Ce manuscrit décrit un protocole pour examiner le système olfactif des rongeurs. Le test d’habituation/déshabituation olfactive permettra aux enquêteurs de déterminer si une souris s’habitue à une odeur présentée à plusieurs reprises et si la souris démontre une déshabituation lorsqu’on lui présente une nouvelle odeur.
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Article de méthode
Test pour Odeur discrimination et l'accoutumance chez la souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
Cette vidéo montre une technique pour établir la présence d’un système olfactif fonctionnant normalement chez une souris. Le test permet de déterminer si la souris peut faire la distinction entre les odeurs non sociales et les odeurs sociales, si la souris s’habitue à une odeur présentée à plusieurs reprises et si la souris démontre une désaccoutumance lorsqu’elle est confrontée à une nouvelle odeur. Étant donné que de nombreux tests de comportement social mesurent la réponse de l’animal de laboratoire à une souris familière ou nouvelle, les faux positifs peuvent être évités en établissant que les animaux peuvent détecter et discriminer les odeurs sociales. Il existe des considérations similaires dans les tests d’apprentissage, tels que le conditionnement de la peur qui utilisent l’odeur pour créer un nouvel environnement ou des indices olfactifs comme stimulus associatif. Les déficits du système olfactif nuiraient à la capacité de distinguer les contextes et de former une association avec un signal olfactif pendant le conditionnement de la peur.
Dans le test d’habitation/déshabituation des odeurs, la souris est présentée à plusieurs reprises avec plusieurs odeurs. Chaque odeur est présentée trois fois pendant deux minutes. L’enquêteur enregistre le temps de reniflement dirigé vers l’odeur comme mesure de la réactivité olfactive. Une souris typique montre une diminution de la réponse à l’odeur au cours de présentations répétées (habituation). L’expérimentateur présente alors une nouvelle odeur qui suscite une augmentation du reniflement vers la nouvelle odeur (déshabituation). Après la présentation répétée de la nouvelle odeur, l’animal montre à nouveau une accoutumance. Ce protocole implique la présentation de l’eau, de deux odeurs non sociales ou plus et de deux odeurs sociales. En plus de réduire les facteurs de confusion expérimentaux, ce test peut fournir des informations sur la fonction des systèmes olfactifs de nouvelles lignées de souris knock-out, knock-in et conditional knockout.
Introduction
Les souris sont dépendants de l'olfaction pour naviguer nouveaux environnements, trouver de la nourriture, pour reconnaître d'autres personnes, et le comportement sexuel 1-3. Il est essentiel que les enquêteurs d'établir si oui ou non les animaux de laboratoire ont un sens de l'odorat de fonctionnement avant d'administrer des tests de comportement qui impliquent la nourriture, l'interaction sociale, ou les odeurs destinés à obtenir une réponse de la souris. Anosmie ou de l'impossibilité de faire la distinction entre les différentes odeurs, peut entraîner des faux positifs ou négatifs dans une grande variété de paradigmes comportementaux, donc la capacité d'une souris pour détecter et distinguer les odeurs devraient être établis avant d'autres types de tests comportementaux sont effectuées.
Le test habituation / de déshabituation olfactive a été décrite pour la première dans les années 1980 4. Le test a été conçu pour être utilisé chez la souris par les Drs. Mu Yang et Jacqueline Crawley 5. Ceci est un test simple et peu coûteuse qui permet à l'enquêteur de l'ESTAblish qu'une souris peut détecter et différencier les odeurs. En plus de tester l'olfaction, ce test permet à l'enquêteur d'observer le comportement général de la souris et doit être fait au début d'un programme de tests. Les observations qualitatives concernant la locomotion de la souris, des signes d'anxiété, niveau d'activité, et la réponse aux odeurs sociaux contre les odeurs de nourriture peuvent signaler de nouveaux domaines dans lesquels des tests pourrait être effectuée.
