Synchronisation de Caulobacter crescentus Des enquêtes sur le cycle cellulaire bactérienne

Résumé

La synchronisation des cellules bactériennes est essentielle pour l’étude du cycle et du développement des cellules bactériennes. Caulobacter crescentus est synchronisable par centrifugation de densité, ce qui en fait un outil rapide et puissant pour l’étude du cycle cellulaire bactérien. Nous fournissons ici un protocole détaillé pour la synchronisation des cellules Caulobacter.

Résumé

Le cycle cellulaire est important pour la croissance, la réplication du génome et le développement dans toutes les cellules. Chez les bactéries, les études du cycle cellulaire se sont largement concentrées sur les cellules non synchronisées, ce qui rend difficile l’ordonnancement des événements temporels nécessaires à la progression du cycle cellulaire, à la réplication et à la division du génome. Caulobacter crescentus fournit un excellent système modèle pour le cycle cellulaire bactérien où les cellules peuvent être rapidement synchronisées dans un état G0 par centrifugation par densité. Des expériences de synchronisation du cycle cellulaire ont été utilisées pour établir les événements moléculaires régissant la réplication et la ségrégation des chromosomes, pour cartographier un réseau de régulation génétique contrôlant la progression du cycle cellulaire et pour identifier l’établissement de complexes de signalisation polaire nécessaires à la division cellulaire asymétrique. Nous fournissons ici un protocole détaillé pour la synchronisation rapide des cellules Caulobacter NA1000. La synchronisation peut être effectuée dans un format à grande échelle pour le profilage de l’expression génique et les tests par transfert Western, ainsi que dans un format à petite échelle pour les tests de microscopie ou FACS. La synchronisabilité rapide et les rendements cellulaires élevés de Caulobacter font de cet organisme un système modèle puissant pour l’étude du cycle cellulaire bactérien.

Introduction

Le cycle cellulaire bactérienne contrôle à la fois la replication du génome et la division des cellules filles. Surtout, comme la résistance aux antibiotiques est une menace croissante pour la santé publique, le cycle cellulaire bactérienne présente une cible inexploitée pour le développement antibiotique.

Dans la bactérie Caulobacter crescentus, chaque cycle cellulaire conduit à une division asymétrique, pour donner deux cellules filles des différentes sorts (figure 1A) ^1,2. Une cellule fille hérite un flagelle et mobiles tandis que l'autre fille hérite d'une tige et est sessiles. Circuit intégré génétique contrôle la progression du cycle cellulaire et sort de la cellule par régulation de la transcription, phospho-signalisation, et la protéolyse régulée ^3. En outre, la réplication chromosomique des cellules filles et de rendement de la séparation simultanées qui contiennent exactement une copie du chromosome ^4. Fait important, ces deux types de cellules peuvent être séparés rapidement par colloL'Idéal particule de silice densité centrifugation dans la souche synchronisable NA1000 ^7.5 permettant l'isolement des cellules swarmer du reste de la population avec des rendements élevés (figure 1B). Isolé swarmer cellules alors procéder de manière synchrone par division cellulaire asymétrique. Ici, nous détaillons le protocole utilisé pour synchroniser Caulobacter souche NA1000. Nous fournissons des protocoles et des conseils de dépannage communes pour deux petite et à grande échelle des synchronisations. Cette procédure expérimentale fournit un outil puissant pour interroger le contrôle spatio-temporelle du cycle cellulaire et Caulobacter destin cellulaire.

