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Article de méthode

Dérivation des cardiomyocytes hautement purifiée de anthropiques cellules souches pluripotentes en utilisant de petits différenciation de Molecule-modulé et ultérieur glucose famine

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DOI :

10.3791/52628

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18 mars 2015

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1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Institute of Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Cardiovascular Medicine Division, Department of Medicine, Child Health Research Institute, Stanford University School of Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, nous décrivons un protocole robuste pour la dérivation des cardiomyocytes humains qui combine la différenciation cardiaque modulée par de petites molécules et la purification des cardiomyocytes médiée par la privation de glucose, permettant la production de cardiomyocytes purifiés à des fins de modélisation des maladies cardiovasculaires et de criblage de médicaments.

Résumé

Souches pluripotentes cardiomyocytes dérivés de cellules humaines induites (hiPSC-CMS) sont devenus une source de cellules important de remédier au manque de cardiomyocytes primaires disponibles pour les applications de recherche et de traduction de base. Pour différencier en cardiomyocytes hiPSCs, divers protocoles comprenant corps embryoïdes (EB) à base de la différenciation et de facteur de croissance induction ont été développés. Toutefois, ces protocoles sont inefficaces et très variables dans leur capacité à générer des cardiomyocytes purifiés. Récemment, un petit protocole utilisant la modulation en fonction de molécule-de la signalisation Wnt / β-caténine a été montré pour promouvoir la différenciation cardiaque avec une grande efficacité. Avec ce protocole, supérieure à 50% -60% de cellules différenciées sont des cardiomyocytes de troponine cardiaque positifs ont été observés de façon constante. Pour augmenter encore la pureté des cardiomyocytes, les cellules différenciées ont été soumises à la famine glucose pour éliminer spécifiquement non cardiomyocytes en fonction de la différence métaboliques entre les cardiomyocytes et les non-cardiomyocytes. En utilisant cette stratégie de sélection, nous avons constamment obtenu une augmentation de plus de 30% dans le rapport de cardiomyocytes à des non-cardiomyocytes dans une population de cellules différenciées. Ces cardiomyocytes hautement purifiés devraient améliorer la fiabilité des résultats de base iPSC humaine in vitro des études de modélisation des maladies et les essais de dépistage de drogue.

Introduction

Cardiomyocytes humains primaires sont difficiles à obtenir en raison de l'obligation pour les biopsies cardiaques invasifs, de la difficulté à dissocier les cellules simples, et parce que de mauvaise survie des cellules à long terme dans la culture. Compte tenu de ce manque de cardiomyocytes humains primaires, souches pluripotentes humaines induites cardiomyocytes dérivés de cellules spécifiques au patient (hiPSC-CM) la technologie a été considérée comme une source de cardiomyocytes alternative puissante pour la recherche fondamentale ainsi que des applications cliniques et translationnelles telles que la modélisation de la maladie et de drogues une découverte. Les premiers efforts dans la différenciation des cellules souches pluripotentes en cardiomyocytes employés protocoles de différenciation en utilisant des corps embryoïdes (EBS), mais cette méthode est inefficace dans les cardiomyocytes produisant parce que souvent moins de 25% des cellules dans une EB battent cardiomyocytes 2,3. Comparativement, un protocole de différenciation en fonction monocouche à l'aide des cytokines activine A et BMP4 affiche un rendement plus élevé que EBS, maisce protocole est encore relativement inefficace, nécessite des facteurs de croissance coûteux, et ne fonctionne que dans un nombre limité de lignées de cellules souches pluripotentes humaines 4. Récemment, un très efficace, le protocole de différenciation des cardiomyocytes base-monocouche hiPSC a été développé par la modulation de la signalisation Wnt / β-caténine 5. Ces hiPSC-CMS exprimer troponine T cardiaque et l'alpha actinine, deux protéines sarcomériques qui sont des marqueurs standard de 6 cardiomyocytes. Le protocole décrit ici est une adaptation de cette petite base de molécule, chargeur acellulaire, la différenciation monocouche méthode 5,7. Nous sommes en mesure d'obtenir des cardiomyocytes battant hiPSCs après 7-10 jours (figure 1). Cependant, suite à une différenciation des cardiomyocytes résultant dans 50% des cellules battant, immunocoloration constante montre l'existence d'une population de non-cardiomyocytes qui sont négatives pour les marqueurs spécifiques tels que des cardiomyocytes troponine T spécifiquement cardiaque et d'alpha-actinine. Pour fucomplémen cardiomyocytes purifier et d'éliminer les non-cardiomyocytes, des populations hétérogènes de cellules différenciées ont été soumises à la famine glucose en les traitant avec un milieu de culture de glucose extrêmement faible pendant plusieurs jours (figure 2). Ce traitement élimine sélectivement les non-cardiomyocytes en raison de la capacité des cardiomyocytes, mais pas non cardiomyocytes, à métaboliser le lactate comme source d'énergie primaire pour survivre dans un environnement faible taux de glucose 8. Après cette étape de purification, on observe une augmentation de 40% du rapport des cardiomyocytes de non-cardiomyocytes, (figure 3, figure 4) et ces cellules peuvent être utilisées pour aval analyse de l'expression génique, la modélisation de la maladie, et des essais de criblage de médicaments.

