Synchronisation de<em&gt; Caulobacter crescentus</em&gt; Des enquêtes sur le cycle cellulaire bactérienne

Résumé

La synchronisation des cellules bactériennes est essentielle pour l’étude du cycle et du développement des cellules bactériennes. Caulobacter crescentus est synchronisable par centrifugation de densité, ce qui en fait un outil rapide et puissant pour l’étude du cycle cellulaire bactérien. Nous fournissons ici un protocole détaillé pour la synchronisation des cellules Caulobacter.

Résumé

Le cycle cellulaire est important pour la croissance, la réplication du génome et le développement dans toutes les cellules. Chez les bactéries, les études du cycle cellulaire se sont largement concentrées sur les cellules non synchronisées, ce qui rend difficile l’ordonnancement des événements temporels nécessaires à la progression du cycle cellulaire, à la réplication et à la division du génome. Caulobacter crescentus fournit un excellent système modèle pour le cycle cellulaire bactérien où les cellules peuvent être rapidement synchronisées dans un état G0 par centrifugation par densité. Des expériences de synchronisation du cycle cellulaire ont été utilisées pour établir les événements moléculaires régissant la réplication et la ségrégation des chromosomes, pour cartographier un réseau de régulation génétique contrôlant la progression du cycle cellulaire et pour identifier l’établissement de complexes de signalisation polaire nécessaires à la division cellulaire asymétrique. Nous fournissons ici un protocole détaillé pour la synchronisation rapide des cellules Caulobacter NA1000. La synchronisation peut être effectuée dans un format à grande échelle pour le profilage de l’expression génique et les tests par transfert Western, ainsi que dans un format à petite échelle pour les tests de microscopie ou FACS. La synchronisabilité rapide et les rendements cellulaires élevés de Caulobacter font de cet organisme un système modèle puissant pour l’étude du cycle cellulaire bactérien.

Introduction

Le cycle cellulaire bactérienne contrôle à la fois la replication du génome et la division des cellules filles. Surtout, comme la résistance aux antibiotiques est une menace croissante pour la santé publique, le cycle cellulaire bactérienne présente une cible inexploitée pour le développement antibiotique.

Dans la bactérie Caulobacter crescentus, chaque cycle cellulaire conduit à une division asymétrique, pour donner deux cellules filles des différentes sorts (figure 1A) ^1,2. Une cellule fille hérite un flagelle et mobiles tandis que l'autre fille hérite d'une tige et est sessiles. Circuit inté....

Protocole

1. Synchrony à grande échelle - Optimal pour Western Blot, puces à ADN / ARN-Seq, et d'autres essais intensifs Matériel

1. De un congélateur actions ou une plaque, cultiver un 5 ml O / N de la culture de la souche NA1000 en secouant à 28 ° C dans un milieu PYE.
2. Inoculer 0,5 ml des cellules de l'étape 1 dans 25 ml de M2G (tableaux 1-2) et agiter à 28 ° C jusqu'à ce que la culture atteint une DO ₆₀₀ entre 0,5 et 0,6.
3. Ensemencer les cellules dans 1 L de M2G et agiter à 28 ° C.
4. Une fois _DO600 atteigne 0,5 à 0,6, de confirmer la présence de cellules en utilisant swarmer liquide monté microscopie de ph....

Résultats

Synchronisation donne typiquement deux bandes de cellules (figure 1b): la bande de swarmer, qui a une densité plus élevée, et un / predivisional bande cellulaire pétiole de densité inférieure. Pour assurer des contrôles communs de synchronisation efficace comprennent la surveillance de l'OD ₆₀₀ et de mesurer les niveaux de protéines CTRA par western blot à des moments du cycle cellulaire distincts. La DO ₆₀₀ devrait augmenter d'environ deux fois au cours du cycle cellulaire.......

Discussion

Le cycle cellulaire bactérien est un processus fondamental de la vie et est important pour l’étude de la croissance et comme cible pour les antibiotiques de prochaine génération. Ici, nous avons détaillé les procédures de synchronisation rapide de C. crescentus NA1000, un organisme modèle pour l’étude du cycle cellulaire bactérien et de la division cellulaire asymétrique. Cette méthode peut être modifiée par transfert Western, par profilage d’expression génique et par microscopie à fluorescence pour étudier la .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Silice colloïdale revêtue de PVP (Percoll)	Sigma-Aldrich	P4937
Silice colloïdale (Ludox AS-40)	Sigma-Aldrich	420840
JA10 Rotor	Beckman-Coulter	369687
JA20 Rotor	Beckman-Coulter	334831
Sulfate ferreux Chelate Solution	Sigma-Aldrich	F0518
30 ml Tubes à centrifuger	Corning	8445
Na2HPO4	EMD	SX0720-1
KH2PO4	VWR	BDH9268-500G
NH4Cl	Amresco	0621-500g