Électrorétinogramme Analyse de la réponse visuelle chez le poisson zèbre larves

Jared D. Chrispell; Tatiana I. Rebrik; Ellen R. Weiss

doi:10.3791/52662

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Article de méthode

Électrorétinogramme Analyse de la réponse visuelle chez le poisson zèbre larves

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DOI :

10.3791/52662

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16 mars 2015

Jared D. Chrispell¹ , Tatiana I. Rebrik² , Ellen R. Weiss¹

¹Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, ²Department of Ophthalmology, Duke University

Dans cet article

Résumé

Nous présentons une méthode pour l’analyse électrorétinographique (ERG) des larves de poisson-zèbre en utilisant des techniques de micromanipulation et d’électrorétinographie. Il s’agit d’une méthode simple et directe pour mesurer la fonction visuelle des larves de poisson-zèbre in vivo.

Résumé

L'électrorétinogramme (ERG) est une méthode non invasive électrophysiologique pour déterminer la fonction rétinienne. Grâce à la mise en place d'une électrode sur la surface de la cornée, l'activité électrique généré en réponse à la lumière peut être mesurée et utilisée pour évaluer l'activité des cellules rétiniennes in vivo. Ce manuscrit décrit l'utilisation de l'ERG pour mesurer la fonction visuelle chez le poisson zèbre. Poisson zèbre ont longtemps été utilisé comme un modèle pour le développement des vertébrés raison de la facilité de la suppression de gènes par des oligonucléotides morpholino et la manipulation pharmacologique. A 5-10 dpf, seuls les cônes sont fonctionnelles dans la rétine des larves. Par conséquent, le poisson zèbre, la différence d'autres animaux, est un puissant système modèle pour l'étude de la fonction visuelle cône in vivo. Ce protocole utilise l'anesthésie standard, micromanipulation et protocoles stéréomicroscopie qui sont communs dans les laboratoires qui effectuent des recherches de poisson zèbre. Les méthodes décrites font usage de l'équation d'électrophysiologie normeATION et une caméra basse lumière pour guider le placement du micro-électrodes d'enregistrement sur la cornée larvaire. Enfin, nous démontrons comment un ERG stimulateur / enregistreur disponible dans le commerce à l'origine conçu pour une utilisation avec des souris peut facilement être adapté pour une utilisation avec le poisson zèbre. ERG de poisson zèbre larves fournit une excellente méthode de dosage cône fonction visuelle chez les animaux qui ont été modifiés par injection d'oligonucléotides morpholino ainsi que des techniques d'ingénierie des génomes plus récents tels que Zinc Finger nucléases (ZFN), Transcription Activator-Like effecteur nucléases (TALENs), et cluster régulièrement espacées courtes répétitions palindromiques (CRISPR) / Cas9, qui ont tous fortement augmenté l'efficacité et l'efficacité du ciblage de gène chez le poisson zèbre. En outre, nous profitons de la capacité des agents pharmacologiques pour pénétrer larves de poisson zèbre pour évaluer les composants moléculaires qui contribuent à la photoréponse. Ce protocole décrit une configuration qui peut être modifié et utilisé par les chercheursavec différents objectifs expérimentaux.

Introduction

L'électrorétinogramme (ERG) est une méthode électrophysiologique non invasive qui a été largement utilisé en clinique pour déterminer la fonction de la rétine chez les humains. L'activité électrique en réponse à un stimulus lumineux est mesuré en plaçant des électrodes d'enregistrement sur la surface externe de la cornée. Les caractéristiques du modèle de stimulus et la forme d'onde de réponse définissent les neurones rétiniens qui contribuent à la réponse. Cette méthode a été adaptée pour une utilisation avec un certain nombre de modèles animaux, y compris les souris et le poisson zèbre. La réponse ERG vertébrés typique a quatre composantes principal....