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Protocole

REMARQUE: les informations fournisseur pour tous les réactifs utilisés dans ce protocole a été indiqué dans le Tableau 1 et Liste des matériaux. Toutes les solutions et équipements entrant en contact avec les cellules doivent être stériles, et la technique aseptique doit être utilisée en conséquence. Effectuer toutes les incubations de culture dans un humidifié à 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur, sauf indication contraire. Dans ce protocole, tous les différenciations sont réalisées dans des plaques 6 puits, dans lequel les hiPSCs sont ensemencées. Suite à la différenciation et la purification, les cellules peuvent être dissociés et réétalées pour une utilisation en aval.

1. Préparation Matières

  1. Pour le moyen E8, préparer une solution de stock pour chaque composant du milieu (NaHCO 3, l'acide L-ascorbique 2-phosphate, sélénite de sodium, de la transferrine, de l'insuline, FGF2, TGFB1) et stocker les solutions à -20 ° C. Ajouter la quantité appropriée de solutions d'achat d'actions à la bouteille de DMEM / F12 et filtrer à stériliser. La solution concentration et la configuration de réaction pour les composantes du stock et support E8 peuvent être trouvés dans le tableau 1.
  2. Pour la solution de matrice extracellulaire, décongeler la matrice de membrane basale (fournis habituellement à 10 mg / ml) à 4 ° CO / N. Matrigel est couramment utilisé pour la culture de cellules souches pluripotentes parce que les cellules souches pluripotentes humaines peuvent bien adhérer à ce produit en utilisant l'alpha-6-bêta-1 intégrine 9. Une fois décongelé, assurez 2,25 mg (250 pi) échantillons sur la glace à l'aide de glace conseils et des tubes de pipette froid et stocker les aliquotes à -80 ° C.
    1. Lorsque préenduction plaques avec ECMS, décongeler et aliquoter la solution de la matrice extracellulaire (ECMS) sur la glace. Mélanger le CEEM et du milieu DMEM / F12 glacée dans un rapport de 1: 200 sur de la glace. Gardez au frais pour éviter la solidification prématurée ECMS.
  3. Pour le RPMI / B27 sans produit de l'insuline, ajouter 10 ml de B27 Minus insuline dans 500 ml de milieu RPMI.
  4. Pour le RPMI / B27 (avec l'insuline) moyen, ajoutez 10 ml de supplément de B27 (avec insulin) et 5 ml d'antibiotique Pen-strep dans 500 ml de milieu RPMI.
  5. Pour le moyen faible taux de glucose, ajouter 10 ml de supplément de B27 et 5 ml d'antibiotique Pen-streptocoque dans 500 ml de milieu RPMI sans glucose.
  6. Pour le support / de cryoconservation de congélation, mélanger sérum bovin foetal avec du diméthylsulfoxyde (DMSO) à un mélange 9: 1 rapport. Le milieu de congélation peut être stocké jusqu'à un mois à 4 ° C.
    REMARQUE: Tous les médias doivent être filtrés et stockés dans 4 ° C et utilisés dans deux semaines, sauf indication contraire. Tous les volumes de réactif / solution utilisée ci-dessous sont destinés à un seul puits dans une plaque à 6 puits, sauf indication contraire.

2. Pré-revêtement 6 puits Plaques avec ECMS

  1. Assurez ECMS en mélangeant sous-sol matrice de membrane (par exemple, Matrigel) avec les médias DMEM / F12 glacée dans un rapport de 1: 200, puis appliquer 2 ml d'ECMS fraîchement préparé dans chaque puits pour une plaque à 6 puits. Chaque puits dans une plaque à 6 puits recevra environ 90 mg ECMS.
  2. Incuber l'ECMS plaques recouvertes pendant 1 heure à 37 ° C. Immédiatement avant étalement des cellules, aspirer DMEM solution / F12 de chaque puits. Les plaques seront alors prêt à recevoir des cellules.