Dans cet essai, des cotons-tiges trempés dans diverses odeurs sont présentés à une souris à trois reprises dans une rangée. Avec chaque présentation répétée d'une odeur, la souris sera habituer à le coton-tige, en dépensant moins de temps à étudier avec chaque présentation ultérieure. Quand une nouvelle odeur est présenté, déshabituation se produit, et une souris typique passer plus de temps à enquêter sur l'écouvillon, indiquant qu'il peut distinguer les odeurs actuels et antérieurs 5. Ce test est administré à une souris à la fois et comprend un 45 min acclimation période de suivi de 45 min de l'essai.
Bien que ce test est facile à réaliser, il peut être utilisé pour étudier les questions complexes sur le système olfactif de la souris. D'autres tests populaires de l'olfaction, tels que le test de la nourriture enfouie, établissent simplement la présence ou l'absence d'anosmie. Toutefois, le critère de discrimination et d'accoutumance olfactive permet à l'enquêteur de déterminer qu'une souris a non seulement la capacité de détecter les odeurs mais peut discriminer entre les différentes odeurs. Le motif de l'habituation et déshabituation a été utilisé pour établir que les nouveaux mutants peuvent discriminer entre 6,7 odeurs. Dans une étude surprenante, Fadool et ses collègues ont utilisé des mélanges complexes d'odeurs pour montrer que les souris avec délétion du gène ciblé du canal Kv1.3 sont «super smellers» qui peuvent discriminer les odeurs très similaires mieux que les souris normales 8.
Lors de l'examen d'un nouveau modèle de souris knock-out il est utile de Establish la présence d'un comportement normal pour les tâches sensorielles de base. Quand cela est fait au début d'un programme de tests, la discrimination fondée sur l'odeur et le test d'habituation donne un enquêteur l'occasion d'observer des comportements inhabituels. Ces observations pourraient éviter des résultats positifs ou faussement négatifs dans des essais ultérieurs qui sont attribuables à confondre caractéristiques du mutant. Comme les chercheurs continuent d'enquêter sur le comportement social la nécessité de vérifier la fonction olfactive de base devient de plus en plus importante. En plus d'examiner l'olfaction en lignées mutantes, ce test peut être utilisé pour répondre à des questions spécifiques telles que si un traitement pharmacologique augmente spécifiquement la réponse d'un animal à des stimuli sociaux ou d'odeurs si leur réponse augmente à tous les stimuli d'odeurs.
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Protocole
Les souris mâles adultes utilisés dans l'expérience suivante ont été générées et logés à l'Université Baylor à une température ambiante de 22 ° C, avec une lumière de 14 h et 10 h foncé (20:00-06h00 h) cycle diurne. Les souris ont reçu un accès ad libitum à la nourriture et de l'eau. Toutes les procédures aux souris étaient en conformité avec les Instituts nationaux de la santé Lignes directrices pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et le protocole des animaux a été approuvé par l'Université Baylor de protection des animaux et l'utilisation Comité. Les souris ont été testés en fin de matinée / début d'après midi. Pour toutes les procédures ci-dessous l'enquêteur doivent porter des gants pour éliminer les odeurs et éviter la contamination.
1. Préparation des odeurs non-sociaux
- Préparer les odeurs non-sociaux fraîches chaque jour de test.
Note: L'enquêteur doit utiliser des gants pour préparer les odeurs.- Remplissez 3 tubes de centrifugation avec 10 ml d'eau chacun.
- Pipette 100 pi d'extrait de banane dans un 15 ml & #160; tube conique et 100 ul de l'extrait d'amande dans un deuxième tube conique de 15 ml d'une dilution à 1: 100.
Remarque: Le troisième tube de 15 ml ne contenir de l'eau.
2. Préparation des odeurs sociaux
- Préparer les odeurs fraîches sociaux sur les essais du matin se produira. Obtenir odeurs sociaux de deux cages qui ne l'ont pas été nettoyés pendant au moins trois jours et contenir un nombre égal de souris. Obtenir odeurs sociaux de souris du même sexe que le sujet de test.
