Method Article

Une méthode simple et peu coûteuse pour déterminer Sensibilité au froid et adaptation chez la souris

DOI:

10.3791/52640

⸱

March 17th, 2015

 ,  ,  , 
1MSTP, Neuroscience Program, Washington University in St. Louis, 2Washington University Pain Center, Department of Anesthesiology, Washington University in St. Louis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le test plantaire à froid (CPA) mesure la réactivité au froid entre 30 °C et 5 °C, et peut également mesurer l’adaptation au froid. Ce protocole décrit comment utiliser la CPA pour mesurer l’hypersensibilité au froid, l’analgésie et l’adaptation chez la souris.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’hypersensibilité au froid est un problème clinique grave, affectant un large sous-ensemble de patients et entraînant une diminution significative de la qualité de vie. Le test plantaire à froid permet d’évaluer objectivement et à moindre coût la sensibilité au froid chez la souris, et peut quantifier à la fois l’analgésie et l’hypersensibilité. Les souris sont acclimatées sur une plaque de verre et une pastille de glace carbonique comprimée est maintenue contre la surface en verre sous la patte arrière. La latence de retrait du verre de refroidissement est utilisée comme mesure de la sensibilité au froid.

La sensation de froid est également importante pour la survie dans les régions où les températures sont saisonnières, et afin de maintenir la sensibilité, les animaux doivent être en mesure d’ajuster leurs seuils de réponse thermique pour correspondre à la température ambiante. Le Cold Plantar Assay (CPA) permet également d’étudier l’adaptation aux changements de température ambiante en testant la sensibilité au froid de souris à des températures allant de 30 °C à 5 °C. Les souris sont acclimatées comme décrit ci-dessus, mais la plaque de verre est refroidie à la température de départ souhaitée à l’aide de boîtes en aluminium (ou de sachets de papier d’aluminium) remplies d’eau chaude, de glace humide ou de glace sèche. La température de la plaque est mesurée au centre à l’aide d’une sonde thermocouple à filament de type T. Une fois que la plaque a atteint la température de départ souhaitée, les animaux sont testés comme décrit ci-dessus.

Ce test permet de tester des souris à des températures allant d’inoffensives à nocives. Le CPA produit des réponses comportementales non ambiguës et cohérentes chez les souris non blessées et peut être utilisé pour quantifier à la fois l’hypersensibilité et l’analgésie. Ce protocole décrit comment utiliser la CPA pour mesurer l’hypersensibilité au froid, l’analgésie et l’adaptation chez la souris.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mesure de la réactivité à froid chez les rongeurs est important pour améliorer la compréhension des mécanismes potentiels de sensibilité au froid chez les humains dans des conditions normales et pathologiques. The Cold plantaire Assay (CPA), développé à l'origine il ya plusieurs années une, est conçu pour générer des réponses claires murins comportement reproductibles à un stimulus froid amené à RT. Améliorations plus récentes de cet essai ont permis la mesure reproductible de sensibilité au froid à une large gamme de températures 2. Les deux versions sont également conçus pour être relativement à haut débit, et peu coûteux à utiliser.

A beaucoup de progrès ont été réalisés dans la compréhension des mécanismes de sensibilité au froid en utilisant d'autres méthodes comportementales. Un procédé est le test de l'évaporation de l'acétone, ce qui implique tamponnant ou en pulvérisant de l'acétone sur la patte de la souris et en mesurant la quantité de temps que la souris consacre effleurant la patte de 3,4. Malheureusement,les réponses à l'acétone évaporation sont confondus par la sensation d'humidité et l'odeur de l'acétone. En outre, le stimulus froid qui est appliquée dans le test d'évaporation de l'acétone peuvent varier en fonction de la quantité d'acétone appliqué, et est difficile à quantifier. Enfin, les souris non lésés ont des réponses minimales au niveau de référence à l'acétone, ce qui rend impossible la mesure de l'analgésie en l'absence d'une hypersensibilité à la présente méthode.

Un autre essai classique pour les réponses à froid est le test du Tail Flick, où la latence de retrait est mesuré après la queue est immergée dans 5,6 d'eau froide. Alors que les réponses comportementales dans cet essai sont sans ambiguïté et l'essai mesure les réponses à une température spécifique, les animaux doivent être retenus pendant les essais, qui peut altérer la réactivité à froid grâce à des mécanismes analgésiques induits par le stress bien décrits 7.

