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Article de méthode

Or nanotige assistée stimulation optique des cellules neuronales

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DOI :

10.3791/52566

⸱

27 avril 2015

 ,  , 
1Biotactical Engineering, Faculty of Science, Engineering and Technology, Swinburne University of Technology

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit comment utiliser le chauffage transitoire associé à l’absorption optique de nanotiges d’or pour stimuler la différenciation et l’activité intracellulaire du calcium dans les cellules neuronales. Ces résultats ouvrent potentiellement de nouvelles applications dans les prothèses neurales et les études fondamentales en neurosciences.

Résumé

Des études récentes ont démontré que les nerfs peuvent être stimulés de diverses manières par le chauffage transitoire associé à l’absorption de la lumière infrarouge par l’eau dans le tissu neuronal. Cette technique présente un grand potentiel pour remplacer ou compléter les techniques de stimulation standard, en raison du potentiel de localisation accrue du stimulus et de minimisation du contact mécanique avec le tissu. Cependant, les approches optiques sont limitées par l’incapacité de la lumière visible à pénétrer profondément dans les tissus. De plus, la modélisation thermique suggère que les effets de réchauffement cumulatifs pourraient être potentiellement dangereux lorsque plusieurs sites de stimulus ou des taux de répétition laser élevés sont utilisés. Le protocole décrit ci-dessous décrit une approche améliorée de la stimulation infrarouge des cellules neuronales. Le mécanisme sous-jacent est basé sur l’échauffement transitoire associé à l’absorption optique des nanotiges d’or, ce qui peut provoquer le déclenchement de la différenciation des cellules neuronales et l’augmentation des niveaux d’activité intracellulaire du calcium. Ces résultats démontrent que les absorbeurs de nanoparticules peuvent améliorer et/ou remplacer le processus de stimulation neuronale infrarouge basé sur l’absorption d’eau, avec un potentiel d’applications futures dans les prothèses neurales et les thérapies cellulaires.

Introduction

Des études récentes ont démontré que le chauffage transitoire associée à l'absorption de la lumière infrarouge par l'eau (longueur d'onde> 1400 nm) peut être utilisée pour induire des potentiels d'action dans le tissu nerveux et une transitoires calciques intracellulaires dans les cardiomyocytes 2. L'utilisation de la lumière infrarouge a soulevé un grand intérêt pour des applications dans les prothèses neurales, en raison de la résolution spatiale plus fine potentiel, l'absence de contact direct avec le tissu, la minimisation des artefacts de stimulation, et l'élimination de la nécessité de modifier génétiquement les cellules avant la stimulation ( le cas échéant en optogénétique) 1. Malgré tous ces avantages, les modèles thermiques récemment développés ont suggéré que les tissus / cellules cibles peuvent être affectés par les effets cumulatifs de chauffage, lorsque plusieurs sites de stimulation et / ou des taux de redoublement élevés sont utilisés 3,4.

En réponse à ces défis, les chercheurs ont reconnu le potentiel d'utiliser Absor extrinsèquebres pour la stimulation du nerf à produire des effets de chauffage plus localisées dans le tissu. Huang et al. A démontré ce principe en utilisant des nanoparticules de ferrite superparamagnétiques à activer à distance des canaux de TRPV1 sensibles à la température dans les cellules HEK 293 avec une haute fréquence de champ magnétique 5. Bien que cette technique peut permettre une pénétration plus profonde (champs magnétiques interagissent avec les tissus relativement faiblement), les réponses ont été enregistrées seulement sur ​​des périodes de secondes, plutôt que les durées de millisecondes nécessaires dans les dispositifs bioniques 5. De même, Farah et al. Stimulation électrique démontré des neurones corticaux de rat avec des micro-particules noires in vitro. Ils ont montré une précision de niveau de cellule dans la stimulation en utilisant des durées d'impulsion de l'ordre de centaines de ps et des énergies de l'ordre de pJ, permettant potentiellement à des taux de redoublement plus rapides 6.

L'utilisation d'absorbeurs extrinsèques a également été appliquée pour induirechangements morphologiques in vitro. Ciofani et al. Ont montré une augmentation de ~ 40% de l'excroissance de cellules neuronales en utilisant piézoélectriques nanotubes de nitrure de bore excité par ultrasons 7. De même, les nanoparticules d'oxyde de fer endocytose dans les cellules PC12 ont été rapportés pour améliorer la différenciation des neurites d'une manière dépendante de la dose, du fait de l'activation des molécules d'adhésion cellulaire avec l'oxyde de fer 8.

