemple, le pipetage, solution de décisions, une technique stérile), l'analyse des données, la gestion de base de la microscopie optique et l'heure, ainsi que des connaissances de l'instructeur de la culture cellulaire et un tableur. Réactifs nécessaires comprennent un modèle de lignée cellulaire animale de cancer (par exemple, des cellules mammaires de souris de tumeurs, de TEM 2), des agents chimiothérapeutiques (par exemple, le tamoxifène, la curcumine, la metformine, et l'aspirine), trypan milieux de culture bleu et cellulaire (par exemple, de Eagle du milieu essentiel minimum ; EMEM) avec des suppléments appropriés (par exemple, des chevaux de donateurs et de sérum de veau foetal). Instruments nécessaires comprennent une lumière microscope inversé avec l'attachement appareil photo numérique, ordinateur, 100 mm et 24 plaques de culture de tissu, incubateur à CO 2 (ou équivalent), enceinte de sécurité biologique (BSC; Classe II), hémocytomètre, et le logiciel de microscopie numérique.

Il ya de bons exemples d'activités spécifiques de laboratoire qui reposent sur la culture de cellules animales à Teach étudiants de premier cycle sur les concepts de la biologie cellulaire 3. Cependant beaucoup exigent des fournitures ou des techniques qui ne sont pas facilement accessibles (par exemple, des isotopes radioactifs, des tissus d'animaux vivants, de l'équipement d'imagerie de pointe 1,4,5), décrivent les protocoles qui sont assez avancé (par exemple, approprié pour un cours 400 de niveau 6), ou exiger plusieurs semaines ou semestre projets longs 6,7. L'activité de laboratoire décrit ici est simple et peut être réalisée en une seule semaine avec des équipements de laboratoire commun.

En résumé, ce module de laboratoire introduit efficacement ou renforce les concepts de cycle cellulaire, voies de signalisation cellulaire et le cancer tout en enseignant les compétences de laboratoire de base et avancées, l'analyse des données expérimentales, la méthode de culture de cellules animales et le processus scientifique. Le module de laboratoire est simple et économiquement accessible et fournit à la fois la flexibilité et la possibilité pour les questions ouvertes. L'activité encourage la créativité de l'étudianten fournissant un modèle de stratégie expérimentale qui agit comme un guide, mais pas une recette. Plus important encore, les satisfait d'activité tous les domaines d'apprentissage de la taxonomie de Bloom 8 car elle nécessite la mémoire, la compréhension, l'application, l'analyse, l'évaluation et la création en engageant les élèves dans un processus qui les tire du manuel et dans le monde de la recherche scientifique.

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Protocole

Notes: conduite tous les travaux avec des cellules et des réactifs de culture cellulaire dans une armoire de biosécurité de classe II (BSC) 9. Cellules MMT sont classés comme la biosécurité de niveau I, car elles posent risque faible à modéré biologique. Appliquer les procédures de nettoyage et de décontamination appropriées pour le BSC entre les utilisations (par exemple, la lumière ultraviolette, 70% d'éthanol essuyer).

