Immunohistochimie et d'étiquetage multiple avec des anticorps de l'espèce hôte mêmes pour l'étude des adultes hippocampe neurogenèse

Résumé

Cet article vidéo illustre un protocole complet permettant de détecter et de quantifier tous les stades de la neurogenèse de l’hippocampe adulte au sein d’une même section de tissu. Nous avons élaboré une méthode pour surmonter les limites de l’immunofluorescence multiple indirecte qui surviennent lorsque des anticorps appropriés de différentes espèces hôtes ne sont pas disponibles.

Résumé

Neurogenèse adulte est un processus très réglementé multi-étape dans laquelle de nouveaux neurones sont générés à partir d'une cellule souche neurale activé par de plus en plus engagés sous-types de souches intermédiaires. Chacun de ces sous-types exprime un ensemble de marqueurs moléculaires spécifiques qui, avec des critères morphologiques spécifiques, peuvent être utilisés pour leur identification. Typiquement, les techniques d'immunofluorescence sont appliqués impliquant des anticorps spécifiques du sous-type en combinaison avec des marqueurs de prolifération exo ou endogènes. Nous décrivons ici immunomarquage méthodes pour la détection et la quantification de tous les stades de la neurogenèse hippocampique adulte. Celles-ci comprennent l'application d'analogues de la thymidine, perfusion transcardial, traitement des tissus, épitope par la chaleur, ABC immunohistochimie, immunofluorescence indirecte multiple, microscopie confocale et de quantification des cellules. En outre, nous présentons un protocole d'immunofluorescence multiple séquentielle qui contourne les problèmes usually découlant de la nécessité d'utiliser des anticorps primaires soulevées dans les mêmes espèces hôtes. Il permet une identification précise de tous les sous-types de souches de l'hippocampe avec un marqueur de prolifération dans une seule section. Ces techniques sont un outil puissant pour étudier la régulation de différents sous-types de souches en parallèle, leur implication dans les pathologies du cerveau et de leur rôle dans les fonctions spécifiques du cerveau.

Introduction

Deux régions du cerveau de manière constitutive générer de nouveaux neurones tout au long de la vie, la zone sous-ventriculaire des ventricules latéraux et la zone sous-granulaire (SGZ) du gyrus denté de l'hippocampe (DG). Les nouveaux neurones dérivent de cellules progénitrices neurales et passent par différents stades de développement morphologique et physiologique avant d'atteindre la maturité ^1,2. A partir d'une cellule souche radiale divisant lentement glie-like (type 1) étages consécutifs de transit amplification de cellules progénitrices intermédiaires se présentent. Les sous-types plus indifférenciées (type 2a et 2b) de type ont une forme irrégulière avec de courtes, les processus tangentielles. Ils génèrent des neuroblastes (type 3) qui sortent graduellement du cycle cellulaire pour devenir neurones immatures (avec dendrites étendus vers la couche moléculaire) et finalement se intégrer dans le réseau de l'hippocampe des cellules granulaires comme matures. En raison de leurs caractéristiques physiologiques particulières ces cellules fournissent les circuits améliorés avec la plasticité ³ suggesTing un rôle unique dans la fonction hippocampique. En fait, les études de la dernière décennie ont généré des preuves substantielles que la neurogenèse adulte contribue à la mémoire spatiale, la séparation de modèle et le comportement émotionnel ^4,5.