Protocole

1. Synchrony à grande échelle - Optimal pour Western Blot, puces à ADN / ARN-Seq, et d'autres essais intensifs Matériel

1. De un congélateur actions ou une plaque, cultiver un 5 ml O / N de la culture de la souche NA1000 en secouant à 28 ° C dans un milieu PYE.
2. Inoculer 0,5 ml des cellules de l'étape 1 dans 25 ml de M2G (tableaux 1-2) et agiter à 28 ° C jusqu'à ce que la culture atteint une DO ₆₀₀ entre 0,5 et 0,6.
3. Ensemencer les cellules dans 1 L de M2G et agiter à 28 ° C.
4. Une fois _DO600 atteigne 0,5 à 0,6, de confirmer la présence de cellules en utilisant swarmer liquide monté microscopie de phase. Spot 1 pi de cellules sur une lame de verre, couvrir avec une lamelle, et l'image par microscopie de phase. Confirmer la présence de cellules Grouillant en visualisant les cellules de natation rapidement dans la population.
5. Spin cellules pendant 15 min à 7 KXG à 4 ° C dans un rotor JA-10.
6. Jeter le surnageant et ajouter 180 ml de M2 ​​froide (tableaux 1-2) et res doucementuspend toutes les cellules en utilisant une pipette sérologique. Jeter cellules faiblement granulés; ce sont des cellules predivisional et harcelées.
7. Ajouter 60 ml de solution de silice colloïdale froide (ne oubliez pas de mélanger la suspension de silice colloïdale avant d'ajouter aux cellules) et bien mélanger la suspension cellulaire.
8. Verser la suspension de cellules dans 30 ml de huit tubes et centrifuger pendant 30 min à 6,4 KXG à 4 ° C dans un rotor JA-20.
   NOTE: Il faut voir deux bandes distinctes; la bande de swarmer est la bande inférieure tandis que les cellules traquées / predivisional sont dans la fourchette supérieure (figure 1B).
9. Aspirer soigneusement la bande supérieure et enlever le liquide à ~ 1 cm au-dessus de la bande de swarmer (la bande inférieure).
10. (Critique) aide d'une pipette Pasteur, retirez soigneusement la bande de swarmer et la placer dans un tube propre. Pour laver la silice colloïdale, en haut du tube hors M2 avec froid et essorage pendant 10 min à 6,4 KXG à 4 ° C dans un rotor JA-20.
11. Eliminer délicatement le surnageant et remettre en suspension leles cellules dans 20 ml de M2 ​​froid et centrifugation pendant 10 min à 6,4 KXG à 4 ° C dans un rotor JA-20.
12. La suspension de toutes les pastilles dans 30 ml de M2 froid et mesurer l'OD ₆₀₀ en utilisant un spectrophotomètre et vierge à l'aide du milieu M2 froid. Enregistrer 1 pl pour l'imagerie de phase pour vérifier swarmer cellules; 90-95% des cellules doit être swarmers.
13. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 6,4 KXG à 4 ° C dans un rotor JA-20. Resuspendre les cellules dans 28 ° C M2G moyenne de sorte que le A ₆₀₀ est ~ 0,3 à 0,4 et commencer agitation à 28 ° C.
    NOTE: Les rendements typiques sont entre 30 et 60 ml de swarmer culture cellulaire à partir de cellules non synchronisées 1L.
14. Commencez à prendre des points de temps (la culture de type sauvage prendra environ 135-140 minutes de diviser) ^8,9. A chaque point de temps, de mesurer la DO _600. Vérifiez que la DO ₆₀₀ après la division est d'environ 2X la DO initiale _600.
15. Pour blot ou expression génique essais occidentaux, retirez aliquotes de 1 ml de la culture aux points de temps désirés, ralentit à la vitesse max dans une centrifugeuse de table pendant 30 sec, rapidement décanter ou aspirer le milieu, et le flash geler le culot cellulaire dans l'azote liquide. Stocker les cellules à -80 ° C jusqu'à l'analyse en aval.

2. Synchrony à petite échelle - Optimal pour Microscopie

1. De un congélateur actions ou une plaque, grandir à 5 ml O / N secouant la culture à 28 ° C dans M2G.
2. Diluer dans 15 ml de M2G (tableaux 1-2) et de croître jusqu'à la mi-log _(DO600 = 0,5-0,6).
3. Spin à 6,4 KXG pendant 10 min à 4 ° C dans un rotor JA-20, et de remettre en suspension dans 1 ml froides M2 (tableaux 1-2) et transférer dans un tube à centrifuger de 2 ml.
4. Centrifuger à 15 KXG pendant 3 min dans un tube de microcentrifugeuse pour sédimenter les cellules, aspirer le surnageant, le culot a mis sur de la glace, et remettre en suspension dans 900 ul de M2 ​​froid.
5. Ajouter 900 pi de PVP froid revêtu silice colloïdale et de spin pendant 20 min à 15 KXG à 4 ° C dans un microTube rocentrifuge.
6. (Critique) Aspirer ou une pipette du haut traqué / predivisional bande de cellules et de recueillir le fond swarmer bande dans un nouveau tube.
7. Laver les cellules deux fois swarmer dans 1 ml de M2 ​​froid tout en centrifugeant à 15 KXG pendant 3 min.
8. Avant l'essorage final, déplacer les cellules dans un 1 ml tube à essai en verre pré-réfrigérés et mesurer la DO ₆₀₀ de cellules par rapport à une ébauche de M2.
9. Reprendre le culot cellulaire final dans 28 ° C M2G à une DO entre 0,3 à 0,4 et secouez cellules / roll à 28 ° C.
   REMARQUE: Les rendements typiques sont comprises entre 2 et 4 ml de culture de cellules swarmer.
10. Pour les expériences de microscopie, au souhaitée points temporels lieu 1 pi de cellules sur un tampon agarose M2G pour l'imagerie.

Résultats

Synchronisation donne typiquement deux bandes de cellules (figure 1b): la bande de swarmer, qui a une densité plus élevée, et un / predivisional bande cellulaire pétiole de densité inférieure. Pour assurer des contrôles communs de synchronisation efficace comprennent la surveillance de l'OD ₆₀₀ et de mesurer les niveaux de protéines CTRA par western blot à des moments du cycle cellulaire distincts. La DO ₆₀₀ devrait augmenter d'environ deux fois au cours du cycle cellulaire

Discussion

Le cycle cellulaire bactérien est un processus fondamental de la vie et est important pour l’étude de la croissance et comme cible pour les antibiotiques de prochaine génération. Ici, nous avons détaillé les procédures de synchronisation rapide de C. crescentus NA1000, un organisme modèle pour l’étude du cycle cellulaire bactérien et de la division cellulaire asymétrique. Cette méthode peut être modifiée par transfert Western, par profilage d’expression génique et par microscopie à fluorescence pour étudier la ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Silice colloïdale revêtue de PVP (Percoll)	Sigma-Aldrich	P4937
Silice colloïdale (Ludox AS-40)	Sigma-Aldrich	420840
JA10 Rotor	Beckman-Coulter	369687
JA20 Rotor	Beckman-Coulter	334831
Sulfate ferreux Chelate Solution	Sigma-Aldrich	F0518
30 ml Tubes à centrifuger	Corning	8445
Na2HPO4	EMD	SX0720-1
KH2PO4	VWR	BDH9268-500G
NH4Cl	Amresco	0621-500g