Récemment, l'intérêt des absorbeurs extrinsèques pour aider la stimulation neuronale a également porté sur l'utilisation de nanoparticules d'or (Au IP). Au IP ont la capacité d'absorber efficacement la lumière laser au sommet plasmonique et de dissiper dans l'environnement sous forme de chaleur 9. Parmi toutes les formes de particules disponibles, l'absorption optique des nanotubes d'or (Au ​​NR) correspond idéalement la fenêtre thérapeutique de tissus biologiques (proche infrarouge - NIR, longueur d'onde entre 750-1,400 nm) 10. En outre, dans la suiteposte de stimulation neurale, l'utilisation de Au NR fournit biocompatibilité relativement favorable et un large éventail d'options de fonctionnalisation de surface 11. Des études récentes ont montré que un effet stimulant sur ​​la différenciation peut être induite après des expositions de laser continus de Au NR dans NG108-15 cellules neuronales 12. De même, les transitoires de calcium intracellulaire ont été enregistrées dans les cellules neuronales cultivées avec Au NR après l'irradiation laser modulé avec des fréquences variables et impulsions longueurs 13. dépolarisation de la membrane cellulaire a également été enregistrée après NIR éclairage laser de Au NRs dans des cultures primaires de neurones du ganglion spiral 14. Le premier dans la demande de vivo avec irradié Au NR a été démontrée récemment. Eom et ses collaborateurs exposés Au NR à leur apogée plasmonique et enregistré une multiplication par six de l'amplitude des potentiels d'action composé de nerf (CNAPS) et une diminution triple du seuil de stimulation chez le rat nerfs sciatiques. La sallediée réponse a été attribuée aux effets de chauffage locaux résultant de l'excitation du pic plasmonique NR 15.

Dans le présent document, protocoles pour enquêter sur les effets de la stimulation laser dans NG108-15 cellules neuronales cultivées avec l'UA NR sont spécifiés. Ces méthodes fournissent un simple, mais puissant, moyen pour irradier populations de cellules in vitro en utilisant des techniques et des matériaux biologiques standard. Le protocole est basé sur une diode laser à fibre couplé (LD) qui permet le fonctionnement en toute sécurité et d'alignement répétable. La préparation de l'échantillon et des méthodes d'irradiation laser Au NR peuvent être étendues à des formes de particules différentes et des cultures de cellules neuronales, pour autant que les protocoles de synthèse et de culture spécifiques sont connues, respectivement.

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Protocole

1. Au NR Préparation

Remarque: Au NR peut être synthétisé par un 16 certain nombre de recettes, ou achetés auprès de fournisseurs commerciaux.

  1. Mesurer la densité optique initiale (DO) de la solution Au NR par spectroscopie UV-Vis, en enregistrant les valeurs d'absorption de 300 nm à 1000 nm avec une résolution de 0,5 à 2 nm. Faire varier le volume de la solution à utiliser avec la cuvette disponible.
  2. Évaluer la concentration initiale NP molaire avec une technique appropriée 17 (spectroscopie UV-Vis par exemple, seule particule spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif, la microscopie électronique à transmission) ou utiliser les valeurs de concentration fournies par le vendeur.
  3. Préparer une solution stock de 5 ml en diluant l'échantillon initial Au NR pour atteindre une DO = 1. Pour la meilleure répétabilité, maintenir constante la DO pour tous les échantillons testés. Suivre le protocole du fournisseur commercial de la composition du solvant de dilution. En cas de doute, Utiliser de l'eau déminéralisée.
  4. Centrifugeuse de 1 ml de la solution Au NR deux fois pendant 15 min à 7800 x g pour éliminer tout excès de produit chimique à partir de la solution. cycles de centrifugation peuvent varier en vigueur et le temps (par exemple 20 min à 5600 × g) 18.
  5. Retirez les surnageants et remettre en suspension les NR dans l'eau déminéralisée. Comme particules remises en suspension peuvent former des agrégats en solution, préparer tous les jours pour avoir les meilleurs résultats. Alternativement, stocker dans un réfrigérateur pendant plus de 1 semaine. Ne pas congeler.
  6. Avant d'utiliser dans des conditions de culture cellulaire, la sonication Au NR solution pendant 5 minutes et ensuite stériliser avec de la lumière UV pendant 30 min (intensité de rayonnement UV d'au moins 400 mW m -2 ∙ à 254 nm).