1. Cultiver les cellules MMT

  1. Cultiver les cellules dans 10 cm boîtes de culture de tissu contenant 10 ml de milieu nutritif riches qui se compose de Eagles Minimum Essential Medium (EMEM) additionné de sérum de 10% de fœtus bovin (FBS), 2 mM de glutamine et 1% antimycotique / antibiotique (10 unités de pénicilline , 100 ug de streptomycine, 0,25 pg amphotéricine B). Cultiver les cellules dans une chambre humidifiée à 5% de CO2, à 37 ° C. cellules des plaques à une densité de 3,6 x 10 6 cellules / cm 2 (voir comptage des cellules à l'étape 2).
  2. Remplacez la moitié des milieux de culture cellulaire avec un milieu frais toutes les 48 heures UNLess indication contraire. Vérifier la viabilité des cellules et la morphologie d'un examen avec un microscope optique à contraste de phase inversé.
    1. Remarque et caractériser les cellules pour la taille, la structure, la forme, l'organisation et nombre estimé à 100 sous - 200X. A cette densité, les cellules doivent apparaître dans un plan, non agglomérées au-dessus de l'autre et à proximité immédiate. Chaque cellule se compose d'un noyau sphérique épaisse avec de fines extensions, de ramifications, de longues expansion de celui-ci qui viennent à un point (voir Figure 1).
  3. Subdiviser les cellules lorsqu'elles atteignent une densité de cellules de 7,2 x 10 6 cellules / cm 2. Les cellules présentent un taux de doublement de 1,8 x 10 6 cellules / cm 2 par 24 heures. Désigner cellules Passage X (Px) pour désigner le nombre de fois qu'ils ont été divisés.
    1. À la génération 3 (après trois passages, P3), la récolte, le comte et la plaque les cellules sur une plaque de culture de 24 tissus et à une densité de 3,6 x 10 6 cellules / cm 2.
  4. Voir les cellules tous les jours et microphotographies numériques enregistrement. Remarque et décrire la morphologie des cellules (taille, forme, propriétés réfléchissantes de lumière). Déterminer le temps de doublement cellulaire en comptant les cellules régulièrement et de temps écoulé se rapportant le nombre de cellules.

2. Compter les cellules MMT

Remarque: Compter les cellules pour déterminer si les cellules doivent être repiquées, de mettre en place pour une expérience ou pour déterminer la viabilité cellulaire. Il existe deux méthodes présentées ici.