Neurogenèse adulte peut être étudiée en utilisant des approches différentes. analogues de la thymidine intègrent dans l'ADN au cours de la phase S du cycle cellulaire et permettent la naissance datant, la quantification et le destin analyse des cellules nés ^6-8. L'application séquentielle des différents analogues de la thymidine (par exemple, CldU, EdU ou UDI) peut être utilisée pour étudier le renouvellement cellulaire ou populations de cellules nés à différents moments au cours d'une expérience ^9. Une alternative, le marqueur endogène pour la prolifération cellulaire est Ki67. Il est exprimé dans les cellules en division au cours de toutes les phases du cycle cellulaire (G1, S, G2, M) à l'exception de la phase de repos (G0) et le début de G1 ^10,11. Afin d'analyser le phénotype des populations de cellules-nés chez l'adulte dentate gyrus plusieurs marqueurs moléculaires spécifiques de stade peuvent être utilisés tels que GFAP, nestine, DCX et NeuN ^1,6. GFAP est un marqueur des astrocytes matures, mais est également exprimé dans les cellules gliales radiales comme dans le cerveau antérieur des adultes. Nestin est un filament intermédiaire spécifique des cellules gliales radiales ressemblant et les cellules progénitrices intermédiaires début. DCX est une protéine associée aux microtubules exprimée dans les progéniteurs intermédiaires, les neuroblastes et les neurones immatures. Basé sur le (co) expression de ces trois marqueurs et les caractéristiques morphologiques des cellules marquées quatre sous-types de cellules souches distinctes peuvent être identifiés: le type 1 (GFAP ^+, nestine ^+, DCX ^-), le type 2a (GFAP ^-, nestine ⁺ , DCX ^-), le type 2b (GFAP ^-, nestine ^+, DCX ⁺⁾ et le type 3 (GFAP ^-, nestine ^-, DCX ^{+) 1.} Co-marquage de DCX avec NeuN, qui est exprimé dans les neurones post-mitotiques, permet la différenciation des immature (DCX ^+, NeuN ⁺⁾ et matures (DCX ^-, NeuN ⁺⁾ neurones granulaires.

Les marqueurs mentionnés ci-dessus sont fréquemment utilisés pour co-marquage immunofluorescent et microscopie confocale ultérieur pour analyser le nombre et l'identité des cellules de nouveau-nés. Cela nécessite habituellement des anticorps de différentes espèces hôtes anticorps pour empêcher une réactivité croisée indésirable. Cependant, la majorité des anticorps primaires appropriés pour la recherche de la neurogenèse sont élevés soit chez le lapin ou souris (par exemple, souris α-BrdU, souris α-NeuN, lapin α-Ki67, lapin α-GFAP). Cela conduit à de sérieuses limitations dans le nombre et la combinaison des antigènes qui peuvent être évalués en une seule tranche. Ceci à son tour augmente non seulement l'effort de coloration, selon colorations multiples doivent être effectuées, mais peut aussi compromettre la fiabilité des résultats. De plus, certains antigènes sont sensibles à la formaline épitope induite par masquage de fixation (par exemple, Ki67, La nestine). Nous décrivons ici modifications des protocoles de immunomarquage simples et multiples classiques (par exemple, la récupération de l'épitope, immunocoloration séquentielle multiples, utilisation de la nestine-GFP souris transgéniques ¹²⁾ à surmonter bon nombre de ces questions. En particulier, le protocole d'immunofluorescence multiple séquentielle permet coloration contre un maximum de quatre antigènes différents même si une partie des anticorps est dérivé du même hôte. Ceci permet la détection simultanée de type 1, type 2a, 2b et le type des cellules progénitrices de type 3, ainsi que leur activité proliferative dans une seule section.

Protocole

NOTE: Toutes les procédures impliquant des animaux vivants ont été effectuées conformément à la directive CE 86/609 / CEE des lignes directrices sur le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et approuvé par le comité d'éthique local (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz).

1. Injection par voie intrapéritonéale analogues de la thymidine

1. Peser les animaux le jour avant l'injection. Calculez le montant de la thymidine analogique requise pour toutes les injections prévues le lendemain ainsi que les volumes d'injection individuels poids ajusté d'un / ml solution stock de 10 mg.
2. Préparer / ml thymidine solution mère à 10 mg. (ATTENTION! Analogues de la thymidine sont toxiques. Suivez les fiches spécifiques de données de sécurité (FDS) fournies par les fournisseurs, ce est à dire, porter une blouse de laboratoire et des gants, utiliser une hotte chimique).
   1. Prenez thymidine analogique du congélateur et l'amener à RT, env. 21 ° C. Peser 10 mg et ajouterune solution saline stérile (pour BrdU et CldU) ou N NaOH 0,04 (dans une solution saline stérile, car UDI), vortex. Placez au moins 10 à 15 min dans un bain tourbillon et 50 ° l'eau tous les 2 à 3 min pour dissoudre la poudre.
      REMARQUE: Utilisez des solutions pour un maximum de 24 heures se il est entreposé à température ambiante et pendant plusieurs semaines à -20 ° C. Protéger solutions de la lumière (couvrir de papier d'aluminium). Toujours vérifier précipités et re-dissoudre si nécessaire.
3. Retenez la souris par la peau et par voie intrapéritonéale injecter un volume approprié, ajustée au poids de la solution mère (à température ambiante) en utilisant une seringue de dosage de précision avec une aiguille 30 G.
   NOTE: En cas CldU et IdU doivent être administrés de façon séquentielle dans le même animal, considèrent injecter des concentrations équimolaires (par exemple, 42,5 mg / kg et 57,5 CldU mg / kg IdU, ce qui correspond à 50 mg / kg BrdU). Par conséquent, ajuster le volume d'injection des solutions à 10 mg / ml actions en conséquence.