Un autre outil couramment utilisé est le test de la plaque froide, qui mesure le comportementles réponses des souris après leur mise sur une plaque refroidie par effet Peltier 10/08. Bien que cet outil fournit des informations sur les réponses des animaux à des températures spécifiques, il a également été utilisé d'une manière incompatible; différents groupes ont mesuré différents types de réponses, y compris nombre de sauts 8,11, la latence de la première réponse 8,11- 13, et le nombre de patte ascenseurs 11,13,14 avec des résultats très différents. Le dosage de la plaque froide est également relativement faible débit comme un seul animal peut être testée à la fois, et il nécessite un dispositif de Peltier coûteux et fragile.

Le test de préférence de la température de 2 plaques est un dérivé communément utilisé pour le test de la plaque froide qui mesure la quantité relative de temps que les animaux passent sur ​​deux plaques reliées à des températures différentes 9,15- 17. Un autre test couramment utilisé est le même dosage de gradient thermique, où la quantité de temps que les souris passent en différentes zones de températurecomprise entre 5 ° C et 45 ° C sur une plaque longue métallique 16 est mesurée. Bien que ces tests permettent de comparer les températures, il est difficile de savoir si le comportement représente l'aversion de la température ou à la préférence de température.

Enfin, l'analyse dynamique de plaque froide a été utilisé pour mesurer la souris répondent à l'évolution des températures ambiantes 18. Cette méthode consiste à placer des souris sur un dispositif à effet Peltier et RT rampe vers le bas à 1 ° C tout en mesurant combien les souris sautent ou lèchent les pattes de la plaque à des températures différentes. Bien que cette façon teste les souris se adapter à un environnement de refroidissement, il ne fournit pas un moyen pour tester la souris réagissent à un stimulus froid dans le cadre d'une température ambiante froide. En outre, il nécessite un équipement coûteux à réaliser et ne offre pas un moyen de souris se acclimater à l'équipement de test avant de mesurer leur sensibilité au froid.

Pour compléter ces essais, le CPA teste la ACCLIMATED réponses à un stimulus froid bien défini à une variété de gammes de température, ou pendant le processus d'adaptation à des températures ambiantes froides. Il peut tester jusqu'à 14 souris à la fois avec notre appareil actuel, avec le potentiel d'être économiquement plus grande échelle pour les tests à haut débit.

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Protocol

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Tous les protocoles de souris étaient conformes aux Instituts nationaux de la Santé et des lignes directrices ont été approuvées par le Comité des études animales de l'École de médecine de l'Université de Washington (St. Louis, MO).

1. Préparation de la plaque d'essais et boîtiers

  1. Nettoyer la surface du verre.
  2. Fixez la sonde filament thermocouple de type T à la surface dans le milieu de la plaque de verre avec du ruban de laboratoire.
  3. Placez les enclos des animaux sur la plaque de verre en une seule ligne le long du milieu de la plaque.
  4. Enfilez la sonde de thermocouple dans l'enceinte des animaux de centre et se brancher sur l'enregistreur de données. Mettez l'enregistreur de données sur tout en désactivant la fonction d'arrêt automatique, et joindre l'enregistreur de données à l'ordinateur avec le câble fourni.
    1. Si l'enregistrement de la température de la plaque lors de l'expérience, ouvrez le logiciel de l'enregistreur de données pour commencer l'enregistrement des températures de la plaque.
    2. Si nécessaire, ajuster le logiciel à nouveauCordon la température de la plaque une fois par seconde.
    3. Commencez températures en utilisant le logiciel fourni avec l'enregistreur de données thermique enregistrement.
  5. Séparer l'enceinte avec des inserts noirs pour empêcher l'interaction visuelle entre les souris.
  6. Reflète la position sous le verre de telle sorte que la face inférieure des enceintes est visible à partir d'une position assise confortable.