Note: Ce sont pour être stocké à température ambiante et doivent être utilisées dans 4-6 heures pour maintenir l'odeur forte et cohérente.- Déterminer combien odeur sociale des cotons-tiges doivent être créés: chaque souris testée sera présenté avec trois tampons des odeurs sociale 1, et trois des odeurs sociale 2.
- Préparer odeurs sociaux en essuyant un coton-tige en zigzag à travers le fond d'une cage sale. Secouez toute la literie excès accroché à la pointe.
- tampons de magasins dans de grandes jarres en verre à couvercle ou dans des béchers couverts avec du parafilm. Désigner un conteneur pour l'odeur sociale 1 et un second pour l'odeur sociale 2.
- Maintenir cages de source des odeurs à l'extérieur de la salle d'essais expérimentaux.
3. acclimatation de la souris test
- Mettez des gants et peser la souris pour être testé et placer individuellement dans une cage propre avec un couvercle métallique sur le dessus et la bouteille d'eau éliminée.
- Laisser la souris pour acclimater à la nouvelle cage pendant 45 min dans une autre pièce que la salle d'examen. Assurez-vous qu'il n'y a pas d'odeurs inhabituelles ou des bruits dans la chambre.
- Comme test prend environ 45 min, décaler les temps d'acclimatation en mettant la prochaine souris pour être testé dans une cage propre pour acclimater droit avant de tester la souris actuelle.
4. Préparation de la salle d'essai
- Placez écouvillons frais de coton, ruban de laboratoire, les flacons contenant des tampons d'odeur sociaux, les tubes de nsur-sociale odeurs, une micro-pipette, deux minuteurs, et une bouteille de déchets avec un couvercle dans la salle d'examen.
- Assurez-vous que la salle de test est raisonnablement exempts d'odeurs, les bruits forts, et la lumière vive. Ne pas porter de Cologne ou lotions parfumées.
Remarque: L'observateur ne devrait pas être le chewing-gum ou des bonbons pendant la période d'essai et doit essayer de limiter leur exposition à des aliments de forte odeur.
5. Procédure de test
- Apportez la souris acclimatés dans sa cage dans la salle d'examen et de placer la cage sur le comptoir à une hauteur qui est confortable pour la visualisation en position assise.
- Présenter chaque odeur 3 fois de suite pendant 2 minutes à chaque fois. Utilisez l'ordre de présentation qui peut être trouvé dans le tableau 1.
- Pipette 50 ul de substance odorante dans le parfum à tester à la pointe de la coton-tige et re-cap de la source de l'odeur. Soulevez le haut du fil de la cage et insérez l'extrémité non parfumé, de bois de la tige dans l'ouverture de la bouteille d'eau, Pushing à travers la longueur de la face inférieure de la toile vers le haut. Évitez de toucher le bout de coton pour quoi que ce soit, y compris les doigts, de sorte que la contamination des odeurs est évitée.
- Continuer à tirer la tige à travers l'ouverture de la bouteille d'eau jusqu'à environ 1 pouce de l'extrémité de coton pend dans la cage. Apposer la fin de l'écouvillon en bois sur le côté de la cage en utilisant du ruban de laboratoire.
Remarque: Veillez à ne pas laisser le couvercle retombe sur la cage, causant un bruit fort qui perturberait la souris de test. - Commencer immédiatement moment pendant 2 min. Utilisez une minuterie pour chronométrer la présentation de 2 min. Noter le temps cumulé passé renifler l'odeur pendant le procès de 2 min. Comptez le comportement de reniflement de l'animal à l'aide d'un chronomètre séparé. Sniffing active est définie lorsque le nez de l'animal est orientée vers la pointe de coton avec son nez ~ 2 cm ou plus près de la pointe.