2. Préparation des tissus

1. Prepare 4% de formaldehyde dans 0,1 M de tampon phosphate pH 7,4 le jour avant la perfusion. Conserver à 4 ° C.
2. Perfuser transcardiaque les souris profondément anesthésiés (3,5% de l'isoflurane) via le ventricule gauche avec du PBS 10 ml glacée, puis avec 40 ml glacée formaldéhyde (débit de 5 ml / min). On dissèque le cerveau et la post-correction dans le même fixatif pendant 24 heures à 4 ° C.
3. Transférer les cerveaux consécutivement dans 10% (24 h à 4 ° C) et 30% de saccharose (jusqu'à ce que les puits du cerveau, env. 48 h). Pour la congélation, plonger lentement dans les cerveaux cryoprotégés -25 ° C jusqu'à ce qu'aucune bulle isopentane émergent du tissu. Stocker à -80 ° C.
4. Couper des coupes coronales de 40 pm d'épaisseur sur un microtome de congélation (température du bloc à -25 et -16 ° C). sections de transfert de manière séquentielle dans une solution d'antigel contenant des puits d'une plaque de culture cellulaire à 24 puits (voir Figure 1). Stocker à -20 ° C.

Figure 1. Représentation schématique de transférer tranches microtome dans une plaque de 24 puits. Commencez à A1 et placez les tranches ultérieures dans la ligne A, après A6 aller jusqu'à la ligne B et ainsi de suite. En arrivant à D6, revenir à A1 et continuer. Cet agencement permet de tranches pour la quantification de chaque ^n-ième partie de l'ensemble d'un cerveau. Pour la quantification des cellules nés prendre toutes les 6 ^e section du cerveau (l'équivalent du contenu d'une colonne), par immunofluorescence phénotypage prendre chaque section 12 ^e (équivalent au contenu de deux lignes alternées d'une colonne).

3. Immunocoloration

NOTE: Les sections sont traitées flottement libre, généralement dans des plaques 6 puits équipés d'une plaque de support et Mesh. Par exception, le blocage, incubations d'anticorps et la réaction ABC sont faites dans 12 ou 24 puits plaques sans inserts en mesh (0,5 à 1 ml par well est suffisante, en fonction du nombre de tranches qui doivent être colorées). Au cours de ces étapes, transférer sections avec l'aide d'un pinceau (rincer à chaque nouvelle solution). Toutes les incubations sont faites avec agitation continue (max 150 rpm).