3. décongélation des surgelés hiPSCs

NOTE: Suivre de près cette procédure car elle peut conduire à la culture optimale et la différenciation en aval de hiPSCs dans hiPSC-CMS suivant le cycle gel / dégel.

  1. Décongelez un flacon de hiPSCs pour chaque puits d'une plaque à 6 puits. Préparer un tube de 15 ml conique avec 9 ml de milieu E8 froid avec inhibiteur de ROCK (10 M) pour chaque flacon. inhibiteur de ROCK améliore hiPSCs survie après cryoconservation 10. Conserver les flacons dans 37 ° C bain d'eau à dégeler les cellules jusqu'à une participation d'environ 5 mm de cristaux de glace de diamètre est à gauche.
  2. Pulvériser l'extérieur des flacons de 70% d'éthanol. Essuyez les flacons avec du papier de soie avant de les déplacer à la hotte laminaire stérile.
  3. Transférer les cellules dans le tube conique préparé. Rincer til flacon une fois avec 500 ul de milieu E8 et transférer le milieu contenant les cellules décongelées dans le même tube conique. Centrifugeuse à température ambiante pendant 4 min à 200 x g.
  4. Aspirer le surnageant après centrifugation et remettre en suspension doucement le culot de cellules avec 2 ml de milieu avec E8 inhibiteur de ROCK (10 uM). Transférer les cellules remises en suspension à un puits d'une plaque à 6 puits pré-revêtu d'ECMS.
  5. Remplacez le support avec le milieu E8 sans inhibiteur de ROCK après 24 h de culture. Les cellules doivent ont adhéré à cette époque.

4. Le repiquage du hiPSCs

  1. Typiquement, hiPSCs de passage après avoir atteint 75% -80% de confluence dans une plaque à 6 puits. Aspirer le milieu de culture. Laver rapidement les puits avec 1 ml de solution stérile, RT PBS. Aspirer PBS.
    1. Ajouter 500 pi de EDTA 0,5 mM ou une solution de détachement cellulaire 1x (par exemple, Accutase) et incuber pendant 1-7 min à température ambiante. Moment approprié pour EDTA incubation varie avec la ligne hiPSC. Attendez-vous à voir visibles curling or épaississement de colonies sur les bords, comme cela indique que la solution de EDTA ou de détachement cellulaire est prêt à être retiré.
  2. Aspirer la solution d'EDTA ou le détachement de la cellule. Ajouter 1 ml de milieu supplémenté avec E8 inhibiteur de ROCK 10 uM. Déplacer colonies hiPSC dans le puits par pipetage de haut en bas plusieurs fois et la pulvérisation de colonies avec une pipette P1000. Colonies doivent être divisées en 5-10 amas de cellules après l'achèvement.
  3. Transférer les colonies qui sont en suspension dans 1 ml de milieu avec E8 inhibiteur de ROCK dans un tube conique de 15 ml.
  4. Perturber les grands amas de cellules en petits bouquets dans le milieu E8. Ajouter un volume approprié de E8 support avec un inhibiteur de la suspension de cellules pour diluer les cellules. Le volume de support de dilution pour ajouter dépend de la densité cellulaire et le nombre de puits à ensemencer. Idéalement, un seul, 80% de confluence et de hiPSCs doit être dilué 1:12.
    1. Ajouter 11 ml de milieu E8 avec inhibiteur de ROCK aux 1 ml existants de CEll solution dans ladite 15 ml tube conique pour obtenir une dilution 1:12.
  5. En outre triturer les amas de cellules en petits fragments de cellules (environ 50 à 200 cellules dans chaque fragment est le meilleur). Évitez de trop trituration car cela réduit la survie des cellules.
  6. Aspirer ECMS des plaques pré-enduits et ajouter 2 ml de cellules remises en suspension dans chaque puits. Environ 100 000 cellules par puits d'une plaque à 6 puits est idéal. Objectif pour distribuer les cellules uniformément autour du puits afin d'éviter le regroupement des cellules dans le centre du puits.
  7. Après 24 heures de culture, remplacer le milieu avec un milieu E8 sans inhibiteur de ROCK. Changer le milieu de culture toutes les 24 heures jusqu'à ce que les cellules deviennent confluentes à 80%. Ensuite, les cellules sont prêtes à nouveau passage. Cela prend habituellement 3-6 jours entre les passages pour atteindre 80% de confluence.

5. hiPSCs de congélation

REMARQUE: suivre de près cette procédure car elle peut conduire à la culture optimale et la différenciation en aval de la hancheSC en hiPSC-CMS suivant le cycle gel / dégel.