- Après l'achèvement de chaque essai, soulevez le couvercle de fil et enlever le coton-tige en le tirant vers le bas par l'ONUderside du couvercle (ce qui évite la contamination des odeurs en empêchant la pointe de coton de toucher le fil). Sceller le tampon utilisé dans un 500 de la bouteille de déchets.
- Préparer et insérez le suivant écouvillon et commencez à chronométrer. Laissez environ 1 min entre chaque intervalle entre les essais. Continuer jusqu'à ce que chaque parfum a été présenté trois fois de suite, pendant 2 minutes à chaque fois.
- Une fois que la souris a terminé tous les essais, vider la bouteille de déchets contenant des tampons de coton utilisés dans une poubelle à l'extérieur de la salle d'essai. Retour de la souris à sa cage.
6. Analyse
- Analyser les données pour chaque groupe par condition de l'odeur en utilisant ANOVA à deux voies suivie par Newman-Keuls ou un test similaire post hoc pour déterminer accoutumance importante (moins de temps renifler successives mêmes odeurs), et dishabitutation (plus de temps reniflant une odeur de neuf).
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Résultats
Suivant le protocole décrit, les résultats ont été enregistrés à l'aide de dix adultes (de jour postnatal 90-120) mâles C57BL / 6J et huit hommes FVB souche mixte fond (jour postnatal 50-70). Le test a été effectué par un seul enquêteur sur plusieurs jours. Chaque point sur les graphiques représente le temps moyen passé enquête une odeur.
Lorsque le coton-tige trempé dans de l'eau est d'abord introduit, les souris passent beaucoup de temps à étudier ce roman objet (Figure...
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Discussion
Les résultats fournis dans le présent document sont optimales pour les souris. Les souris démontrent une réponse forte à un roman odeur, puis habituent rapidement. Une des étapes clés de cette méthode est la préparation des odeurs. L'enquêteur doit prendre grand soin d'isoler les odeurs un de l'autre pour éviter la contamination. Un autre aspect important est la présentation du coton-tige. L'enquêteur doit résoudre le meilleur emplacement de la pointe de coton de sorte que la souris peut enquêter sur la ...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail est soutenu par une subvention du Conseil de recherche de l’Université Baylor et par une subvention de recherche de la Fondation pour l’épilepsie.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Cage à souris | Allentown | Cage | |
| Couvercle en fil métallique | Allentown | BCU Souris WBL 2500 | |
| Literie | Harlan | 7090 Sani-Chips | |
| VWR | 89031-270 | Manche en bois 6" | |
| Extrait de banane | McCormick | ||
| Extrait d’amande | McCormick | ||
| Ruban de laboratoire | VWR | 89098-062 | |
| Chronomètre | VWR | 62374-000 | |
| Gants en nitrile | VWR | 82026 | |
| Dispositif de chronométrage | VWR | 61161-350 | |
| Tubes coniques de 15 ml | VWR | 89003-294 | |
| Béchers de 2 L. | Pyrex | 1003 | |
| Parafilm | Parafilm | PM-992 | 4" x 250' |
| Bouteille de 1 L avec bouchon | VWR | 89000-240 |
Références
- Doty, R. L. Odor-guided behavior in mammals. Experientia. 42, 257-271 (1986).
- Restrepo, D., Arellano, J., Oliva, A. M., Schaefer, M. L., Lin, W. Emerging views on the distinct but related roles of the main and accessory olfactory systems in responsiveness to chemosensory signals in mice. Horm Behav. 46, 247-256 (2004).
- Keverne, E. B. Importance of olfactory and vomeronasal systems for male sexual function. Physiol Behav. 83, 177-187 (2004).
- Gregg, B., Thiessen, D. D. A simple method of olfactory discrimination of urines for the Mongolian gerbil, Meriones unguiculatus. Physiol Behav. 26, 1133-1136 (1981).
- Yang, M., Crawley, J. N. Simple behavioral assessment of mouse olfaction. Curr Protoc Neurosci. Chapter 8 (Unit 8 24), (2009).
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Réimpressions et autorisations