1. Immunohistochimie (méthode ABC)
   1. Transfert sections de l'antigel dans le SCT et bien rincer (une fois O / N à 4 ° C, 5 fois à température ambiante pendant 10 min chacun) pour supprimer complètement l'antigel.
   2. Incuber pendant 30 min dans 1,5% de H ₂ O ₂ dans du TBS-T pour étancher une activité de peroxydase endogène. Faites attention à bulles et re-plonger sections si nécessaire. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun.
   3. Facultatif: Pendant ce temps, préchauffer une enceinte de chauffage et du HCl 2 N à 37 ° C. Incuber les coupes pendant 30 min à 37 ° C dans du HCl 2 N pour dénaturer l'ADN. Gently sections distinctes à l'aide d'une brosse.
   4. Facultatif: Neutraliser sections pendant 10 min dans 0,1 M tampon borate pH8,5, la température ambiante. Pendant le transfert, tamponner brièvement les inserts en mesh contenant les sections sur une serviette en papier pour enlever restes HCl. Rincer deux fois dans TBS pendant 15 min chacun.
   5. Incuber dans TBSplus pour perméabiliser le tissu et de bloquer les sites de liaison d'anticorps non spécifiques, une heure à température ambiante.
   6. Incuber dans anticorps primaire dilué dans TBSplus, O / N à 4 ° C. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun.
   7. Incuber dans anticorps secondaire biotinylé dilué dans TBSplus, 3 heures à température ambiante. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun. Pendant ce temps ...
   8. Préparer complexe ABC selon le protocole du fabricant (A + 1% 1% de B dans du TBS-T). Laisser reposer pendant 30 min à température ambiante avant utilisation. Incuber sections réactif AB pendant 1 heure à température ambiante. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun.
   9. Préparer 50 ml 0,5 mg / ml DAB dans du TBS-T par 6 ou 12 puits plaque, divisé en deux moitiés et pipette 4 ml ou 2 ml par puits, respectivement. sections de transfert en solution DAB (ATTENTION! DAB est toxique. Suivez les spécific FDS fournies par le fournisseur, ce est à dire, de porter une blouse de laboratoire et des gants, utilisent une hotte chimique).
   10. Ajouter 0,5 ml 1% H ₂ O ₂ à 25 ml de solution de DAB restant, mélanger et volumes pipette équivalentes comme ci-dessus à chaque puits pour démarrer la réaction peroxydase. Incuber pendant 12 min. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun.
   11. Sections de montage aux diapositives de la gélatine, l'air sec O / N. Lamelle avec un milieu de montage permanent.
   12. Facultatif: Counterstain avant de placer la lamelle (voir section 3.5).
       NOTE: Si le rapport signal-bruit est faible en raison de bruit de fond élevé, répéter le traitement H ₂ O ₂ après l'incubation avec le réactif AB (étape 3.1.8).
2. Multiple-immunofluorescence
   1. Immunofluorescence multiple unique ou simultanée
      1. Transfert sections de l'antigel dans le SCT et bien rincer (une fois O / N à 4 ° C, 5 fois à température ambiante pendant 10 min chacun) pour supprimer complètement unetifreeze.
      2. En option: que les étapes 3.1.3 - 3.1.4.
      3. Incuber dans TBSplus pour perméabiliser le tissu et de bloquer les sites de liaison d'anticorps non spécifiques, une heure à température ambiante.
      4. Incuber dans un cocktail d'anticorps primaire (par exemple, α-BrdU rats, porcs Guinée α-DCX, chèvre α-GFP) dilués dans TBSplus, O / N à 4 ° C. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun.
      5. Incuber dans cocktail d'anticorps secondaires conjugués à un fluorochrome (par exemple, la rhodamine Rouge α-rat, Alexa-647 α-Guinée porc, Alexa-488 α-chèvre; tous dérivés dans âne) dilué dans TBSplus, 3 heures à température ambiante ou O / N à 4 ° C. A partir de maintenant protéger les sections de la lumière. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun.
      6. Sections de montage aux diapositives de la gélatine, l'air sec O / N. Lamelle avec un milieu de montage aqueux.
   2. Immunofluorescence multiple séquentielle avec des anticorps primaires de même espèce hôte
      1. Comme les étapes 3.2.1.1 - 3.2.1.3.
      2. Incuber dans fipremier anticorps primaire (par exemple, le lapin α-antigène A), O / N à 4 ° C. Rincer trois fois dans TBS et une fois en TBS-T pendant 10 minutes chacun.
      3. Incuber en premier anticorps secondaire conjugué à un fluorochrome (par exemple, Rhodamine Red-conj. Âne α-lapin), 3 heures TA. A partir de maintenant protéger les sections de la lumière. Rincer trois fois dans TBS et une fois en TBS-T pendant 10 minutes chacun.
      4. Incuber à 10% de sérum normal même hôte que l'anticorps primaire (par exemple, du sérum de lapin) pendant 3 heures à RT saturer paratopes ouvertes sur le premier anticorps secondaire. Rincer trois fois dans TBS et une fois en TBS-T pendant 10 minutes chacun.