  1. Utilisation d'un hémocytomètre, une technique standard de compter les cellules.
    1. Obtenir un hémocytomètre lumineux en ligne, une solution à 0,2% de colorant bleu trypan, un microscope optique composé, tubes à essai stériles, pipettes et un compteur manuel de cellule.
    2. Sous le BSC, utiliser un pipette de 10 ml pour éliminer les cellules d'un plat de culture de tissu de 10 cm. Si les cellules sont cultivées sur une plaque à 24 puits en utilisant une pipette de 1 ml ou 1000 pi micropipette pour enlever les médias.
    3. Dessiner le média de la cellule dans la pipette, placer la pointe de la pipette contre le fond de la boîte et d'expulser les médias tout en faisant glisser la pointe de la pipette sur la plaque. Répétez 4 - 5 fois pour aider à déloger les cellules, dissocier touffes et conduire à un nombre de cellules plus précis.
    4. Placer la suspension de cellules résultante dans un tube stérile de 15 ml (1 ml ou micro centrifugeuse ou d'un autre petit tube en volume). Sinon, laissez les cellules dans la plaque de culture de tissus d'origine / puits.
    5. En vertu de la BSC, mélanger 10 ul de la suspension cellulaire avec 10 ul de la solution de bleu trypan (1: 1 ratio) dans une micro centrifugeuse non-stérile ou un autre petit tube en volume.
      Remarque: bleu Trypan est un colorant vital qui est pas absorbé par les cellules saines et viables. Lorsque les cellules sont endommagés ou morts, bleu trypan peuvent entrer dans la cellule permettant aux cellules mortes pour être comptées (aka teindre méthode d'exclusion). Par conséquent sous un microscope, les cellules mortes apparaissent violet foncé tandis que les cellules viables sont un brillant et de couleur claire.
    6. Incuberà température ambiante pendant 5 min.
    7. Placez la lamelle sur le hémocytomètre. Appliquer 10 pi du mélange de suspension bleu-cellule trypan dans la rainure. Voir l'hémocytomètre à 100 - 200X. Une grille quatre coin est apparente (voir Figure 2).
    8. Comptez le nombre de cellules viables (non colorées) par rapport aux cellules totales dans chaque zone quadrillée. La moyenne des quatre grilles et multiplier par 1 x 10 4 pour obtenir cellules / ml.
      1. Extrapoler le nombre total de cellules par boîte (ou cellules / cm 2). Utilisez ce numéro soit déterminer le volume correct de la suspension de cellules à utiliser pour semer une nouvelle plaque de culture de tissu à la densité désirée de 3,6 x 10 6 cellules / cm 2 ou déterminer le nombre total de cellules viables sur la plaque ou dans le puits.
        Remarque: Pour des indications supplémentaires sur l'utilisation d'un hémocytomètre, voir 10.
  2. Utilisez un logiciel et d'un appareil photo numérique pour compter les cellules viables.
    1. Obtenir un diGITAL caméra, son logiciel d'accompagnement, une solution de 0,4% de colorant bleu trypan, un microscope optique composé, tubes à essai stériles, pipettes et un ordinateur.
      Note: Un appareil photo numérique Moticam 2000 avec accompagnement Motic logiciel est employé ici. Tout appareil photo et un logiciel comparable devrait être suffisant. Assurez-vous que le logiciel de la caméra numérique a été étalonné à l'avance (selon le protocole du fabricant).
    2. Sous le BSC, utilisez un 1 ml pipette ou 1000 pi micropipette de retirer le support des cellules MMT qui poussent dans une boîte de culture de tissu à 24 puits. Laver les cellules adhérentes en appliquant doucement une petite quantité (environ 500 pi) de la non-complétée (ie, EMEM sans suppléments) du milieu frais à la plaque puis de le retirer. Appliquer 10 pi de 0,2% de bleu trypan (faite par dilution 1: 1 avec un-complétée EMEM) directement au bien.
    3. Incuber la plaque à température ambiante pendant 5 min.
    4. Voir la plaque sous le microscope à 100 - 200X wvec un appareil photo numérique fixé. Plate peut être lavé avec des médias non complémentés si coloration avec 2% de bleu trypan est trop sombre.
    5. Ouvrez le logiciel sur l'ordinateur d'un deuxième vérifier que le logiciel est calibré à l'objectif utilisé via l'onglet Paramètres. Une image de la FOV devrait apparaître.
    6. Sélectionnez la grille de l'onglet Mesurer. Une grille de carrés d'environ 0,005 cm de largeur apparaît. Sélectionnez Grille Infos pour confirmer la zone de chaque carré.
    7. Choisissez une zone spécifique de la grille pour compter les cellules (soit 5 places x 9 places). Sélectionnez Rectangle partir de l'onglet Mesure. Cliquez sur le coin d'un carré et faites glisser votre curseur pour englober les places de choix.
      Remarque: Une nuance de vert couvrira les places de choix et une boîte blanche apparaîtra dans le coin qui fournit la largeur, hauteur, surface, et le périmètre de la section de la grille choisie (voir Figure 3).
    8. Comptez le nombre de viabLe cellules au sein de la zone déterminée. Faites de même pour deux autres endroits dans le même puits ou d'une plaque en déplaçant la plaque sous le microscope.
    9. Assurez-vous que la zone mesurée est la même et le grossissement n'a pas changé. Calculer le nombre moyen de cellules viables au sein de la zone. Utilisation de la zone du puits (pour une plaque à 24 puits, une cupule a une superficie de 2 cm 2, pour une boîte de 100 mm de la zone est de 78,6 cm 2), extrapoler le nombre de cellules viables à partir de la zone délimitée de la grille pour le nombre total de cellules dans le puits (cellules / cm 2).