Ligne 2. NG108-15 cellules neuronales Culture et de la différenciation

  1. Pour le milieu de culture cellulaire, de préparer 500 ml d'Eagle modifié de milieu stérile de Dulbecco (DMEM) contenant 10% (p / v) de sérum de veau foetal (SVF), 1% (p / v) L-glutamine, 1%(P / v) de pénicilline / streptomycine et 0,5% (p / v) de l'amphotéricine B.
    Note: Les suppléments peuvent être aliquotés, stocké à -20 ° C et ajoutés aux médias le jour nécessaire. milieu de culture cellulaire peut être réfrigéré à l'état stérile pendant un maximum de 1 mois.
  2. Pour le milieu de différenciation cellulaire, de préparer 50 ml de DMEM stérile contenant 1% (p / v) L-glutamine, 1% (p / v) de pénicilline / streptomycine et 0,5% (p / v) de l'amphotéricine B.
  3. NG108-15 croître des cellules neuronales dans 10 ml de milieu de culture de cellules dans des flacons T75 en polystyrène dans un incubateur à atmosphère humidifiée (5% de CO2 à 37 ° C). Normalement, ensemencer 1,5 à 2 × 10 5 cellules dans chaque flacon pour être prêt en 3-4 jours. Changer le milieu de culture de cellules tous les deux jours.
    Remarque: Pour éviter les dérives génétiques ou variation, ne pas utiliser des cellules de plus de passage 21 pour les expériences.
  4. Lorsque 70-80% de confluence dans la culture, changer le milieu avec un milieu frais chaude de culture cellulaire. Mécaniquement détacher les cellules par délicatement KNOCroi du fond du ballon de confluence. Ne pas utiliser la trypsine.
  5. Centrifuger la suspension de cellules pendant 5 min à 600 x g et remettre en suspension le culot de cellules dans 2 ml de milieu de différenciation de la cellule chaude.
  6. Graine 2 × 10 4 cellules / cm 2 dans une plaque de puits de culture tissulaire en polystyrène avec 96 200 ul de milieu de différenciation cellulaire. Incuber l'expérience pendant 1 jour à 5% de CO 2/37 ° C.
  7. Ajouter entre 3,2 × 10 9 -4,2 × 1 0 10 particules / ml de solution Au NR sur deux jours et incuber pendant 24 heures supplémentaires. Ne pas ajouter les particules pour les expériences témoins.
    Remarque: Comme un contrôle alternatif, Au IP avec une longueur d'onde de pic d'absorption bien différencié peut être utilisé à des fins de comparaison 14. Pour un comportement cellulaire plus cohérente, maintenir la densité cellulaire constante et ne pas modifier la surface du puits avant l'ensemencement des cellules.