      5. Incuber dans TBSplus avec 50 ug / ml monovalents non conjugué de fragments Fab dirigé contre l'hôte des anticorps primaires (par exemple, α-lapin IgG (H + L)) pour couvrir épitopes qui pourraient être reconnus par le deuxième anticorps secondaire, O / N à 4 ° C.
      6. Rincer au moins 3 fois dans du TBS et une fois en TBS-T pendant 10 minutes chacun. Pendant le transfert, swa brièvementb les inserts en mesh contenant les sections sur une serviette en papier pour enlever les restes Fab.
      7. Incuber dans secondes anticorps primaire (par exemple, le lapin α-antigène B), O / N à 4 ° C. Rincer trois fois dans TBS et une fois en TBS-T pendant 10 minutes chacun.
      8. Incuber en second anticorps secondaire conjugué à un fluorochrome (par exemple, Alexa-488-conj. Âne α-lapin), 3 heures TA. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun, monter et lamelle comme ci-dessus.
         NOTE: Pour étiqueter antigènes avec des anticorps de différentes espèces hôtes les ajouter à l'étape 3.2.2.2 et les anticorps secondaires respectifs à l'étape 3.2.2.3.
   3. L'un des anticorps secondaires de même espèce que l'un des anticorps primaires
      NOTE: Ce protocole est adapté pour quadruple coloration contre BrdU ou Ki67 avec GFAP, nestine-GFP et DCX.
      1. Suivre strictement les étapes protocole 3.2.1.1 - 3.2.1.5. Jusqu'à ce point ne utiliser que du sérum âne dans TBSplus.
      2. Incuber dans TBSplus contenant du sérum de chèvre à 3% pendant 1 heure à température ambiante. Ce couvre paratopes ouvertes sur l'anticorps secondaire α-chèvre. Rincer trois fois dans TBS et une fois en TBS-T pendant 10 minutes chacun.
      3. Incuber dans AMCA-conj. α-lapin de chèvre dilué à TBSplus, RT 3 h ou O / N à 4 ° C. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun, monter et lamelle comme ci-dessus.
   4. CldU, IdU co-coloration
      1. Rincer, dénaturer et de neutraliser sections comme décrit dans la section 3.2.1 (étapes 3.2.1.1 - 3.2.1.2).
      2. Incuber à 20 pg / ml de fragments Fab non conjugués α-IgG de souris (H + L) dans TBSplus, 1 heure à température ambiante. Rincer 4 fois dans du TBS et une fois en TBS-T pendant 10 minutes chacun.
      3. Incuber dans un cocktail d'anticorps primaire contenant α-BrdU rat (1: 400; purifié IgG2) et α-BrdU souris (1: 350) dilués dans TBSplus, O / N à 4 ° C. Rincer trois fois dans TBS et une fois en TBS-T pendant 10 minutes chacun.
      4. Incuber dans un cocktail d'anticorps secondaire biotinylé contenant âne α-rat (1: 500) et FITC-conj. âne α-souris fragments Fab (1: 100). Rincer trois fois dans TBS et une fois en TBS-T pendant 10 minutes chacun.
      5. Incuber dans la rhodamine-Rouge conj. Streptavidine, 2 heures à température ambiante. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun, monter et lamelle comme ci-dessus.
   5. L'amplification du signal de fluorescence dans des souris nestine-GFP
      1. Ajouter chèvre α-GFP au cocktail d'anticorps primaire.
      2. Ajouter un anticorps secondaire conjugué fluorochrome avec des propriétés spectrales similaires à la GFP (comme Alexa 488 conj. Âne α-chèvre) au cocktail d'anticorps secondaire.
3. épitope
   1. Effectuer épitope après rinçage à l'antigel. Préchauffer vapeur avec 6 ou 12 puits des plaques contenant 0,1 M de tampon citrate pH compris entre 6,0 95 à 99 ° C (environ 25 min).
   2. Transférez les sections dans le tampon citrate chaude et la vapeur pendant 30 min (couvrir les plaques avec du papier d'aluminium que le plastique lidentifiants ne sont pas résistant à la chaleur).
   3. Immédiatement placer les plaques dans un bain de glace pour refroidir. Cela permet de protéger la morphologie du tissu, ce qui est particulièrement important lorsque l'on travaille avec des coupes de cerveau des animaux post-natales.
   4. Rincer trois fois dans TBS pendant 10 minutes chacun pour rincer et neutraliser le citrate et continuer coloration.
4. Souris anticorps sur des tissus de la souris
   1. Ajouter / ml de fragments Fab monovalents 20 ug de α-souris IgG (H + L; mêmes espèces d'hôtes que l'anticorps secondaire) à la première étape de blocage (par exemple, l'étape 3.1.5 ou 3.2.1.3).
   2. Rincer 4 fois dans du TBS et une fois en TBS-T pendant 10 min chacun, et procéder avec protocole respective.
5. Le violet de crésyl contre-coloration
   1. Préchauffer solution crésyl violet à 60 ° C (en pot de verre). Incuber les lames dans la solution chaude pendant 3 min.
   2. Rincer à l'aq. dest. déshydrater et deux fois pendant 1 minute chaque à 70%, 96% et 100% d'isopropanol.
   Ciel de 5-6 min dans du xylène ou un substitut du xylène et lamelle avec un milieu de montage permanent compatible.