2. réchauffement / refroidissement de la plaque de verre

  1. Remplissez les boîtes en aluminium avec de l'eau chauffée, de la glace mouillée, ou de la glace sèche et les positionner de façon appropriée sur la plaque de verre (paquets de papier d'aluminium remplis de glace sèche peuvent également être utilisés pour refroidir le verre; Figure 1) 2.
    1. Pour les tests à 30 ° C, positionner les boîtes d'aluminium d'environ 0,25 '' loin des enclos des animaux (figure 2B) 2.
      1. Fixer un circulateur d'eau chauffée des deux côtés de la plaque de verre. Réglez le thermostat à 45 - 60 ° C, et nouse pour remplir les boîtes en aluminium avec un flux régulier de l'eau chaude (figure 1C) 2.
      2. Placez les circulateurs de telle sorte que l'eau chaude dans les boîtes en aluminium draine directement dans le réservoir du circulateur de chaque côté (figure 1C) 2.
    2. Pour les tests à température ambiante, laissez les cases vides (Figure 2) 2.
    3. Pour les tests à 17 ° C, positionner les boîtes d'environ 0,25 '' loin des enclos des animaux de chaque côté et remplir avec de la glace humide (Figure 2) 2.
    4. Pour les tests à 12 ° C, positionner les boîtes environ 1,25 '' loin des enceintes de chaque côté et remplir avec de la glace sèche (Figure 2) 2.
    5. Pour les tests à 5 ° C, positionner les boîtes d'environ 0,25 '' loin des enceintes de chaque côté et remplir avec de la glace sèche (Figure 2) 2.
      1. Lorsque le refroidissement du verre avec de la glace sèche, assurez-vous que la ventilation est suffisante pour empêcher l'accumulation de CO 2 dans la salle.
  2. Attendre que le verre pour atteindre la plage de température souhaitée.
  3. Ajouter les souris aux enceintes sur la plaque.
    NOTE: Un générateur de bruit blanc peut être utilisé pour diminuer les nuisances sonores.
  4. Attendez que la souris se acclimater.
    NOTE: Dans notre installation cela prend environ 2,5 heures, mais cela peut varier considérablement en fonction de logement des animaux et les conditions de manutention.
  5. Maintenir le verre à la plage de température souhaitée en se assurant que les boîtes sont toujours pleines d'eau chauffée, de la glace mouillée, ou de la glace sèche.
    NOTE: Avec notre appareil, les boîtes doivent être rempli avec de la glace à peu près toutes les 90 min.
    REMARQUE: Pour le C 17 ° état, il est utile de vider plupart de l'eau dans les boîtes en aluminium à travers les trous de drainage avant de le remplir avec de la glace. Ce sera de stabiliser la température mieux, et prdébordement de l'événement
    NOTE: Le montant exact de la glace sèche varie de façon saisonnière, mais en général, en gardant les boîtes plus de ¼ complètes sur toute la longueur de la boîte va garder la température constante.

3. Test de la souris à des températures fixes

  1. En dehors de la salle de comportement, remplissez un seau à glace à moitié plein de glace sèche.
  2. L'utilisation d'un marteau ou un maillet, écraser la glace sèche en une poudre fine.
    REMARQUE: Une surcharge du seau, il sera difficile d'écraser complètement la glace sèche en poudre.
  3. En utilisant une lame de rasoir ou des ciseaux, découpez le dessus une seringue de 3 ml.
  4. En utilisant une aiguille 21 G, percez trois trous sur les côtés opposés de la seringue (total de six trous).
    NOTE: Ces trous vont diminuer la pression générée par sublimation tout en comprimant la glace sèche. La seringue de coupure peut être réutilisée pour de multiples expériences.
  5. Prenez la seringue, la poudre de glace sèche, et un chronomètre portatif dans la salle de comportement.
  6. Remplir la chambre à moitié plein de poudre de glace sèche de la seringue. Maintenez l'extrémité de la seringue contre un objet plat de coupe, et de comprimer fermement la poudre en utilisant le piston. Faites attention; le piston de plastique peut tordre ou de casser de la pression. Si cela se produit, remplacer le piston d'une nouvelle seringue.
  7. Elargir la pointe de la pastille de glace carbonique comprimé delà du bord de la seringue.
  8. souris d'essai qui sont entièrement au repos.
    1. A 30 ° C, 23 ° C et 17 ° C, les souris d'essai qui ont tous les quatre pattes sur la vitre et ne bouge pas, mais pas complètement endormie 19.
    2. A 12 ° C et 5 ° C, les souris de test qui sont sur deux pattes ou quatre pattes et ne se déplaçant pas ou sauter.
  9. En utilisant les miroirs pour le ciblage, doucement mais appuyez fermement sur ​​le culot affleurant à plat contre la surface de verre sous la patte arrière de la souris (figure 1A) 2. Lancer la main-minuterie.
  10. Arrêter le chronomètre et enlever le culot lorsque la souris se éloigne du verre refroidi.
    NOTE: Le mouvement de retrait peut être verticale ou horizontale.
    1. Si la souris se déplace très brièvement la patte, puis il revient à la surface de refroidissement, continuera jusqu'à ce moment et en stimulant la souris fait un mouvement permanent de suite.
      NOTE: Notre laboratoire utilise un temps de relance maximum de 20 secondes pour les souris dans la majorité des cas.
  11. Répétez cette procédure de test jusqu'à ce qu'au moins trois valeurs sur chaque patte de chaque animal sont collectées. Des essais distincts essai pattes opposées sur la même souris par au moins 7 min et essais consécutifs séparés sur toute la patte unique d'au moins 15 min.
  12. Si nécessaire, utiliser différentes épaisseurs de verre pour générer différents taux de refroidissement (Figure 3) 1.
    REMARQUE: La vitesse de refroidissement est inversement corrélée à l'épaisseur du verre.