3. Croissance Des Neurites Enhancement

  1. Couplele laser avec une fibre optique à mode unique (ouverture numérique = 0,13) et se terminent par un connecteur de fibres (FC connecteurs sont pratiques et couramment disponibles). Mesurer la puissance de sortie du laser avec un mesureur de puissance standard. Pour obtenir les résultats les plus efficaces, correspondre à la longueur d'onde maximale du laser au pic de résonance de plasmon des ORA.
  2. Au jour d'incubation de 3 NR suivante, fixer le connecteur FC au puits. Irradier les échantillons et les contrôles à température ambiante pendant 1 min dans onde continue, pour différentes puissances laser. Laisser la culture se dérouler pendant 3 jours supplémentaires à 5% de CO 2/37 ° C. Répéter le rayonnement laser pendant un minimum de 3 mesures indépendantes.
    Remarque: Les différents temps d'irradiation et les fréquences d'impulsions peuvent être sélectionnés en fonction de l'application.
  3. Caractériser le laser en termes de diamètre du faisceau laser, et l'ensoleillement (W ∙ cm -2).
    1. Pour une fibre monomode standard, utilisez NA = n ∙ péché θ,où n est l'indice de réfraction du milieu en cours d'utilisation et θ est le demi-angle du cône de lumière sortant de la fibre (voir figure 1A). De trigonométrie, r = tan θ ∙ d, où r est le rayon du faisceau et d est la distance entre la fibre et l'échantillon. Le connecteur FC correspond au diamètre du puits, donc à éclairer l'échantillon à une distance d = 2,70 ± 0,20 mm. Lumière quitte la fibre dans l'eau (n = 1,33), ce qui donne r = tan (sin-1 (NA / n)) ∙ d.
    2. En utilisant cette dernière équation, calculer le rayon du faisceau laser, la zone de faisceau correspondant et le rayonnement laser moyenne (puissance de laser divisée par la superficie du faisceau) à la cible (voir l'exemple graphique de la figure 1B). Ces valeurs représentent l'éclairement moyen sur la zone éclairée.
    3. Évaluer les erreurs pour les mesures avec la théorie générale de propagation d'erreur.
      Remarque: La distance bntre le connecteur de FC et l'échantillon peuvent être mesurées par des photographies du dispositif expérimental et post-traitement de l'image en utilisant un logiciel approprié (par exemple ImageJ).
  4. Au jour 5, éliminer le milieu de différenciation des cellules d'après les expériences et fixer les échantillons avec 3,7% (v / v) d'une solution de formaldehyde pendant 10 minutes, puis perméabiliser les cellules avec 0,1% (v / v) de Triton X-100 pendant 20 min.
  5. Ajouter 3% (p / v) de sérum-albumine bovine (BSA) pour les échantillons pendant 60 minutes pour bloquer les sites de liaison de la protéine ne ayant pas réagi. Étiqueter les échantillons pendant une nuit anti-BIII-tubuline (5 ug / ml dans du PBS supplémenté avec 1% de BSA) à 4 ° C.
  6. Incuber les cellules pendant 90 min à l'obscurité avec un anticorps secondaire approprié (anticorps anti-souris IgG conjugué TRITC par exemple) en utilisant une concentration de 0,4 à 2 ug / ml dans du BSA à 1% dans du PBS. Étiqueter les noyaux des cellules avec du DAPI (0,1 ug / ml dans de l'eau désionisée) pendant 10 minutes.
    Remarque: la conjugaison d'anticorps et la concentration might varient selon le protocole de l'entreprise. Échantillons lavage avec du PBS deux fois pendant 5 min après chaque étape de coloration.
    figure-protocol-1
  7. des échantillons de l'image en épifluorescence ou microscopie confocale en utilisant au moins 20 × objectif. Choisissez le microscope filtre conséquence à l'anticorps secondaire. Sélectionnez un filtre DAPI (λ = 358 nm EX; λ EM = 488 nm) pour visualiser les noyaux cellulaires.
  8. Analyser les photos en évaluant: i) la longueur des neurites maximale (record de la longueur de la pointe de la neurites au début du corps de la cellule), ii) le nombre de neurites par cellule neuronale (résumer tous les neurites par cellule) et iii) le pourcentage de cellules avec des neurites (diviser le nombre total de cellules exprimant la ßlll-tubuline par le nombre total de cellules avec un noyau coloré positivement) 19.

4. induite par laser de l'imagerie de Ca intracellulaire

  1. Préparer un 20% (p / v) de solution mère de Pluronic F-127 par dissolution de 2 g de soluté dans 10 ml de diméthylsulfoxyde anhydre (DMSO). Chauffer la solution de Pluronic F-127 à 40 ° C pendant environ 20 min pour augmenter la solubilité. Préparer à l'avance se il est stocké à température ambiante.
  2. Au jour 3 suivant NR incubation, préparer une solution de sel équilibrée (BSS; 135 mM de NaCl, KCl 4,5, CaCl 1,5 mM 2 mM, MgCl 0,5 2, 5,6 mM de glucose et 10 mM d'HEPES, pH 7,4) et supplémenté avec 5 uM de Fluo-4 heures dans du DMSO et 0,1% (p / v) de Pluronic F-127 solution.
    Remarque: solution BSS peut être préparé à l'avance et réfrigérée pour un maximum de 1 mois. Ajouter les suppléments (Fluo-quatre heures et Pluronic F-127) sur le jour de l'expérience.
  3. Retirez milieu de différenciation cellulaire et le remplacer par la solution BSS complétée. Pour obtenir les meilleurs résultats avec un microscope confocal inversé, incuber les cellules dans un puits de micro-diapositive.
  4. Charger NG108-15 cellules avec Fluo-quatre heurespendant 30 min dans l'obscurité à 5% de CO 2/37 ° C. Après le temps d'incubation, laver les échantillons deux fois avec BSS pour enlever tout fluorophore déchargé extracellulaire.
  5. Couple le laser avec une fibre optique monomode et cliver la pointe utilisant des techniques standard. Observez la pointe résultant sous un microscope optique, pour assurer une surface de haute qualité (ce est à dire la pointe doit être perpendiculaire à l'axe des fibres et à plat lors de l'inspection de la microscopie).
    1. Mesurer la puissance de sortie du laser avec un mesureur de puissance standard. Insérez la fibre de livraison lumière en un support de fibre optique et l'apposer sur une micropositionneur. Reportez-vous à Brown et al. 20 pour plus de détails sur la préparation de fibre optique et de positionnement.
      Attention: Suivez les règles générales relatives à la sécurité laser pendant la mesure de la puissance du laser (par exemple, ne regardez pas directement dans le faisceau laser, porter des lunettes de sécurité laser lors de la manipulation, de prévenir l'exposition de la lumière parasite à d'autres utilisateurs de laboratoire) <./ Li>
  6. Connecter un oscilloscope au laser portable pour contrôler la modulation optique. Utilisez un signal binaire avec des fréquences variables (de 0,5 à 2 Hz) et des longueurs d'impulsion (20-100 ms). Connecter le laser en utilisant le signal de modulation en tant que logique transistor-transistor (TTL) d'entrée pour le microscope, suivant la configuration représentée sur la Paviolo et al. 13.
    1. Placer les cellules sous un microscope confocal inversé et la position de la fibre de distribution de lumière 250 ± 50 um loin de la cellule cible dans le mode d'illumination de transmission. A cette distance, utiliser les équations présentées en 3.3.1 pour calculer le rayon du faisceau sur la cible.
  7. Utilisez un laser à ions argon (488 nm) pour exciter le Fluo-quatre heures colorant intériorisé (λ = 494 nm EX; λ = 516 nm EM) et la LD synchronisée pour l'excitation des ORA endocytose. Effectuer l'imagerie à température ambiante des échantillons et des contrôles en utilisant au moins un objectif 40 × en recueillant analyses chronologiquesavec 256 × 256 pixels / résolution d'image en mode aller-retour avec une fréquence d'au moins 4 Hz. Effectuer un enregistrement sans aucune excitation LD pour identifier toute interférence laser argon-ion (bruit de référence).
  8. Retirer l'arrière-plan des données à l'aide adaptative pondérés pénalisés moindres carrés algorithmes 21. Tracer les Ca2 + induits variations en fonction du temps. Analyser les pics transitoires de l'intensité de fluorescence à l'aide de l'image logiciel de post-traitement de seuil à un niveau trois fois l'écart type du bruit de base (3σ).