4. Analyse des données

1. Compter les cellules nés peroxydase colorées dans chaque section ^{6 e} sur toute la mesure rostrocaudal du gyrus denté. Utilisez un microscope optique à un grossissement de 400X.
2. Multiplier les nombres de cellules résultant de l'intervalle d'intersection pour obtenir une estimation du nombre total de cellules-nés.
3. L'image de la fluorescence sections marqué avec un microscope confocal laser équipé de lasers appropriés et des systèmes de filtrage. Prendre piles d'images à des positions aléatoires le long de la totalité de l'étendue du gyrus denté à un grossissement de 400X et analyser au moins 50 cellules d'intérêt sélectionnés au hasard par hémisphère pour co-marquage avec d'autres marqueurs.
4. Multiplier les pourcentages résultant de cellules co-marqué (% / 100) avec le nombre total de cellules nés pour calculer absoluenombre de populations spécifiques de cellules nouveau-nés.

Résultats

Nous avons appliqué les méthodes décrites ci-dessus pour quantifier et caractériser les cellules de nouveau-nés dans les postnatales et adultes hippocampe. Par conséquent, nous avons utilisé de type sauvage et la neurogenèse déficientes cycline D2 knock out (KO) Ccnd2 souris logées dans des conditions connues pour affecter le taux de la neurogenèse (ie, l'environnement enrichi, EE) ^13,14. DAB coloration immunohistochimique soit contre Ki67, BrdU, CldU ou IdU toujours révélé des différences d...

Discussion

Quantification et identification des sous-populations de cellules nouveau-nés est une question centrale dans la recherche de la neurogenèse adulte. Combinant marqueurs de prolifération et des anticorps contre les protéines exprimées au cours des étapes spécifiques de la neurogenèse adulte permet la détection immunohistochimique de ces sous-populations. Certains des anticorps ou des combinaisons d'anticorps de coloration nécessitent des conditions particulières.