  1. Étiqueter tubes cryogéniques avec le nom de lignée cellulaire, type de cellule, le nombre de passages, et la date de congélation. En règle générale, utiliser un flacon pour chaque puits d'une plaque à 6 puits. Préparer un tube conique de 15 ml remplie de 9 ml de milieu E8 avec inhibiteur de ROCK (10 M). Préparer le milieu de congélation avec 90% de FBS et 10% de DMSO, et maintenir le milieu à 4 ° C jusqu'au moment de servir.
  2. Aspirer le milieu de culture, ajouter 500 ul d'EDTA 0,5 mM ou une solution de détachement cellulaire 1x et incuber pendant 2-7 min à température ambiante. La durée de l'exposition de la solution d'EDTA ou détachement cellulaire varie de lignée cellulaire de la lignée cellulaire.
  3. Aspirer EDTA ou une solution de détachement cellulaire. Ajouter 1 ml de milieu E8.
  4. Déplacer colonies hiPSC dans le puits par pipetage de haut en bas et de la pulvérisation hors des colonies avec une pipette P1000. Colonies ne doivent pas être divisés en plus petits que 100 amas de cellules. Transférer les cellules en suspension dans le tube conique préparée contenant E8. Centrifugeuse à RT pendant 4 min à 200 x g.
  5. Aspirer le surnageant et ajouter 500 ul de milieu de congélation froid au culot. Reprendre le culot en pipetant une à deux fois. La survie des cellules est améliorée en gardant les cellules en grandes touffes.
  6. Transférer les cellules remises en suspension dans un tube cryogénique marqué. Déplacer rapidement les flacons dans un récipient contenant de l'isopropanol congélation, ce qui permettra un refroidissement progressif. Conserver le récipient avec des cellules à -80 ° C pendant 24 heures, puis de transférer les cellules à l'azote liquide pour le stockage à long terme.

6. cardiaque Différenciation des iPSC humaines

REMARQUE: Tous les médias devraient être au moins à la température ambiante lorsqu'il est ajouté.

  1. Après dissociation avec une solution d'EDTA ou 1x détachement cellulaire, ensemencer environ 100 000 iPSCs humaines sur CEEM revêtues de plaques de culture à 6 puits de différenciation (mêmes étapes que les procédures de passages des cellules). Lorsque les cellules atteignent 85% de confluence, changer de support de RPMI / B27 sans milieu de l'insuline avec 6inhibiteur de GSK3-bêta uM CHIR99021 (CHIR) et maintenir pendant 48 heures.
  2. Après 48 heures, remplacer le milieu de culture contenant avec CHIR-RPMI / B27 sans milieu de l'insuline et laisser seul pendant 24 heures (jusqu'à ce jour 3).
  3. Au jour 3, modifier le support RPMI / B27 sans insuline avec 5 uM Wnt inhibiteur IWR1 et maintenir pendant 48 heures (jusqu'à ce jour 5).
    REMARQUE: Wnt inhibition peut également être tenté d'utiliser d'autres composés à petites molécules, comme décrit dans des études antérieures 11. IWR1 a été sélectionné par rapport aux autres inhibiteurs de Wnt à petites molécules en raison de la gamme plus large dans laquelle il a été montré pour être efficace dans l'inhibition de la signalisation Wnt 11.
  4. Au jour 5, changer le milieu revenir à RPMI / B27 sans milieu de l'insuline et laisser reposer pendant 48 heures (jusqu'à ce jour 7).
  5. Au jour 7, remplacer le milieu par du milieu RPMI / B27 (à l'insuline) et remplacer milieu tous les 3 jours par la suite avec le même milieu. Battements spontanés des cardiomyocytes doit d'abord être visible à environ 8 jours à jour10.