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Résultats

En utilisant les protocoles 1, 2, et 3 décrites ici, un effet stimulant sur la différenciation a été observée dans les cellules neuronales cultivées NG108-15 avec l'UA IP (Au NR, poly (styrène sulfonate) doté d'un revêtement Au NR et revêtu de silice Au NR) après laser expositions entre 1,25 et 7,5 W · cm -2. Les images confocales de rhodamineB marqué Au NR ont montré que les particules ont été internalisés du jour 1 d'incubation 12. La localisation a été observée principalement dans le...

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Discussion

Les protocoles décrits dans cette présentation décrivent comment la culture, différencier et optiquement stimuler les cellules neuronales en utilisant absorbeurs extrinsèques. Les caractéristiques de NR (par exemple, les dimensions, la forme, plasmon longueur d'onde de résonance et de la chimie de surface) et les paramètres de stimulation laser (tels que la longueur d'onde, durée d'impulsion, taux de redoublement, etc.) peuvent être modifiées pour correspondre à différents besoins expérimen...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun intérêt concurrent à divulguer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier NanoVentures l'Australie pour le soutien financier de Voyage et le professeur John Haycock pour avoir partiellement accueilli cette recherche à l'Université de Sheffield et Mme Jaimee Mayne pour son aide pendant le tournage.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Au NRSigma Aldrich716812
NG108-15Sigma Aldrich8811230
DMEMSigma AldrichD6546
FCSLife Technologies10100147
L-glutamineSigma AldrichG7513
Pénicilline/streptomycineLife Technologies15140122
Amphotéricine BLife Technologies15290018
FormaldéhydeSigma AldrichF8775
Triton X-100BDHT8532
BSASigma AldrichA2058
Anti-&beta ; III-tubulinePromegaG7121
TRITC-conjugué anti-souris IgGanticorps Sigma AldrichT5393
DAPIInvitrogenD1306
Fluo-4 AMInvitrogenF14201
DMSOSigma Aldrich472301
Pluronic F-127InvitrogenP6867
UV-Vis spectromètreVarian Medical Systems Inc.Cary 50 Bio
Mini centrifugeuseEppendorfMini Spin
Bain soniqueUnisonics AustraliaFPX 10D
Incubateur de culture cellulaireKendroHera Cell 150
Centrifugeuse de culture cellulaireHettichRotofix 32A
Diode laserOptotech780 nm fibre monomode - couplée LD
Fibre optiqueThorlabs780 HP
PowermeterCoherentLaser Check
ImageJhttp://rsb.info.nih.gov/ij/index.html
AxonInstrumentsImageX-press 5000A
&mu ;-slide wellIbidi80826
Microscope confocal inverséCarl Zeiss Microscopy Ltd.méta-confocal LSM 510
OscilloscopeTektronixTDS210
Microscope épifluorescent Microscope

Références

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