Étiquetage des cellules en...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Administration d’analogue de thymidine
5-Bromo-2&prime ;-désoxyuridine, BrdU	Sigma-Aldrich	B9285	toxique (mutagène, tératogène)
5-Chloro-2&prime ;-désoxyuridine, CldU	Sigma-Aldrich	C6891	toxique (mutagène, tératogène)
5-Chloro-2&prime ;-désoxyuridine, CldU	MP Biomedicals	2105478	toxique (mutagène, tératogène)
5-Iodo-2&prime ;-désoxyuridine, IdU	MP Biomedicals	2100357	toxique (mutagène, tératogène)
Préparation des tissus
Isoflurane-Actavis	Piramal Healthcare	700211
Poudre de paraformaldéhyde (PFA)	Riedel-De Hä ; fr	16005	toxique, inflammable
Pompe à perfusion PD5206	Heidolph Instruments	523-52060-00
Tube de laboratoire Masterflex Tygon, & Oslash ; 0,8 mm	Thermo Fischer Scientific	06409-13
Aiguille d’alimentation, droite, 21 G, pointe olive 1,75 mm, 40 mm	Agnthos	1036
Microtome de congélation Microm HM 400	Thermo Fischer Scientific
Plaques multipuits de culture cellulaire 24 puits	Greiner Bio-One	662160
Immunohistochimie
Tefal vitacuisine vapeur	Tefal	VS 4001
Netwell 24 mm inserts de membrane en maille polyester	Corning	3479	préchargé en plaques de culture 6 puits
Netwell 15 mm inserts	de membrane en maille polyesterCorning	3477	préchargé dans des plaques de culture à 12 puits
Kit de support en plastique Netwell à 6 puits	Corning	3521	pour inserts de membrane en maille de polyester de 24 mm
Kit de support en plastique Netwell à 12 puits Corning		3520	pour inserts de membrane en maille de polyester de 15 mm
Kit Vectastain Elite ABC	Vector Laboratories	PK-6100
DAB (3,3&prime ;-Diaminobenzidine tétrachlorhydrate)	Sigma-Aldrich	D-5637	cancérogène, sensible à la lumière
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Anticorps primaires
Rabbit IgG1 &alpha ;-Ki67	Novocastra/ Leica Biosystems	NCL-L-Ki67MM1	DAB 1:400/IF 1:100 ; nécessite la récupération de l’épitope
Lapin &alpha ;-GFAP, AS-3-GF	Systèmes synaptiques	173 002	1:500
IgG de chèvre (H+L) &alpha ;-GFP	Anticorps Acris	R1091P	1:300
IgG1 de souris &alpha ;-nestin	Abcam	ab6142	1:200 ; nécessite la récupération de l’épitope
IgG de cobaye (H+L) &alpha ;-Doublecortin	Merck Millipore	AB2253	1:500
IgG2a de rat &alpha ;- BrdU (ascite)	AbD Serotec/ Bio-Rad	OBT0030CX	pour la détection de BrdU ; DAB 1:500/IF 1:400
Rat IgG2a &alpha ;-BrdU (purifié)	AbD Serotec/ Bio-Rad	OBT0030  ;   ;	pour la détection de CldU ; DAB 1:500/IF 1:250-400
souris IgG1 &alpha ;-NeuN	Merck Millipore	MAB377	1:500
souris IgG1κ ; α ;-BrdU	BD Biosciences	347580	Pour la détection de l’IdU ; DAB 1:500/IF 1:350
Anticorps secondaires
Donkey &alpha ;-cobaye IgG (H+L)-Biotine	Dianova	711-065-152	1:500
IgG d’âne &alpha ;-rat (H+L)-Biotine	Dianova	712-065-150	1:500
IgG d’âne &alpha ;-souris (H+L)-Biotine	Dianova	715-065-151	1:500
IgG de chèvre &alpha ;-rat (H+L)-	Sondes moléculaires	A11006	1:250
IgG âne &alpha ;-chèvre (H+L)-Sondes moléculaires Alexa Fluor 488		A11055	1:250
IgG âne &alpha ;-souris (H+L)-FITC, Fab-Fragment	Dianova	715-097-003	1:100
IgG âne &alpha ;-souris (H+L)-Alexa Fluor 647	Dianova	715-605-151	1:250
Âne &alpha ;-cobaye IgG (H+L)-Alexa Fluor 647	Dianova	706-605-148	1:250
Âne &alpha ;-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X	Dianova	712-295-150	1:250
Âne &alpha ;-lapin IgG (H+L)-Rhodamine Red-X	Dianova	711-295-152	1:250
Âne &alpha ;-cochon d’Inde IgG (H+L)-Rhodamine Red-X	Dianova	706-296-148	1:250
Streptavidine-rhodamine Red-X	Dianova	016-290-084	1:500
Chèvre &alpha ;-lapin IgG (H+L)-AMCA	Dianova	111-155-144	1:250, fonctionne uniquement avec lapin &alpha ;-GFAP
Hoechst 33342	Sondes moléculaires	H3570	1:1000
Sondes moléculaires	DAPI D1306	1:1000
Blocking
Fragment d’âne &alpha ;-souris IgG (H+L)	Dianova	715-007-003	1:20
Âne isolé &alpha ;-lapin IgG (H+L)	Dianova	711-007-003	1:20
Sérum d’âne normal	Merck Millipore	S30
Sérum normal de lapin	Dianova	011-000-010
Sérum normal de chèvre	Dianova	005-000-001
Albumine sérique bovine	Sigma-Aldrich	A7906
Histology
Cresyl violet	Sigma-Aldrich	C5042
Neo-Clear	Merck Millipore	109843	substitut de xylène non toxique
Neo-Mount	Merck Millipore	109016	milieu
Microscopie
Axioskop 2	Microscopie
LSM 710	Microscopie