3. traiter des cellules MMT avec des agents anti-prolifératifs

  1. Préparer des solutions des agents anti-prolifératifs sélectionnés thérapeutiques (tamoxifène, la curcumine et metformine) et médicaments option, l'aspirine sous le BSC.
    1. Dissoudre la curcumine et du tamoxifène dans 100% d'éthanol pour générer une concentration stock de 27 mM. Dissoudre la metformine et de l'aspirine dans unsupplemented EMEM pour générer une concentration stock de 500 mm et 15 mm, respectivement.
  2. Établir une relation dose-réponse.
    1. Traiter cellules MMT avec les trois agents anti-prolifératifs thérapeutiques (tamoxifène, la curcumine et metformine) et en option la drogue (aspirine) à des concentrations variant de 96 heures afin de générer une courbe dose-réponse. Initialement administrer tous les médicaments à une gamme de concentrations fondées sur des rapports publiés 1,11-16 puis à des concentrations supérieures ou inférieures à celles publiées.
      Remarque: Une réponse à la dose détermine la concentration minimale d'un médicament nécessaire pour produire les résultats désirés. Ici, le résultat souhaité est une réduction de la prolifération cellulaire par rapport au contrôle.
      1. Pour le tamoxifène et la curcumine, utiliser des concentrations (et volumes correspondants) de 0,054 mm (1 pi), 0,108 mm (2 pi), 0,162 mm (3 pi) et 0,216 mm (4 pi).
      2. Pour la metformine, utiliser des concentrations (et volumes correspondants) de 2 mm (2 pi), 4 mm (4 pi), 6 mm (6 pi), 8 mm (8 pi) et 10 mM (10 pi).
      3. Pour l'aspirine, utiliser des concentrations (et volumes correspondants) de 0,030 mm (1 pi), 0,060 mm (2 pi), 0,099 mM (3,3 pi), 0,150 mm (5 pi), et 0,216 mM (6,7 pi).
    2. Diviser les cellules MMT de la boîte de 10 cm sur une plaque à 24 puits à une concentration de 3,6 x 10 6 cellules / cm 2. Déterminer la concentration cellulaire initiale par les deux méthodes de comptage cellulaire (étape 2). Appelez cette nouvelle plaque de 24 puits de cellules "Jour de Split".
    3. 24 heures après l'étalement des cellules, les cellules MMT traiter avec chacun des agents thérapeutiques anti-prolifératifs, le tamoxifène, la curcumine, la metformine et de l'aspirine, aux concentrations décrites à l'étape 3.2.1. Reportez-vous à ce que "jour 0".
      1. Comme chaque puits peut contenir un maximum de 500 pi de médias, utilisation micropipettes avec des pointes de micropipette stériles et une nouvelle pointe à chaque fois un nouveau puits est traitée pour éviter crRejoignez la contamination. Utilisez deux puits que les contrôles: cellules cultivées en l'absence de tout traitement médicamenteux (contrôle négatif) et les cellules cultivées en présence de 100% d'éthanol (de contrôle solvant).
    4. Produire des cellules et de ré-administrer des médicaments aux concentrations décrites lorsque les cellules sont nourris tous les jours (voir l'étape 1.2) pour 96 heures (jusqu'au Jour 4) Sur Jours 1 -. 4 du traitement, observer les cellules sous le microscope et compter en utilisant le procédé à l'étape 2.2 (voir figure 4).
    5. Répétez l'expérience au moins trois fois.
    6. Déterminer la concentration optimale de chaque médicament en représentant graphiquement la relation entre la viabilité des cellules et le dosage du médicament au cours de la durée de l'expérience (voir figure 5).
  3. Mettre en place un temps de parcours.
    1. Traiter cellules MMT avec les trois agents thérapeutiques anti-prolifératives (tamoxifène, la curcumine et metformine) à une concentration fixe pendant des périodes de temps variables. Utilisez la concentration optimale identifié à travers les expériences de dose-réponse (voir l'étape 3.2).
      1. Utilisez les concentrations suivantes: MM tamoxifène 0,216, la curcumine 0,216 mM et 10 mM metformine.
        Remarque: Une évolution dans le temps détermine la quantité de temps nécessaire pour produire un médicament pour son optimale résultat souhaité. Ici, le résultat souhaité est une réduction de la prolifération cellulaire par rapport au contrôle.
    2. Diviser les cellules MMT de la boîte de 10 cm sur une plaque à 24 puits à une concentration de 3,6 x 10 6 cellules / cm 2. Déterminer la concentration cellulaire initiale par les deux méthodes de comptage cellulaire (étape 2). Appelez cette nouvelle plaque de 24 puits de cellules "Jour de Split".
    3. 24 heures après l'étalement des cellules, traiter les cellules MMT avec chacun des agents thérapeutiques anti-prolifératifs, le tamoxifène, la curcumine, la metformine et de l'aspirine, les concentrations optimales identifiées à l'étape 3.2. Reportez-vous à ce que "jour 0".
      1. Comme chaque puits peut contenir un maximum de 500 pi de médias, nouse micropipettes avec des pointes de micropipette stériles et une nouvelle pointe à chaque fois un nouveau puits est traitée pour éviter la contamination croisée.
      2. Utilisez deux puits que les contrôles: cellules cultivées en l'absence de tout traitement médicamenteux (contrôle négatif) et les cellules cultivées en présence de 100% d'éthanol (de contrôle solvant).
  4. Produire des cellules et de ré-administrer des médicaments à la concentration choisie lorsque les cellules sont nourris tous les jours (voir l'étape 1.2) pour 96 heures (jusqu'au Jour 4). Sur Jours 1 - 4 de traitement, observer les cellules sous le microscope et compter en utilisant la méthode à l'étape 2.2 (voir Figure 4).
  5. Répétez l'expérience au moins trois fois.
  6. Déterminer le temps d'exposition optimal de cellules MMT à chaque médicament en traçant la relation entre la viabilité des cellules et de la longueur (durée) de traitement de la toxicomanie à la concentration choisie (voir Figure 6).