7. Purification de cardiomyocytes humaines par la famine Glucose

  1. Au jour 10 post-différenciation, changer le milieu dans chaque puits de la plaque de 6 puits à 2 ml de milieu faible taux de glucose et de maintenir les cellules dans ce milieu pendant trois jours (jusqu'à 13 jours).
  2. Au jour 13, retourner cellules milieu RPMI / B27 (avec l'insuline).
  3. Eventuellement, Réensemencement cardiomyocytes avant le second tour de privation de glucose pour aider à déloger les non-cardiomyocytes de la plaque de culture, ce qui facilite la dissociation des non-cardiomyocytes au cours privation de glucose.
    1. Au jour 13, moyen d'aspiration, laver une fois avec du PBS, et dissocier les cellules dans des cellules individuelles en utilisant 500 ul d'enzyme de dissociation de cellules pendant 5 min à 37 ° C. Plus précisément, après 5 min de traitement enzymatique, en utilisant une pipette de 1000 ul de dissocier manuellement cardiomyocytes à partir de la plaque à 6 puits en tirant de façon répétée jusqu'à l'enzyme de dissociation cellulaire et la pulvérisation contre la cardiomyocyte monocouche. Jusqu'à 30 répétitions de pipetage peut être nécessaire de dissocier les cardiomyocytes dans des cellules individuelles.
    2. Après que les cellules sont dissociées et se présentent sous forme de cellules isolées, de recueillir toutes les cellules dans un tube conique de 15 ml remplie de 5 ml de milieu RPMI / B27 de l'insuline à diluer à l'enzyme de dissociation des cellules et centrifugation pendant 4 min à 200 x g. Aspirer et jeter le surnageant.
    3. Re-suspendre les cellules avec un milieu RPMI 2 ml / B27 et la plaque sur une nouvelle plaque de 6 puits ECMS revêtu. Typiquement, confluence plus élevé de cardiomyocytes aide à la survie des cellules pendant les plaquant. Viser à Réensemencement 2 millions de cellules par nouveau plat à 6 puits pour la survie optimale pendant les plaquant.
  4. Au jour 14, changer le milieu revenir à 2 ml de milieu à faible glucose pour un deuxième cycle de la privation de glucose. Culture des cellules dans cet état faible taux de glucose pour trois jours de plus. La plupart des non-cardiomyocytes mourront dans cet état de la culture bas-glucose.
  5. Au jour 17, changer de support de 2 ml de RMoyenne PMI / B27 avec l'insuline. Les cellules restantes seront cardiomyocytes hautement purifiés. Ces cardiomyocytes peuvent être utilisés pour l'analyse de l'expression des gènes, le criblage de médicaments, l'analyse métabolique, et d'autres dosages en aval.

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Résultats

Les changements morphologiques cours de la différenciation hiPSC.

Le hiPSC cultivées dans des plaques sans cellules nourricières a grandi comme plates colonies, en deux dimensions. Après avoir atteint environ 85% de confluence, hiPSCs ont été traitées avec CHIR 6 pM pour la différenciation (figure 1A). Des quantités substantielles de la mort cellulaire, un phénomène normal et commun, ont été observés après 24 h de traitement CHIR. Après deux jours de traitem...

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Discussion

L'obtention d'une grande quantité de cardiomyocytes dérivés hiPSC hautement purifiée est critique pour la recherche de base cardiaque, ainsi que les applications cliniques et de la traduction. Les protocoles de différenciation cardiaque ont subi des améliorations considérables ces dernières années, les méthodes basées sur la transition de corps embryoïdes-utilisant croissance cardiogénique deux facteurs, à la matrice méthodes sandwich 12, et enfin à des méthodes basées monocouche petites mo...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent pas d’intérêts concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu en partie par le NIH/NHBI (U01 HL099776-5), le NIH Director’s New Innovator Award (DP2 OD004411-2), le California Institute of Regenerative Medicine (RB3-05129), l’American Heart Association (14GRNT18630016) et le Endowed Faculty Scholar Award de la Fondation Lucile Packard pour l’enfance et de l’Institut de recherche sur la santé infantile de Stanford (à SMW). Nous reconnaissons également le soutien financier de la bourse prédoctorale 13PRE15770000 de l’American Heart Association et du programme de bourses de recherche supérieure DGE-114747 (AS) de la National Science Foundation.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Matrigel (9-12 mg/ml)BD Biosciences354277
Média RPMIInvitrogen11835055
Média RPMI sans glucoseInvitrogen11879-020
B27 Moins InsulineInvitrogenA1895601
B27 Supplément (avec insuline)Invitrogen17504-044
Antibiotique Pen-streptocoqueInvitrogen15140122
Sérum fœtal bovinBenchMark100-106
DMSOSigmaD-2650
Inhibiteur de ROCK Y-27632EMD Millipore688000
CHIR99021Thermo Fisher508306
IWR1SigmaI0161
EDTAInvitrogen15575-020
AccutaseMilliporeSCR005
Élévateur de cellulesFisher08-100-240
CryovialFisher (tubes NUNC)375418
TrypLE Select EnzymeInvitrogen12563-011

Références

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Diff renciation des cardiomyocytesCSPi humainesmodulation par petites mol culescytom trie en fluxmicroscopie par immunofluorescenceinhibition de la signalisation Wnttroponine T cardiaqueanalyse de la puret cellulaireculture de cellules souches
Dérivation des cardiomyocytes hautement purifiée de anthropiques cellules souches pluripotentes en utilisant de petits différenciation de Molecule-modulé et ultérieur glucose famine
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