4. Test de la souris Pendant froide adaptation

NOTE: Ce est un autre protocole qui permet de tester le plat de verree refroidit, plutôt qu'une fois la plaque se est stabilisée et les souris ont totalement adaptée à l'environnement froid.

  1. Suivez les instructions figurant à la section 1 de mettre en place l'appareil.
  2. Suivez les instructions figurant à la section 3 de prendre les mesures de base à la température ambiante (figure 7A) 2.
  3. Pré-refroidir les boîtes en aluminium avec de la glace sèche.
  4. Une fois latences de retrait de base ont été mesurées, positionner les boîtes prérefroidis sur la plaque d'environ 1,25 '' loin des enceintes de chaque côté (figure 7A, flèche étiqueté «glace sèche ajouté") 2.
  5. Suivez les instructions figurant à la section 3 de prendre des mesures comme la plaque de verre refroidit, prendre des mesures aussi souvent que possible.

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Results

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Les réponses comportementales induites chez des souris à partir de 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C et 12 ° C sont très reproductible (figure 4A) 20. Afin de mesurer le stimulus froid étant généré sous la patte arrière, les souris ont été anesthésiés avec un kétamine / xylazine / acépromazine cocktails et leurs pattes ont été fixés sur le verre sur le dessus d'un thermocouple de type T filament (figure 4B) 20. Le verre est refroidi ou réchauffé à l'intervalle de test souhait...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le CPA peut être utilisé pour évaluer la sensibilité au froid et l’adaptation au froid chez la souris. Il s’agit d’un moyen abordable et efficace de mesurer les réponses au froid chez des animaux acclimatés et non retenus à une grande variété de plages de température. Il fournit également une réponse comportementale sans ambiguïté avec une variable de sortie facilement quantifiée et analysée. Il a déjà été utilisé pour évaluer les changements de sensibilité au froid induits par l’inflammation1, les lésions...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à révéler

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs tiennent à remercier l’ensemble du laboratoire Gereau pour la rédaction du manuscrit. Ce travail est soutenu par les fonds NINDS 1F31NS078852 à DSB et le fonds NINDS NS42595 RWG.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sonde thermocouple de type TPhysitempIT-24pUtilisée pour mesurer la température de surface du verre (http://www.physitemp.com/products/probesandwire/)
Plaqueverre Entreprise verrière locale (à St. Louis, Stemmerich Inc)Nous utilisons du verre pyrex (flotteur borosilicate). Notre laboratoire utilise généralement 1/4'', mais 3/16'' et 1/8'' sont également utiles
Enregistreur de données thermiquesExtechEA15Thermologger pour suivre la température du verre (http://www.extech.com/instruments/product.asp?catid=64&prodid=408)
Seringue de 3 mlBD309657Le haut est coupé et de la glace sèche est compressée dans la seringue pour générer une sonde froide
OrdinateurSi vous utilisez l’enregistreur Extech, n’importe quel Pcwill fonctionnera
Les boîtes en aluminiuml’atelier d’usinage de l’Université de Washington à St. Louis Il y a un trou de 1/2 '' percé dans un côté court de chaque boîte, près du bas. Ces trous sont remplis de robinets d’arrêt en caoutchouc lorsque les boîtes sont remplies de glace humide ou d’eau chaude.
Circulateur d’eau chaufféVWRTout modèle de circulateur d’eau avec pompe fonctionnera
Aiguille 21 GBD305165La taille exacte de l’aiguille n’a pas d’importance
Minuteriemain N’importe quelle minuterie à main fonctionnera
MiroirN’importe quel miroir plat fonctionnera
de de mesurent 3 pi de long, 4,5 po de large et 3 po de haut avec un couvercle scellé. à

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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