4. Le module Lab

Remarque: Ce qui suit est un jour 5calendrier de laboratoire pour le laboratoire module. Figure 7 est un organigramme de ce que le calendrier entraînerait dans les 5 jours. Pour cette activité doit être terminée en cinq jours, soit une évolution dans le temps ou une courbe dose-réponse est générée. Il n'y a pas suffisamment de temps pour générer les deux courbes. Une expérience de dose-réponse est décrite ci-dessous. Une expérience de décours temporel peut être facilement interchangé

  1. Divisez la classe en groupes: avoir un groupe d'établir une relation dose-réponse et l'autre bien sûr un temps de choisir une concentration dans le milieu de concentrations de réponse de dose proposées.
    1. Maintenir les cultures et les stocks de médicaments suffisants à des concentrations appropriées. Sauf indication contraire, effectuer tous les travaux dans le cadre du BSC.
  2. Jour 1
    1. Aux élèves de faire des médias et de cultiver des cellules (comme dans l'étape 1).
    2. Comme les étudiants obtiennent un stock de cellules MMT sur une plaque de 10 cm, diriger les étudiants à préparer des milieux de culture de cellules et de donner un tutoriel sur l'utilisation de l'hemocytometer, la microscopie numérique et le logiciel de microscopie appareil photo numérique (comme dans l'étape 2).
    3. Calibrer le logiciel pour les objectifs utilisés sur le microscope (par exemple, 4X, 10X, 20X) utilisent désormais le protocole du fabricant.
  3. Jour 2
    1. Demandez aux élèves confirment nombre total de cellules et la viabilité cellulaire (comme dans l'étape 2).
    2. Demander aux élèves de compter les cellules sur le plat 100 mm en utilisant à la fois le logiciel de microscopie et les méthodes de hémocytomètre, pour confirmer les résultats obtenus sont similaires.
    3. Aux élèves d'obtenir un 24 puits cellules de la plaque et intermédiaires de la boîte de 100 mm sur les plaques à 24 puits à partir de la densité de placage de cellule désirée (comme dans l'étape 1). Ceci est considéré comme Jour Split. Placer la plaque 24 puits dans un incubateur de culture cellulaire pendant 24 heures.
  4. Jour 3
    1. Cultiver les cellules MMT pendant 24 heures sur une plaque de 24 puits. Demandez aux élèves d'observer les cellules au microscope et comptent en utilisant un logiciel de microscopie (comme dans l'étape 2).
    2. Donner à l'étudiant / tesuis échantillons de stocks de médicaments de traitement du cancer. Demandez-leur de préparer et de diluer la solution mère d'origine (comme dans l'étape 3). Ajouter les diverses concentrations des médicaments dans leurs cellules pour établir une courbe dose-réponse. Ceci est appelé jour 0.
    3. Incuber les cellules (étape 1.2) avec les médicaments pour un maximum de 48 heures.
  5. Jour 4
    1. Demandez aux élèves d'observer les cellules traitées après 24 heures. Ceci est 1 jour.
    2. Comptez chaque logiciel de la microscopie et l'aide. photographies de la fiche de chaque puits afin que le comptage peuvent être menées en dehors du laboratoire (comme dans l'étape 2).
    3. Incuber les cellules (étape 1.2) avec les médicaments pour encore 24 heures.
      NOTE: Le moniteur propose des didacticiels et des critiques de l'analyse des données et la présentation graphique supplémentaires. Les élèves apprennent à créer des figures, les complots, et l'analyse statistique pour le jour de la collecte de données suivant.
  6. Jour 5
    1. Demandez aux élèves de cellules traitées après 48 heures, Jour 2.
    2. Comptez chaqueainsi l'aide du logiciel de microscopie. photographies de la fiche de chaque puits afin que le comptage peuvent être menées en dehors du laboratoire (comme dans l'étape 2).
    3. Et recueillir la récolte des cellules pour comptage par le procédé traditionnel de hémocytomètre en tant que moyen de vérification de capacité de l'étudiant à utiliser efficacement la méthode de microscopie logiciel (comme dans l'étape 2).
      Remarque: Recueillir des données et tirer des conclusions ou de réviser les hypothèses, en conséquence.

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Résultats

Culture de cellules MMT et comparaison des méthodes de comptage.

Des cellules tumorales mammaires de souris ont été cultivées et caractérisées avec succès (Figure 1) et une nouvelle méthode de comptage cellulaire a été mise au point à l’aide du logiciel Motic, un programme informatique associé à une caméra numérique pour microscope. Cette nouvelle méthode de comptage cellulaire a été comparée à une méthode traditionnelle utilisant un hémocytomètre (Figure 2

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Discussion

Un module de laboratoire est présenté qui vise à enseigner une variété de sujets en biologie cellulaire à travers les techniques avancées de culture cellulaire animale. Le module y parvient en analysant les effets d’un certain nombre de produits chimiques anti-prolifératifs sur la réplication des cellules qui modélisent le cancer du sein humain. Le test primaire s’appuie sur la technique fondamentale du comptage des cellules et introduit une nouvelle façon de compter les cellules à l’aide d’un logiciel de microscopie. Le...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont reçu aucun soutien financier ou comparable de la part de Motic.

Remerciements

Ce travail est soutenu par la Fondation Joseph Alexander, le prix de recherche de premier cycle de l’ASBMB, 2013-2014, et une bourse de science, Marymount Manhattan College, 2012-2013.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Hotte de culture tissulaireESCO Labculture ReliantClasse II Type A2 Armoire de sécurité biologique
Waterjactor CO2 IncubateurCEDCOModèle 1510
Hémocytomètre à lignes vivesAmerican Opticalavec deux grilles séparées
Motic Images PlusMac OSX Verison 2.0 ou supérieur
Gilson PipetmanRainin instrument co. incP-20D, P-200D, P-1000D
CK30/CK40 Microscope àOlympus4 objectif avec caméra
200 μ ; l Pointes de pipetteMidSci40200C
1 000 μ ; l Pointes de pipetteMidSciAVR4
10 ml Pipettes sériologiquesTPPTP94010
24 plaques de puitsCoStar- Tissue Culture Cluster352424 puits, 16 mm de diamètre, stérilisé par rayonnement
Trypan Blue Solution 0,4 %SigmaT8154100 ml, testé en culture cellulaire non-haz
Bright-line Hemacytometer coverslip de rechange, non-hazSigma
Souris Cellules tumorales mammaires (MMT)ATCCCCL-51
Eagle Minimum Essentail Medium (EMEM)ATCC30-2003500 ml
Sérum fœtal bovinSigmaF0926500 ml
Chlorhydrate de metformineSigmaPHR1084500 mg
TamoxifèneSigmaT5648poudre blanche ou blanc-jaune
CurmuminSigmaC1386poudre jaune-orange
AspirinSigmaA2093répond aux spécifications de test USP
lumière inversée Z375357

Références

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